一种基于SSR标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法与流程

本发明涉及生物标记技术领域，特别涉及一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法。

背景技术

西葫芦是一种重要的瓜类蔬菜，不仅产量高，耐储运，而且还有很高的营养价值及保健功能，栽培面积仅次于黄瓜。西葫芦杂交种目前在中国市场占据一定份额，而种子纯度鉴定是商业化育种的必备环节。西葫芦杂交种主要利用通过人工去雄授粉制备，此过程难免造成自花授粉而产生伪杂种，因此，杂交种纯度鉴定尤其重要。传统的鉴定方式主要通过观察种子形态鉴定及植株田间表型等，但鉴定周期长，用地多，成本高且易受环境因素影响，准确性难以保证。

技术实现要素：

本发明实施例提供一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，解决传统通过种子形态鉴定、田间表型鉴定等产生准确率低和周期长的问题。

本申请实施例示出了一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物；

将所述扩增产物进行凝胶电泳，eb染色后，置于凝胶成像系统内成像；

根据成像结果统计带型；

根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。

进一步地，所述上游引物的核苷酸序列为5'-gaaattacgtggctgccatt-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-ggtagttttggccctcacaa-3'。

进一步地，采用改良热碱法提取杂交西葫芦叶片单株的基因组dna，所述改良热碱法包括：

将所述西葫芦子叶剪碎置于离心管中，向离心管中加入naoh，将离心管在沸水中放置预定时间，向离心管中加hcl中和，将离心管放置于tris-hcl进行沸水浴，得到所述杂交西葫芦叶片单株的基因组dna。

进一步地，在所述以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物的步骤之前，还包括：

提取西葫芦叶片基因组dna；

以所述西葫芦叶片基因组dna中母本材料和父本材料的基因组dna为模板，采用ssr分子标记进行pcr扩增，筛选出可以在亲本材料之间呈现出多态性扩增的上游引物和下游引物。

进一步地，所述pcr扩增为多态性扩增。

进一步地，所述pcr扩增中pcr反应体系包括10μl的2×taqmix，0.4μl的所述上游引物，0.4μl的所述下游引物，2μl的所述杂交西葫芦叶片单株的基因组dna，加水至20μl。

进一步地，所述pcr扩增中pcr反应过程包括：

依次在94℃温度条件下反应5min，94℃温度条件下反应30s，60℃条件下反应30s，72℃条件下反应15s，循环33次；

72℃温度条件下反应10min，最后温度4℃条件下保存。

进一步地，所述将扩增产物进行凝胶电泳包括：

将5μl所述扩增产物于1％琼脂糖凝胶上160v恒压电泳15min。

进一步地，所述根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度的公式为：

西葫芦杂交种子的纯度(％)＝扩增出两条带的种子数目/待测种子数目*100％。

由以上技术方案可见，本申请实施例示出了一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，方法包括：以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，eb染色后，置于凝胶成像系统内成像；根据成像结果统计带型；根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。由于分子标记技术直接从dna水平揭示双亲的差异性，因此实验结果准确，可靠，而且可以在苗期甚至种子水平进行鉴定，因此大大缩短了实验周期。与传统方法相比，本申请基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法可以准确鉴定杂交种纯度，不受环境影响；在苗期即可鉴定纯度，显著缩短鉴定周期。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例示出的一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法的流程图；

图2为本申请实施例示出的ssr标记西葫芦杂交种子的扩增结果示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

参阅图1，本申请实施例示出了一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

步骤s1、以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物；

pcr是一种体外dna扩增技术，是在模板dna、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于dna聚合酶的酶促合反应，将待扩增的dna片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性-低温退火-引物延伸”三步反应的多次循环，使dna片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

步骤s2、将所述扩增产物进行凝胶电泳，eb染色后，置于凝胶成像系统内成像；

具体地，首先将扩增产物进行凝胶电泳。当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子状态，从这种意义上讲，dna和rna多核苷酸链可叫做多聚阴离子(polyanions)。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，dna分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的dna分子比分子量较大的dna分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离dna片段的基本原理。

核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(eb)是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在dna分子中的eb本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发eb发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光，发射波长为605nm.eb-dna复合物中的eb发出的荧光，比游离的凝胶中的eb本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。

凝胶成像即对dna/rna/蛋白质等凝胶电泳不同染色及微孔板、平皿等非化学发光成像检测分析。样品在电泳凝胶或者其他载体上的迁移率不一样，以标准品或者其他的替代标准品相比较就会对未知样品作一个定性分析。这个就是图像分析系统定性的基础。根据未知样品在图谱中的位置可以对其作定性分析，就可以确定它的成份和性质。样品对投射或者反射光有部分的吸收，从而照相所得到的图像上面的样品条带的光密度就会有差异。光密度于样品的浓度或者质量成线性关系。根据未知样品的光密度，通过于已知浓度的样品条带的光密度指相比较就可以得到未知样品的浓度或者质量。这就是图像分析系统定量的基础。采用最新技术的紫外透射光源和白光透射光源使光的分布更加均匀，最大限度的消除了光密度不均造成的对结果的影响。

步骤s3、根据成像结果统计带型；

步骤s4、根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。

由以上技术方案可见，由于分子标记技术直接从dna水平揭示双亲的差异性，因此实验结果准确，可靠，而且可以在苗期甚至种子水平进行鉴定，因此大大缩短了实验周期。与传统方法相比，本申请基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法可以准确鉴定杂交种纯度，不受环境影响；在苗期即可鉴定纯度，显著缩短鉴定周期。

进一步地，所述上游引物的核苷酸序列为5'-gaaattacgtggctgccatt-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-ggtagttttggccctcacaa-3'。

进一步地，采用改良热碱法提取杂交西葫芦叶片单株的基因组dna，所述改良热碱法包括：

将所述西葫芦子叶剪碎置于离心管中，向离心管中加入naoh，将离心管在沸水中放置预定时间，向离心管中加hcl中和，将离心管放置于tris-hcl进行沸水浴，得到所述杂交西葫芦叶片单株的基因组dna。

进一步地，在所述以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物的步骤之前，还包括：

提取西葫芦叶片基因组dna；

以所述西葫芦叶片基因组dna中母本材料和父本材料的基因组dna为模板，采用ssr分子标记进行pcr扩增，筛选出可以在亲本材料之间呈现出多态性扩增的上游引物和下游引物。

以西葫芦杂交种子16369为例，西葫芦叶片的获取方法为将西葫芦杂交种子16369置于发芽箱内，至子叶完全展开。

ssr是指简单重复序列，指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段dna，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在100bp以内。ssr的产生是在dna复制或修复过程中dna滑动或错配或者有丝分裂、减数分裂过程姐妹染色单体之间发生不均等的交换的结果。微卫星主要以两个核苷酸为重复单位，也有一些微卫星重复单元为3个核苷酸，少数为4个核苷酸或更多。不同遗传材料重复次数的可变性，导致ssr长度高度变异性，这一变异性是ssr标记产生的基础。微卫星的突变率很高，从而产生了很多等位基因，导致了微卫星的高度多态性。一般认为微卫星丰富的多态性是微卫星不稳定性的表现。由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大，微卫星呈共线性遗传。尽管微卫星dna分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守单拷贝序列，因为可以根据这两端的序列设计以对特异引物，通过pcr技术将其间的核心微卫星dna序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以获得其长度多态性，即ssr标记。

进一步地，所述pcr扩增为多态性扩增。对基因组dna进行双酶切，形成分子量大小不同的随机限制片段，再进行pcr扩增，根据扩增片段长度的多态性的比较分析，可用于构建遗传图谱、标定基因和杂种鉴定以辅助育种。

进一步地，所述pcr扩增中pcr反应体系包括10μl的2×taqmix，0.4μl的所述上游引物，0.4μl的所述下游引物，2μl的所述杂交西葫芦叶片单株的基因组dna，加水至20μl。

进一步地，所述pcr扩增中pcr反应过程包括：

依次在94℃温度条件下反应5min，94℃温度条件下反应30s，56℃条件下反应30s，72℃条件下反应15s，循环33次；

72℃温度条件下反应10min，最后温度4℃条件下保存。

进一步地，所述将扩增产物进行凝胶电泳包括：

将5μl所述扩增产物于1％琼脂糖凝胶上160v恒压电泳15min。

进一步地，所述根据带型结果计算西葫芦杂交种的纯度的公式为：

以西葫芦杂交种16369为例，西葫芦杂交种16369的纯度(％)＝扩增出两条带的种子数目/待测种子数目*100％。

由以上技术方案可见，本申请实施例示出了一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，方法包括：以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，eb染色后，置于凝胶成像系统内成像；根据成像结果统计带型；根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。由于分子标记技术直接从dna水平揭示双亲的差异性，因此实验结果准确，可靠，而且可以在苗期甚至种子水平进行鉴定，因此大大缩短了实验周期。与传统方法相比，本申请基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法可以准确鉴定杂交种纯度，不受环境影响；在苗期即可鉴定纯度，显著缩短鉴定周期。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例一：

步骤1、以西葫芦杂交种子16369为例，将100粒16369种子撒入发芽盒内，并置于发芽箱，待子叶完全展开时，利用热碱法提取叶片dna，具体方法如下：将子叶剪碎置于2ml离心管中，加80ml0.25mol/l的naoh，在沸水中放置30s，加80ml0.25mol/l的hcl中和，再加80μl0.5mol/ltris-hcl沸水浴2min，取浸出液作pcr模板。

步骤2、pcr扩增：pcr反应体系为：2×taqmix10μl，上、下游引物各0.4μl，基因组dna2μl，加水至20μl。pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃15s，共33个循环；72℃10min，后于4℃保存。

步骤3、pcr产物检测。将5μlpcr产物于1％琼脂糖凝胶上160v恒压电泳15min，eb染色后置于凝胶成像系统内成像，观察扩增条带大小。

步骤4、纯度计算。如图2所示，为实施例一ssr标记西葫芦杂交种16369的扩增结果，其中m为dl2000marker，a为母本特异条带，b为父本特异条带，根据谱带结果，23个西葫芦杂交种16369既有父本带型，又有母本带型，为真实杂交种，而17号仅有母本带型，为自交种，所以纯度为23/24*100％＝95.83％。

由以上技术方案可见，本申请实施例示出了一种基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法，方法包括：以杂交西葫芦叶片单株的基因组dna为模板，加入上游引物和下游引物，进行pcr扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，eb染色后，置于凝胶成像系统内成像；根据成像结果统计带型；根据带型结果计算西葫芦杂交种子的纯度。由于分子标记技术直接从dna水平揭示双亲的差异性，因此实验结果准确，可靠，而且可以在苗期甚至种子水平进行鉴定，因此大大缩短了实验周期。与传统方法相比，本申请基于ssr标记法的西葫芦杂交种子纯度鉴定方法可以准确鉴定杂交种纯度，不受环境影响；在苗期即可鉴定纯度，显著缩短鉴定周期。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由上面的权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确流程，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。