水稻抗褐飞虱基因BPH6共显性分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及水稻抗褐飞虱基因bph6共显性分子标记及其应用。

背景技术

褐飞虱(nilaparvatalugensstal,简称bph)属于同翅目飞虱科昆虫,是水稻的主要害虫。褐飞虱通过针状口器吸食水稻维管束鞘汁液,造成稻株发黄、倒伏甚至枯死。褐飞虱在取食时传播水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病,同时也促使水稻纹枯病、小球菌核病的传播。随着高产不抗虫水稻品种的推广,以及水稻种植方式和耕种制度的改变,褐飞虱发生频次增加,危害程度加大,已经成为我国和世界上水稻生产的首要虫害,对粮食生产安全造成严重威胁。实践表明,选育和推广具有抗虫能力的水稻品种是防治褐飞虱最为经济、有效的方法。

传统的水稻抗虫育种是通过抗虫性状鉴定对植株进行表型选择，费时费力且易受环境条件的影响及限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。分子标记辅助选择是一种利用与抗性基因紧密连锁或基因内部功能标记，在后代中结合基因型和表型选择对目标性状进行筛选的现代育种技术。该方法不仅可以极大地提高育种效率，缩短育种周期，还可节约大量人力、物力成本。褐飞虱抗性基因bph6来源于水稻品种swarnalata，对褐飞虱的多种生物型具有较好的抗性，其基因序列目前已申请专利(cn106148353a)。目前现有技术中针对褐飞虱抗性基因bph6的分子标记均为连锁标记，开发bph6基因内特异性标记对于该基因及抗虫性状的准确鉴定以及进一步改良水稻抗褐飞虱抗性具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱基因bph6共显性分子标记及其应用。

水稻抗褐飞虱基因bph6位于水稻4号染色体长臂，其部分核苷酸序列如seqidno.1所示。通过对大量已知的分别包含bph6抗虫等位基因与感虫等位基因的水稻品种的bph6编码区进行扩增、测序与序列比对分析，发明人发现bph6基因内如seqidno.1所示的核苷酸序列的188bp处存在一个snp位点(对应水稻日本晴染色体位置为21397054)，其中bph6抗褐飞虱的等位为t，对应褐飞虱易感的等位为c。此外，还发现在bph6基因内如seqidno.1所示的核苷酸序列的4438bp～4445bp存在一段特异性序列(对应水稻日本晴染色体位置为21400441～21400448)，其中bph6抗褐飞虱的等位核苷酸序列为5’-cgaaacac-3’，对应褐飞虱易感的等位核苷酸序列为5’-tgcagggg-3’。

本发明针对这两处bph6基因内部特异的核苷酸序列开发高效、准确鉴定bph6基因型的分子标记。

本发明提供一种水稻抗褐飞虱基因bph6的分子标记，所述分子标记为含有如seqidno.1所示的第188位的多态性为t/c的核苷酸序列，和/或，为含有如seqidno.1所示的第4438～4445位的多态性为5’-cgaaacac-3’/5’-tgcagggg-3’的核苷酸序列。

进一步地，本发明提供用于扩增所述分子标记的引物。

优选的，所述引物的核苷酸序列如下：

seqidno.2:agggcctctggcgctctac；

seqidno.3:aatgtgaaagtgcaattagaaggt；

seqidno.4:atagtgaagttgaatccgaagg；

seqidno.5:agtgactcagccttgtgtttcg。

此外，本发明还提供一种水稻抗褐飞虱基因bph6的检测试剂盒，其包含本发明所述的扩增引物。

更进一步地，本发明还提供所述的分子标记或所述的扩增引物或所述的试剂盒在鉴定水稻抗褐飞虱基因bph6的基因型、水稻抗褐飞虱性状或在水稻抗褐飞虱品种分子育种中的应用。

具体地，所述应用包括如下步骤：

(1)提取待测水稻的基因组dna；

(2)以步骤(1)获得的基因组dna为模板，采用本发明所述的扩增引物，进行pcr扩增；

(3)根据扩增产物的序列特征，判断bph6的基因型；

(4)根据bph6的基因型判断水稻的抗褐飞虱表型：如seqidno.1所示的第188位为t，则为抗褐飞虱表型，如seqidno.1所示的第188位为c，则为褐飞虱易感表型；如seqidno.1所示的第4438～4445位的核苷酸序列为5’-cgaaacac-3’，则为抗褐飞虱表型；如seqidno.1所示的第4438～4445位的核苷酸序列为5’-tgcagggg-3’，则为褐飞虱易感表型。

优选的，所述判断bph6的基因型为根据电泳检测扩增产物条带类型进行判断。

更优选的，所述判断bph6的基因型的标准如下：如扩增产物为283bp条带，待测水稻携带bph6抗褐飞虱等位基因；如扩增产物为361bp条带，待测水稻携带bph6褐飞虱易感等位基因；如扩增产物为283bp和361bp两种带型，待测水稻为bph6抗褐飞虱等位基因和褐飞虱易感等位基因杂合型水稻。

具体地，本发明提供的bph6基因的分子标记、扩增引物或试剂盒在用于鉴定水稻抗褐飞虱基因bph6的基因型、水稻抗褐飞虱性状或在水稻抗褐飞虱品种分子育种时的pcr反应条件和体系如下：

pcr反应条件为：94℃～98℃预变性3～10分钟；94℃～98℃变性10～30秒，52℃～60℃退火10～30秒，72℃延伸30～60秒，共25～35个循环；72℃延伸3～10分钟。

pcr反应体系(10μl)：记为：10×pcr反应缓冲液1μl，10mmdntp0.8μl，4条引物(10μm)均为0.15μl，0.1μltaqdna聚合酶；2μldna模板，双蒸水补足余量。

本发明的有益效果在于：

(1)bph6基因已有的分子标记均为连锁标记，在子代发生分离交换或检测的假阴性的概率较高，影响检测的准确性。本发明开发的bph6基因内共显性分子标记，可以排除假阴性的影响，能够准确鉴定bph6基因的纯合或杂合基因型，实现抗褐飞虱水稻资源的高效筛选；

(2)本发明提供的分子标记的扩增产物的不同条带大小差异较大，可通过琼脂糖凝胶电泳判定待测水稻材料的基因型，成本低廉、无需酶切，检测程序方便快捷；

(3)利用本发明提供的分子标记进行辅助育种时，能够实现子代bph6基因型的准确、简单、高效检测，同时实现水稻生长早期的非破坏性检测，适于商业化大规模育种中对bph6基因型的大量筛选以及对水稻种质资源中bph6等位基因型的鉴定。

附图说明

图1为已知的包含抗虫或感虫bph6等位基因的水稻品种的bph6基因编码区序列比对图。其中，a为如seqidno.1所示的第188位的多态性为t/c的核苷酸序列，b为如seqidno.1所示的第4438～4445位的多态性为5’-cgaaacac-3’/5’-tgcagggg-3’的核苷酸序列，其中，luoyang6为已知含有bph6抗虫等位基因的水稻品种，9311、nipponbare、dj123、huazhan、ir64为已知的含bph6感虫等位基因的水稻品种。

图2为实施例4中水稻育种常用亲本的检测电泳图，m：dl1000dnamarker，其中泳道1-32依次对应为珞扬6号、9311、f1、华占、玉针香、638s、r1206、r608、co2、r900、丰玉占、华恢284、成恢19、华润2号、綿恢3728、mf63、沪粳5、02428、沪粳6、杨粳5507、热粳35、越粳0618、徽粳602、镇稻819、辽盐287、江苏粳2、盐稻1531、农垦31、fukuniski、浙粳75、旱两优1号、皖两优385。

图3为实施例5中对f2群体检测的电泳图，m：dl1000dnamarker，泳道p1、p2分别为抗虫亲本珞扬6号和感虫亲本9311，泳道1-25为利用珞扬6/9311构建的f2群体单株，各材料所属基因型标注与对应泳道上方，s代表感虫等位基因类型，r代表抗虫等位基因类型，h代表杂合类型。

图4为实施例5中部分f2:3株系的抗虫表型鉴定结果，其中r代表抗虫表型，s代表感虫表型；抗虫对照珞杨6号和感虫对照9311均为3个重复，b6-1～b6-7代表7个f2:3株系，每个f2:3株系为两个重复。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所用的水稻材料均为可从商业途径或国家种质库得到或为本领域技术人员广泛推广使用的材料。

实施例1bph6基因共显性分子标记的开发

水稻bph6基因位于水稻4号染色体长臂，通过对珞杨6(bph6导入系)、华占、ir64等多个已知的抗虫和感虫水稻品种进行bph6编码区及其上下游序列的扩增和测序，采用dnaman软件以及ncbi数据库等序列分析工具进行序列比对分析，发现bph6基因内如seqidno.1所示核苷酸序列的188bp处存在一个snp位点，其中bph6抗虫等位为t，对应感虫等位为c(如图1中a所示)。此外，还发现在bph6基因内如seqidno.1所示核苷酸序列的4438bp～4445bp存在一段特异性编码序列，其中bph6抗虫等位核苷酸序列为5’-cgaaacac-3’，对应感虫等位核苷酸序列为5’-tgcagggg-3’(如图1中b所示)。针对这两处bph6基因内部特异的核苷酸序列开发分子标记，可以实现bph6等位基因的鉴定。

实施例2bph6基因共显性分子标记的检测引物设计

针对实施例1开发的两个bph6基因特异性分子标记设计检测引物，引物设计原理如下。

首先设计扩增抗虫等位基因的特异性引物，以bph6抗虫等位特异序列5’-cgaaacac-3’的互补序列5’-gtgtttcg-3’作为引物的3’端设计反向引物b6-rr，再在其上游设计与之配对的正向引物b6-rf，引物rr和rf只能特异性扩增bph6抗性等位基因，产生一条283bp条带，而bph6感虫等位在扩增时无带；

然后，设计扩增感虫等位基因的特异性引物，以位于基因编码区188位的snp中感虫等位特有的c碱基为引物3’端，并在引物3’端第二位碱基引入一个错配碱基设计正向引物b6-sf，并在其下游设计与之配对的反向引物b6-sr，sf与sr只能特异性扩增感虫等位基因获得一条361bp条带，而扩增抗虫等位基因时无带。

具体引物序列如表1所示，四条引物混合使用组成bph6的共显性分子标记检测引物组，当扩增产物只有283bp条带时，待测水稻携带bph6抗虫等位基因，为抗虫表型；当扩增产物只有361bp条带时，待测水稻携带bph6感虫等位基因，为感虫表型；当扩增产物有283bp和361bp两种带型时，待测水稻为bph6抗虫和感虫杂合基因型水稻并表现为抗虫表型。

表1bph6特异性分子标记引物序列及相关参数

实施例3水稻抗褐飞虱基因bph6特异性分子标记检测方法的建立

根据实施例2设计的bph6两对分子标记的检测引物，设计pcr的反应程序和反应体系，经过不断优化，确定如下反应程序和体系：

pcr反应体系(10μl)：记为：10×pcr反应缓冲液1μl，10mmdntp0.8μl，4条引物(10μm)均为0.15μl，0.1μltaqdna聚合酶；2μldna模板，双蒸水补足余量。

pcr反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。

实施例4bph6特异性分子标记在检测水稻抗虫及感虫品种中的应用

(1)生物材料

bph6供体材料珞扬6号，感虫对照材料9311，以及珞扬6号杂9311获得的f1，并选取29份育种亲本材料或市售水稻品种，具体包括：华占、玉针香、638s、r1206、r608、co2、r900、丰玉占、华恢284、成恢19、华润2号、綿恢3728、mf63、沪粳5、02428、沪粳6、杨粳5507、热粳35、越粳0618、徽粳602、镇稻819、辽盐287、江苏粳2、盐稻1531、农垦31、fukuniski、浙粳75、旱两优1号、皖两优385。

(2)水稻基因组dna提取及引物合成

采用ctab法提取上述水稻材料的基因组dna并合成表1所示的引物序列，具体为：

b6-sf:agggcctctggcgctctac；

b6-sr:aatgtgaaagtgcaattagaaggt；

b6-rf:atagtgaagttgaatccgaagg；

b6-rr:agtgactcagccttgtgtttcg。

(3)pcr检测

pcr的反应体系和反应程序如实施例3所述。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

(4)结果分析

pcr扩增产物的电泳结果如图2所示，1泳道bph6供体珞扬6号材料特异性扩增出283bp的条带，2泳道感虫对照材料9311扩增出361bp的条带，3泳道f1材料扩增出283bp和361bp两条带型，4-32泳道对应的亲本材料均扩增出与感虫对照材料9311一致的361bp的条带。为了验证pcr检测的结果的准确性，将珞扬6、9311及29个亲本材料对应的分子标记目标区进行了测序比对。结果表明，分子标记检测结果与测序结果一致，证明本发明提供的引物能够准确鉴定抗褐飞虱基因bph6的基因型，可实现准确高效的水稻品种资源的筛选。

实施例5水稻抗褐飞虱基因bph6在f2群体的单基因分离的检测及表型相关性分析

(1)生物材料

抗虫亲本珞扬6号和感虫亲本9311，以及在两亲本杂交构建的f2群体中的随机选取的96个f2单株。

(2)水稻基因组dna的提取和pcr检测

水稻基因组dna的提取和pcr检测的引物、反应程序和体系如实施例4所述。

(3)f2:3群体部分株系苗期抗虫鉴定

以选取的96个f2单株发展f2:3群体，采用标准苗期集团法对其中20个株系，其中10个株系的bph6基因型为a(seqidno.1所示核苷酸序列的第188位为t，第4438～4445位为5’-cgaaacac-3’)，10个株系的bph6基因型为b(seqidno.1所示的核苷酸序列的第188位为c，第4438～4445位的多态性为5’-tgcagggg-3’)进行苗期抗虫性鉴定，以抗虫亲本珞杨6号为抗虫对照，感虫亲本9311为感虫对照。

(4)结果分析

抗虫亲本珞扬6号和感虫亲本9311以及部分f2株系的pcr扩增产物的电泳结果如图3所示，泳道p1、p2分别为抗虫亲本珞扬6号和感虫亲本9311，泳道1-25为利用两亲本构建的随机选取的部分f2株系，各材料所属基因型标注于对应泳道下方，s代表感虫等位基因类型，r代表抗虫等位基因类型，h代表杂合类型。结果表明，对96个f2株系进行检测，3种不同基因型的分离比为23ss:49h:25rr，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ²＝0.125＜χ²0.05＝5.99)，因此，该标记为共显性标记，可以将两种不同纯合子以及杂合子基因型进行区分，检测位点同时表现为单基因分离。

对20份f2:3株系进行标准苗期抗虫鉴定，抗性结果及对应基因型结果如表2所示，其中，r代表抗虫，s代表感虫。部分株系的表型鉴定情况如图4，图4中抗虫对照珞杨6号和感虫对照9311均为3个重复，其余每个f2:3株系为两个重复，每个重复16株，标注r代表该株系抗虫，s代表感虫。结果表明，本发明的分子标记可以有效地筛选出含bph6基因、具有抗褐飞虱表型的水稻植株，从而加快水稻抗褐飞虱的育种。

表2f2:3株系苗期抗褐飞虱鉴定结果

本发明提供的bph6共显性分子标记及其检测引物，能够实现抗褐飞虱基因bph6的基因型的高效、准确鉴定，可以用于水稻资源的筛选鉴定，也可用于水稻抗褐飞虱基因bph6的分子遗传育种。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>袁隆平农业高科技股份有限公司湖南隆平高科种业科学研究院有限公司湖南亚华种业科学研究院

<120>水稻抗褐飞虱基因bph6共显性分子标记及其应用

<130>khp181115157.0

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5777

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aacatccgtctcgtgctcgcgctcgcgcagaagcccatctatccaagcattccaattgct60

gctgcttccatcggtcggccagaattgctgcatgctgttgtcttaagttatttggagcat120

tcttcagttcgtctatctagcctgacttcatacttgcttcacctggctcagggcctctgg180

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