一种与棉花纤维长度主效QTL连锁的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及一种来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记及其应用。

背景技术

棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。我国大面积种植的是陆地棉品种，棉花育种工作者在上世纪80年代前主要集中在产量的提高上，纤维品质的提高没有得到足够的重视，使得我国的棉花品种大多表现为产量高，品质差。进入90年代中后期，纤维品质的育种已成为棉花分子育种的一个重要目标。纤维长度是纤维品质性状的一项重要指标。

海岛棉具纤维品质具有长、强、细的特性，但产量低，而陆地棉产量高，适应性广，但品质差(percyetal.,2006)。在陆地棉和海岛棉中，陆地棉因产量高，适应性广，被大面积种植，而海岛棉虽然纤维品质好，但产量低而不被广泛种植。因此挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质的改良有着重要的意义。

采用传统的育种方法改良或提高陆地棉的纤维长度，首先要通过陆地棉和海岛棉等杂交，通过多代的回交，获得具有高强纤维基因渐渗的种质材料，与现有的陆地棉栽培品种杂交，通过多代的回交及自交选择，以打破纤维品质性状与产量性状间的负相关。每个世代需要足够大的选择群体，都要对纤维品质进行测定，而每一世代的选择都需等到棉花吐絮后收取棉花进行纤维品质检测后才能决定，这就导致了育种的群体要大，选择工作量大，成本较高且周期长。而且纤维品质性状受环境影响较大，使得育种进展缓慢。

由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，这对质量性状而言一般是有效的，但对纤维品质等这样的数量性状来说，则存在准确性差、效率低等许多缺点。要提高选择的效率，理想的方法应该是能够直接对基因型进行选择。

分子标记辅助选择是借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长时期和发育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间，减少了群体种植规模。分子标记辅助选择对同步改良纤维品质和产量、多性状基因聚合、快速培育棉花新品种等具有无比优越性。现有技术对分子标记筛选做了大量的工作，利用不同的群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的qtl(quantitativetraitloci,简写qtl)筛选，得到了大量的与纤维品质相关的qtl。在海岛棉纤维品质性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的qtl筛选，取得了很大研究进展。这些研究结果为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，有些qtl或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种中。但是，前人的研究中多数是利用rils、bc1f1等分离群体，遗传背景复杂，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏可靠性和稳定性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。染色体片段代换系能够准确的鉴定qtl。而染色体片段代换系与轮回亲本之间只有渐渗片段的不同，其他遗传背景相同，因而染色体片段代换系，特别是单片段代换系在准确鉴定qtl方面具有优势。

技术实现要素：

为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决纤维长度育种进展缓慢的问题。本发明以陆地棉品种中棉所45(中45)为遗传背景渐渗有海岛棉海1染色体片段的优质代换系mbi7747为母本，与其轮回亲本中棉所45杂交，构建次级分离大群体，从中后代中选择单片段代换系构建近等基因系分离大群体，进行海岛棉纤维长度qtl的精细定位，同时还可以直接培育用于育种的新品系。

本发明的目的是提供来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记。

本发明的再一目的是提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法。

本发明的再一目的是提供上述来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记的应用。

本发明提供的技术方案是：一种与海岛棉海1纤维长度有关的分子标记，所述分子标记为ssrn106270和ssrn189240，

其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

①ssrn106270

正向引物序列为gtgtgactaacctgagtgactga，

反向引物序列为aatgtggctcatgggctctt，可扩增长度为270bp的海1的dna片段；

②ssrn189240正向引物序列为ggggacaggtgaagttgtga，

反向引物序列为tggaagcccagccacaaata，可扩增长度为240bp的海1的dna片段。

本发明还提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，该方法包括以下步骤：

(1)dna提取，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的分子标记ssrn106270和ssrn189240对群体单株的基因型进行分子检测；

(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的陆地棉品种；

其中，所述与自海岛棉海1与纤维长度性状紧密连锁的分子标记ssrn106270和ssrn189240的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

①ssrn106270

正向引物序列为gtgtgactaacctgagtgactga，

反向引物序列为aatgtggctcatgggctctt，

扩增长度为270bp的海1的dna片段；

②ssrn189240正向引物序列为ggggacaggtgaagttgtga，

反向引物序列为tggaagcccagccacaaata，

扩增长度为240bp的海1的dna片段。

根据本发明所述陆地棉纤维长度辅助育种方法，使用ssr标记ssrn106270和ssrn189240在与海岛棉海1、mbi7747等有关的育种群体中对纤维长度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维长度。该方法所用的分子标记ssrn106270和ssrn189240与纤维长度性状的qtl：qfl-c12(fl是纤维长度的英文单词fiberlength的缩写。qtl的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号。如：qfl-c12表示在第12条染色体上控制纤维长度的qtl。)紧密连锁。这个纤维长度性状的qtl：qfl-c12位于染色体c12上，来源于海岛棉海1，对提高纤维长度的贡献率为8.59-35.22％，加性效应为0.61-1.32mm。

本发明不仅有助于筛选纤维长的材料，为今后海岛棉海1或mbi7747杂交、回交后代的纤维长度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为基因克隆奠定了基础。

使用本发明可以在苗期预测纤维长度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选纤维长的株系用于棉花纤维品质育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过这些与纤维长度性状的qtl紧密连锁的分子标记在与海岛棉海1、mbi7747等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，以克服现有技术存在的不足。

根据本发明的与海岛棉海1相关的陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的ssr标记ssrn106270和ssrn189240在与海岛棉海1、mbi7747等有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉纤维长度0.61-1.32mm。该方法包括以下步骤：苗期单株提取dna；使用分子标记ssrn106270和ssrn189240对群体单株的基因型进行分子检测；对检测结果进行分析；选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度得到不同程度的提高。

通过这些分子标记选择可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种提高陆地棉纤维长度性状的分子标记选择方法，使用分子标记ssrn106270和ssrn189240在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高纤维长度0.61-1.32mm。

使用这些分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维长度性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，而且有助于克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育与种子产业化进程。

附图说明

图1mbi7747在染色体上的渐渗片段情况，红色是中棉所45的背景，蓝色和绿色是渐渗的海岛棉染色体片段。

具体实施方式

下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：筛选分子标记

(1)群体构建及数据的获得

以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45(中45)为轮回亲本，杂交回交并自交获得中棉所45×海1bc4f3：5染色体片段代换系，进行了多个环境的评价(马留军等，2013)和分子基因型检测[标记来自分子遗传连锁图谱(shietal.2015)]，从中挑选一个优质含有少数渐渗片段的代换系mibi7747(图1)作为母本，与轮回亲本中棉所45为父本杂交，构建次级分离大群体bc5f2。

2013年在安阳种植bc5f2分离大群体900株，行长8m，行宽80cm，株距25cm，对单株进行常规田间调查和纤维品质测定，能够测定纤维长度的单株604个，提取单株dna并进行分子检测。从bc5f2中挑选1个含有12号染色体渐渗片段的优质单株，2014年种植成株系，并与轮回亲本中棉所45回交，通过安阳和海南两个地点的连续3次自交并分子标记辅助选择和背景选择，获得只含有12号染色体一个渐渗片段的单株，其他遗传背景同中棉所45，即单片段代换系。选择杂交状态的单片段代换系于2016年在安阳种植成分离大群体，获得bc6f4群体单株2092个。提取单株dna，用12号染色体上的渐渗片段上的ssr标记及其对应棉花参考基因组上的区段开发的新标记进行bc6f4群体单株dna基因型检测，获得293个发生交换的单株，对这些单株进行农艺性状和纤维品质的测定。2016年安阳种植行长5m，行宽80cm，株距25cm。获得的表型数据见表1。

表1两个群体中纤维长度性状描述性统计分析

(2)dna提取

上述(1)中单株dna提取采用ctab法(patersonetal.1993)提取。

(3)引物由上海生工和北京三博公司合成。ssr扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×buffer1.0μ1，10mmdntps0.50μ1，正向引物(10μm)0.50μ1，反向引物(10μm)0.50μ1，模板dna(30ng/μ1)1.0μ1，taqdna聚合酶(5u/μ1)0.10μ1。ssr扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在biometra公司tgradient及bio-rad公司ptc-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。

(4)纤维长度qtl定位

利用两年两个群体的纤维长度性状的表型数据和基因型数据，采用王健康的qtlicimappingv4.1软件进行纤维长度性状的qtl定位分析，检测到在两个群体或2个环境稳定的纤维长度性状的qtl，位于12号染色体上，是前人没有发现的，具体结果见附表2。

表2两个群体都能检测到的纤维长度的一个qtl

该qtl加性效应都为正，增效基因来源于海岛棉海1，对增加纤维长度的贡献率为8.59-35.22％，加性效应为0.61-1.32mm，与qfl-c12紧密连锁的标记为标记ssrn106270和ssrn189240。

各分子标记的引物序列和扩增的目的片段长度如下：

①ssrn106270

正向引物序列为gtgtgactaacctgagtgactga，

反向引物序列为aatgtggctcatgggctctt，可扩增长度为270bp的海1的dna片段；

②ssrn189240正向引物序列为ggggacaggtgaagttgtga，

反向引物序列为tggaagcccagccacaaata，可扩增长度为240bp的海1的dna片段。

实施例2：陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法

使用实施例1获得的分子标记ssrn106270和ssrn189240在与海岛棉海1、mbi7747等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：

(1)dna提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本杂交高代回交获得的代换系及其衍生品系，或者代换系mbi7747与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用ctab法(patersonetal.1993)提取分离群体单株dna；

(2)使用分子标ssrn106270和ssrn189240对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测；

(3)对检测结果进行分析；

(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度得到不同程度的提高。

通过本发明可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种(系)，加速棉花纤维品质的育种进程。