一种人类斑秃相关基因突变筛查的组合引物及其应用的制作方法

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种人类斑秃相关基因突变筛查的组合引物及其应用。

背景技术：

斑秃是一种常见的非瘢痕性脱发性疾病,常发生于身体有毛发的部位，以局限性圆形脱发为特征。斑秃虽然不是严重致命疾病，但是会严重影响患者的心理状态和生活质量。斑秃的具体发病机制尚不明确，可能是遗传、环境、心理因素等众多因素影响的产物。目前，斑秃普遍被认为是由t淋巴细胞介导的针对毛囊器官的自身免疫性疾病，精神心理因素可能会加重病情或至病情反复。

斑秃在人群中的发病率约为1％～2％，男女发病率并无明显差别，约66％的患者在30岁前发病，仅20％的患者在40岁以后发病，其中约50％的患者会在祛除诱因后的一年内自愈。对斑秃的提早发现，并采用针对性的治疗，可避免发展成为慢性反复性疾病。

斑秃是一种多因素遗传性疾病。中国流行病学调查显示，8.4％的患者存在家族内发病，并且与患者的越亲近发病率越高。单卵双生斑秃发病一致率高达55％。丝聚合蛋白基因变异的特应性皮炎患者，存在合并重度斑秃的倾向。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，是人类可遗传变异中最常见的一种。snp在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万。数量庞大的snp位点与生命的多种进程都密切相关，尤其是在疾病的鉴定方面snp起着重大的作用。目前已经发现acoxl(rs12986962，rs3789129)，clec16a(rs3862469)，fam19a2(rs4348998)，fpr2(rs17834679)，gse1(rs7500151)，il13(rs848)，intergenic(rs10761660，rs1171582，rs2216164，rs247459，rs2781388，rs574087，rs6848139，rs7682481，rs9275524，rs972099)，irf4(rs6906608)，loc101928337(rs12348691)，lpp(rs9864529)，magi3(rs17031716)，pfkfb3(rs631902)，plxnc1(rs7299099)，rp11(rs2847266)，syt14(rs170557)，tnfrsf1a(rs1860545)等斑秃相关基因的26个snp位点。而目前针对这些基因位点多态性的研究主要是sanger测序法，该方法只能针对某一个样本的某一段区域进行检测，检测效率低，成本高。

基于此，本发明提供了一种人类斑秃相关基因突变筛查的组合引物及其应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测便捷、准确率高、经济实惠的斑秃相关突变基因位点的检测方法；通过多组基因引物对样品dna进行实时定量pcr扩增，并通过各位点的熔解曲线与标准熔解曲线相比较获取其基因型，最终通过各snp位点对斑秃的贡献系数计算出患病的比率。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

本发明的一个技术方案如下：

一种人类斑秃相关基因突变筛查的组合引物，所述组合引物包括针对人类斑秃在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr6、chr9、chr10、chr11、chr12、chr14、chr16、chr18、chr19染色体上的acoxl基因上的rs12986962和rs3789129位点，clec16a基因上的rs3862469位点，fam19a2基因上的rs4348998位点，fpr2基因上的rs17834679位点，gse1基因上的rs7500151位点，il13基因上的rs848位点，irf4基因上的rs6906608位点，loc101928337基因上的rs12348691位点，lpp基因上的rs9864529位点，magi3基因上的rs17031716位点，pfkfb3基因上的rs631902位点，plxnc1基因上的rs7299099位点，rp11基因上的rs2847266位点，syt14基因上的rs170557位点，tnfrsf1a基因上的rs1860545位点以及基因间的rs10761660、rs1171582、rs2216164、rs247459、rs2781388、rs574087、rs6848139、rs7682481、rs9275524、rs972099位点；所述组合引物包含了所有所选位点的正向引物和反向引物，如chr2染色体上rs12986962位点的引物包含了正向引物序列seqidno:1和反向引物序列seqidno:2，其它位点的引物序列详见引物序列表。

本发明的另一个技术方案是上述组合引物在制备人类斑秃相关基因突变筛查试剂盒中的应用。

所述人类斑秃相关基因突变筛查试剂盒包括上述组合引物和一组包含饱和染料的pcr反应mix，所述组合引物的序列如seqidno:1-52所示。

本发明的另一个技术方案是上述试剂盒在人类斑秃相关基因突变筛查中的应用。

上述试剂盒的应用方法包括以下步骤：

1)样品采集、dna提取和pcr扩增引物的设计：所述扩增引物设计为上述组合引物；

2)高分辨率溶解荧光定量pcr扩增上述组合引物：将步骤1)中不同的组合引物按照等比例混合，混合后作为一个的引物池，按照试剂盒要求配置反应体系，体系如下：

用此引物按照荧光定量pcr的方法进行扩增，扩增条件如下：95℃预变性10min；然后按95℃变性10s，65-55℃退火10s，每个循环下降0.5℃，72℃延伸30s的程序进行45个循环；扩增出的dna片段即为扩增文库；

3)步骤2)中的dna片段按照高分辨率熔解曲线法进行高分辨率溶解曲线过程，扩增产物的熔解步骤在pcr循环结束后立即进行，程序为：升温至95℃1min，然后降温至40℃1min，再升温至65℃1s，从65℃连续升温到95℃的过程中进行荧光收集，25次/℃，最后，降温至40℃。

所述组合引物为26对组合引物，所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度3度内，且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△g的绝对值小于5。

为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的术语“高分辨率熔解曲线法”，主要是指基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、gc含量、gc分布等是不同的，因此任何双链dna分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。高分辨率熔解曲线技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。

设计主要遵循：用软件进行比对，保证引物对之间的退火温度相差不大，最好在3度内。引物对与引物对之间形成的引物二聚体的△g的绝对值小于5。组合引物的长度在20-40bp，所以在合成引物时，要选用较高纯化标准。

本发明的有益效果是：

1)高通量。通过一代测序获得的结果只是单个碱基的结果，而进行一次本发明的方法至少可以检测30份样品，从而使其可以被广泛地用于斑秃相关基因的普查工作。

2)低成本。采用自主研发的试剂，其价格要远远低于进口试剂，使得检测成本也大大降低。

附图说明：

图1为本发明组合引物的序列表。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示和实施例，进一步阐述本发明。

注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30min内请勿进食和饮水。

1)从斑秃患者口腔拭子样本中提取基因组dna。

2)将不同的组合引物按照等比例混合，混合后作为一个的引物池。使用96孔板或者384孔板，按照试剂盒要求配置反应体系，贴封板膜，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；(注意：贴膜时，使用rochelightcycler480ⅱ专配刮板，使膜贴紧pcr板。)

体系如下：

用此引物按照荧光定量pcr的方法进行扩增，扩增条件如下：95℃预变性10min；然后按95℃变性10s，65-55℃退火10s，每个循环下降0.5℃，72℃延伸30s的程序进行45个循环；扩增出的dna片段即为扩增文库。

3)步骤2)中的dna片段按照高分辨率熔解曲线法进行高分辨率溶解曲线过程，扩增产物的熔解步骤在pcr循环结束后立即进行，程序为：升温至95℃1min，然后降温至40℃1min，再升温至65℃1s，从65℃连续升温到95℃的过程中进行荧光收集，25次/℃，最后，降温至40℃。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。