一种用于检测中麦895抗赤霉病QTL的分子标记及使用方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测中麦895抗赤霉病qtl的分子标记及使用方法。

背景技术

由禾谷镰刀菌等引起的小麦赤霉病(fusariumheadblight，fhb)是一种广泛流行的真菌病害，严重影响小麦产量和品质。更重要的是，感病籽粒含真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，危害人畜健康，影响食用和饲用。

我国长江中下游和东北麦区是小麦赤霉病常发、重发区域。近年来，受全球气候变化、小麦–玉米轮作制度下秸秆还田的普及等影响，该病呈扩张、加重趋势，已成为黄淮麦区常发病害。当前我国小麦赤霉病年均发生面积超过533.3万hm²，2010～2015年造成年均总损失高达337万t，居小麦病害之首。

培育利用抗病品种是降低赤霉病危害的经济有效手段。国内外对赤霉病抗性遗传进行了大量研究，已定位约100个抗赤霉病qtl，分布在小麦所有染色体，fhb1～fhb7等7个抗病基因被正式命名，其中来自苏麦3号位于3b染色体短臂的fhb1抗性最强且稳定。然而，除fhb1外，其它基因育种应用的报道较少。此外，小麦赤霉病抗性遗传研究还存在对生产应用品种研究少，育种可用分子标记欠缺等问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测中麦895抗赤霉病qtl的分子标记及使用方法。

本发明首先保护特异引物对；所述特异引物对由引物p8684f和引物p8684r组成；

所述引物p8684f为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物p8684r为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的dna分子。

所述引物p8684f和所述引物p8684r的摩尔比为1:1。

所述特异引物对的用途为如下(b1)-(b6)中的至少一种：

(b1)筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦；

(b2)抗赤霉病小麦育种；

(b3)检测或辅助检测小麦抗赤霉病qtlqfhb.caas-5al的基因型；

(b4)制备用于筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦的试剂盒；

(b5)制备用于抗赤霉病小麦育种的试剂盒；

(b6)制备用于检测或辅助检测小麦qfhb.caas-5al基因型的试剂盒。

本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：

(b1)筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦；

(b2)抗赤霉病小麦育种；

(b3)检测或辅助检测小麦抗赤霉病qtlqfhb.caas-5al的基因型；

(b4)制备用于筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦的试剂盒；

(b5)制备用于抗赤霉病小麦育种的试剂盒；

(b6)制备用于检测或辅助检测小麦qfhb.caas-5al基因型的试剂盒。

本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：

(c1)筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦；

(c2)抗赤霉病小麦育种；

(c3)检测或辅助检测小麦抗赤霉病qtlqfhb.caas-5al的基因型。

本发明还保护筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦的方法(方法甲)，包括如下步骤：以待测小麦的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，如果扩增产物中具有756bp的dna片段且不具有909bp的dna片段，则待测小麦为或候选为抗赤霉病小麦。

本发明还保护筛选或辅助筛选抗赤霉病小麦的方法(方法乙)，包括如下步骤：检测待测小麦基因组dna中是否含有特异dna片段甲和特异dna片段乙，如果所述基因组dna中含有特异dna片段甲且不具有特异dna片段乙，则待测小麦为或候选为抗赤霉病小麦；

所述特异dna片段甲为序列3或其反向互补序列；

所述特异dna片段乙为序列4或其反向互补序列。

本发明还保护检测或辅助检测待测小麦qfhb.caas-5al基因型的方法(方法丙)，包括如下步骤：以待测小麦的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，如果扩增产物中具有756bp的dna片段且不具有909bp的dna片段，则待测小麦为或候选为携带qfhb.caas-5al抗病等位基因的小麦。

本发明还保护检测或辅助检测待测小麦qfhb.caas-5al基因型的方法(方法丁)，包括如下步骤：检测待测小麦基因组dna中是否含有特异dna片段甲和特异dna片段乙，如果所述基因组dna中含有特异dna片段甲且不具有特异dna片段乙，则待测小麦为或候选为携带qfhb.caas-5al抗病等位基因的小麦；

所述特异dna片段甲为序列3或其反向互补序列；

所述特异dna片段乙为序列4或其反向互补序列。

以上任一所述方法中，所述pcr扩增的反应体系具体可为：模板dna(30ng/μl)2μl，引物p8684f(10μm)0.5μl，引物p8684r(10μm)0.5μl，2×pcrmix(0.1uμl^-1taq酶、500μmoll^-1dntps、20mmoll^-1tri-hcl、10mmoll^-1kcl、3mmoll^-1mgcl2)10μl，ddh2o7μl。

以上任一所述方法中，所述pcr程序具体可为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

本发明还保护以上任一所述的特异dna片段甲和/或特异dna片段乙。

本发明还保护以上任一所述的方法在抗赤霉病小麦育种中的应用。

本发明还保护以上任一所述的特异dna片段甲和/或特异dna片段乙在抗赤霉病小麦育种中的应用。

本发明还保护抗赤霉病小麦育种方法，为方法a或方法b。

所述方法a包括如下步骤：将按照方法甲或方法乙筛选得到的抗赤霉病小麦作为育种材料。

所述方法b包括如下步骤：将按照方法丙或方法丁筛选得到的携带qfhb.caas-5al抗病等位基因的小麦作为育种材料。

在实际应用中，可用中麦895与不含qfhb.caas-5al抗病等位基因的感病亲本杂交，在分离世代采用所述方法丙或方法丁选择携带qfhb.caas-5al抗病等位基因的小麦单株，直至选育出携带qfhb.caas-5al纯合抗病等位基因的稳定品系。分离世代携带qfhb.caas-5al纯合抗病等位基因的单株pcr产物显示大小为756bp的单一条带，杂合单株显示两个条带，大小分别为909bp和756bp；感病等位基因纯合单株显示大小为909bp的单一条带。在实际应用中，可根据实际情况，选择呈现大小为756bp单一条带的携带qfhb.caas-5al纯合抗病等位基因的单株和呈现两个条带的杂合单株或仅选择抗病等位基因纯合单株。对于所选择的杂合单株，需在其下一代再进行一次标记检测并选择携带qfhb.caas-5al纯合抗病等位基因的单株，也可用所选亲本与中麦895的f1与所选亲本回交，用上述方法选择bc1f1中携带qfhb.caas-5al位点杂合单株，并在其下一代再进行一次标记检测并选择qfhb.caas-5al抗病等位基因纯合的单株。

以上任一所述756bp的dna片段为序列3或其反向互补序列。

以上任一所述909bp的dna片段为序列4或其反向互补序列。

以上任一所述赤霉病可为但不限于由黄冈1号引发的赤霉病。

以上任一所述小麦可为但不限于如下品种中的任一种或任几种：扬麦16、中麦895、扬麦16/中麦895dh群体，以及实施例部分表2中所示的157份小麦品种。

以上任一所述qtlqfhb.caas-5al位于小麦5a染色体长臂上，lod值2.8～9.4，解释表型变异2.4％～9.0％，抗病等位基因来自中麦895。

本发明专利通过对生产应用品种扬麦16和中麦895构建的dh(双单倍体)群体进行抗赤霉病qtl(数量性状位点)定位，在5a染色体长臂上发现了抗赤霉病qtlqfhb.caas-5al，lod值2.8～9.4，解释表型变异2.4％～9.0％，两侧标记为ax-111258351和ax-111001072，抗病等位基因来自中麦895。在此基础上，本发明开发了与qfhb.caas-5al紧密连锁的indel(插入缺失)标记，为抗赤霉病育种提供了良好工具。

附图说明

图1为qfhb.caas-5al及其连锁snp标记在5a连锁图(部分)中的位置。

图2为扬麦16、中麦895和dh群体部分家系fhb-5al-indel检测结果。m:dl2000dnamarker；1:扬麦16；2～4:基因型与扬麦16相同的dh家系；5:中麦895；6～8:基因型与中麦895相同的dh家系。

图3为fhb-5al-indel不同基因型品种fhbindex平均值比较。**表示在0.01水平差异显著。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

赤霉病病情指数(fusariumheadblightindex，fhbindex)＝发病率×严重度，其中发病率为发病穗数与总穗数的比值，严重度为每穗病小穗数与小穗数比值的平均值，均以百分率计。

中麦895：中国农业科学院作物科学研究所和中国农业科学院棉花研究所合作选育的高产、抗病、广适性小麦新品种。参考文献：何中虎,阎俊,张勇.高产矮秆抗倒广适小麦新品种中麦895的选育及栽培要点[j].作物杂志,2013(5):154–155.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

扬麦16：江苏里下河地区农业科学研究所育成的春性中筋小麦新品种。参考文献：陆成彬,程顺和,张伯桥,等.优质中筋小麦新品种扬麦16特征特性与高产栽培技术[j].江苏农业科学,2006(3):112.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

黄冈1号：参考文献：朱展望,杨立军,佟汉文,等.湖北省小麦品种(系)的赤霉病抗性分析[j].麦类作物学报,2014,34(1):137–142.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例3中所示的157份小麦材料记载于文献：朱展望,徐登安,程顺和,等.中国小麦品种抗赤霉病基因fhb1的鉴定与溯源[j].作物学报,2018,44(4):473–482.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、抗赤霉病qtlqfhb.caas-5al及其连锁标记的获得

供试材料：中麦895、扬麦16和以扬麦16为母本、中麦895为父本采用小麦玉米杂交技术构建的dh群体(含174个家系)。

田间赤霉病抗性鉴定：试验于2016～2017、2017～2018年度在武汉进行。试验采用完全随机区组设计，2行区，行长1m，行距0.25m，2次重复。标记10个正在开花且形态基本一致的穗子，对其喷施病菌分生孢子悬浮液(5×10⁵个/ml)，病原菌菌株为黄冈1号；从抽穗期到调查结束，用微电脑定时弥雾装置增湿，促进发病。接种后20d调查发病穗数、每穗小穗数和病小穗数，计算fhbindex。同时于2016～2017、2017～2018年度进行自然发病鉴定，即不对该群体进行接种，仅在开花后采用时控弥雾装置喷水保湿，促进发病，于各小区开花后24天目测估计fhbindex，试验设计同上。

田间数据分析：选用sas9.2软件proccorr模型计算fhbindex的pearson相关系数。相关分析表明，2016～2017年度喷雾接种重复间相关系数为0.76(p<0.01)，2016～2017年度自然发病重复间相关系数为0.66(p<0.01)，2017～2018年度喷雾接种重复间相关系数为0.68(p<0.01)，2017～2018年度自然发病重复间相关系数为0.77(p<0.01)，说明了该群体田间表型数据的有效性。

遗传图谱构建：除去单株标记缺失率高于20％的dh系，除去无多态性、缺失率大于10％及两种基因型比例大于7:3或小于3:7的偏分离标记。用icimappingv4.0的bin-mapping功能对剩余的多态性标记进行优化处理，用于遗传图谱构建。利用joinmapv4.0和mstmaponline进行遗传图谱的构建。

qtl定位：用qtlicimappingv4.0复合区间作图(cim)对扬麦16/中麦895dh群体赤霉病抗性进行qtl定位，选取lod值2.5作为阈值。qtl定位发现位于5al上的抗病位点(图1)，两侧标记为ax-111258351和ax-111001072，lod值为2.8～9.4，解释表型变异2.4％～9.0％，该位点记为qfhb.caas-5al。两侧标记ax-111258351和ax-111001072的遗传位置分别为119.91cm和120.29cm，在中国春参考基因组(iwgscrefseqv1.0)上的物理位置分别为569.2mb和569.1mb。选取该位点附近的多个snp标记，用于qfhb.caas-5al的标记开发。

实施例2、fhb-5al-indel标记方法的建立

一、基因组特异引物设计

ax-89588684在连锁图5a上的遗传位置为120.62cm，在中国春参考基因组(iwgscrefseqv1.0)上的物理位置570.0mb，与qfhb.caas-5al两侧标记ax-111258351和ax-111001072遗传位置和物理位置均极为接近，可用于标记开发。用snpax-89588684的侧翼序列(序列5)，在ensemblplants数据库(http://plants.ensembl.org)比对，获取其同源序列，设计其5a染色体特异引物p8684(序列1和序列2)，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

p8684f：5’-ttcccctcccctacatatgagatg-3’(序列1)；

p8684r：5’-cgataaggcaaaaacgaggtgac-3’(序列2)。

二、检测方法建立

供试材料：中麦895、扬麦16和以扬麦16为母本、中麦895为父本采用小麦玉米杂交技术构建的dh群体(含174个家系)。

1、提取待测小麦的基因组dna，加ddh2o稀释其浓度至30ng/μl。

2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物p8684f和引物p8684r组成的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物。

pcr体系见表1。

pcr程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

表1、引物p8684的pcr体系

3、用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤2得到的pcr产物并将产物测序。

中麦895扩增片段(序列3)大小为756bp，扬麦16扩增片段(序列4)大小为909bp(图2)，两片段存在152bp整段插入缺失(indel)、5个snp和1个单碱基indel，片段大小差异153bp。该扩增片段大小差异可用于区分中麦895和扬麦16该位点基因型，该标记记为fhb-5al-indel。

174个家系fhb-5al-indel标记基因型与ax-89588684芯片基因型有1个家系存在差异，放入原图谱位置相近，说明芯片标记ax-89588684成功转化为indel标记。

因此，可以用如下方法判断待测小麦抗赤霉病qtlqfhb.caas-5al的等位基因：

取待测材料，按照步骤1和2进行操作，如果待测材料扩增片段为756bp，则待测材料该位点基因型与中麦895相同，推测含有qfhb.caas-5al抗病等位基因，抗赤霉病；如果待测材料扩增片段为909bp，则待测材料该位点基因型与扬麦16相同，推测含有qfhb.caas-5al感病等位基因，感赤霉病。

实施例3、实际样本检测

供试材料：我国不同省份小麦品种157份，具体见表2。

1、赤霉病抗性鉴定

于2014～2016连续3年在湖北省农业科学院南湖试验田进行赤霉病接种鉴定，病原菌菌株为黄冈1号。试验采用完全随机区组设计，2行区，行长1m，行距0.25m，2次重复。标记10个正在开花且形态基本一致的穗子，对其喷施病菌分生孢子悬浮液(5×10⁵个/ml)；从抽穗期到调查结束，用微电脑定时弥雾装置增湿，促进发病。接种后20d调查发病穗数、每穗小穗数和病小穗数，计算fhbindex，3年fhbindex平均值作为表型用于后续分析。

2、fhb-5al-indel标记检测

按照实施例2中的方法进行检测，以中麦895和扬麦16作为对照。

157份小麦品种标记检测结果和fhbindex平均值如表2所示。

结果表明，62份与中麦895基因型相同，推测含qfhb.caas-5al抗病等位基因，fhbindex平均值为52.7％；95份与扬麦16基因型相同，推测含qfhb.caas-5al感病等位基因，fhbindex平均值为63.9％。含qfhb.caas-5al抗病等位基因品种fhbindex平均值比含qfhb.caas-5al感病等位基因品种低17.5％。用sas9.2统计软件procttest模型进行t检验，其差异在0.01水平显著(p＝0.0005)(图3)。

表2、157份小麦品种fhb-5al-indel标记检测结果及其fhbindex

*注：“+”表示该位点基因型与中麦895相同，推测含有qfhb.caas-5al抗病等位基因，“-”表示该位点基因型与扬麦16相同，推测含有qfhb.caas-5al感病等位基因。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种用于检测中麦895抗赤霉病qtl的分子标记及使用方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttcccctcccctacatatgagatg24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgataaggcaaaaacgaggtgac23

<210>3

<211>756

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>3

ttcccctcccctacatatgagatgccacgatcggtacggtacggtgatcatcataggtta60

agataaaaactgcacaaacacatagagaggataagataaaaccaaaaaaaaagagagata120

gattaacgaaagtgagaaacaagttactacatggtctcggcggttctcgattacagtcag180

tcagtcacaccttggttacagtccaatagcagcagtttgcaatttattcgtcgtcaaaaa240

agtttctagttggtgtcgaggatggatgtattgccttgccggaaacgtgactttggttgg300

tggttcgccaatgcctgttgactccagtatgtctttctgttgctaccttggactgccctt360

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tatatagacttcatatcattctgatttttttttcatttcctgctgaacagctatattctc480

gagtgtgacaccgtgcatatctggtcgatcacacattcacacctagtaggtcgtttgaat540

tctactatgtaggaacaccgataaactcgctgtctgactatatcttactcttctatgtag600

acctcaaaatgacattaccgctagccctccatcctaaaaattatagtggtgtagatcctc660

gaaatatttcagggtgtcacgtgagcatgcaaattataaaaatcatcatccaggtcttca720

aagtgcaataagagtcacctcgtttttgccttatcg756

<210>4

<211>909

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>4

ttcccctcccctacatatgagatgccacgatcggtacggtacggtgatcatcataggtta60

agataaaaactgcacaaacacatagagaggataagataaaaccaaaaaaaaaaagagata120

gattaacgaaagtgagaaacaagttactacatggtctcggcggttctcgattacagtcag180

tcagtcacaccttggttacagtccaatagcagcagtttgcaatttattcgtcgtcaaaaa240

agtttctagttggtgtcgaggatggatgtattgccttgccggaaacgtgactttggttgg300

tggttcgccaatgcctgttgactccagtatgtctttctgttgctaccttcgactgccctt360

tttgtgacacgtttcaaatggaatggaatgtgtgttttgtgggcgagggctccatatcta420

tatatagacttcatatcattctgatttttttttcatttcctgctgaacatctatattctc480

gagtgtgacaccgtgcatatctggtcgatcacacattcacacctagtaggtcgtttgaat540

tctactccctccgttcttaaatatttgtctttctagacatttcaaataactactacatac600

ggatgtatgtagacatgtagattcattcattttgctccgtatgtagtcacttgttgaaat660

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actgtctaactatatcttactcttctatgtagacctcaaaatgacattaccgctagccct780

ccatcctaaaaattatagtggtgtagatcctcgaaatatttcaggggtgtcacgtgagca840

tgcaaattataaaaatcatcatccaggtcttcaaagtgcaataagagtcacctcgttttt900

gccttatcg909

<210>5

<211>71

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<223>k=gort

<400>5

atcattctgatttttttttcatttcctgctgaacakctatattctcgagtgtgacaccgt60

gcatatctggt71