一种LAMP法鉴别布鲁氏菌流行株和S2株的引物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的引物、试剂盒及其应用。
背景技术：
布鲁氏菌病(简称布病)是由动物传播于人类的细菌感染性疾病，人类感染布病主要通过直接接触患病动物的血液、胎盘、胎儿或子宫分泌物，亦或食用未经高温消毒的牛奶、奶酪及其他奶制品。布病感染主要症状包括食欲不振，头疼发热，关节肌肉疼痛，疲劳及盗汗等症状。布病在全世界的分布范围较广，亚洲、非洲、东欧、环地中海地区、中东、拉美及中美洲地区为布病多发区。布病病原微生物为布鲁氏菌，极易感染牛羊等家畜。易造成睾丸炎，流产，死胎等症状，限制畜牧业规模化发展，严重危害人类的食品安全。目前国内外科研机构尚未研发出针对布病具有特殊疗效的抗生素药物，现阶段主要通过疫苗免疫进行防控。因此，及时监测，迅速诊断，预防为重为布病的防治重心。布鲁氏菌常规检测方法可检测布鲁氏菌，却无法鉴别布鲁氏菌流行株感染与疫苗株免疫。细菌分离鉴定方法是检测布鲁氏菌的“金标准”，但不能鉴别流行株与疫苗株，并且花费时间周期较长，操作复杂，危险性较高。血清学方法大多作为初检与普检使用，简单快捷，应用较广，亦不能鉴定布鲁氏菌种型，并且存在灵敏性低与特异性差的缺点。不能区分流行株感染和疫苗免疫，干扰布病的检疫，危害畜牧业经济安全。国内外学者在布鲁氏菌菌株鉴别领域多采用多重pcr方法或rt-pcr等分子生物学方法，然而成本较高，操作复杂限制了这些方法在兽医临床中的应用。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的引物、试剂盒及其应用，能够有效地鉴别出布鲁氏菌流行株与s2疫苗株。为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的引物，所述引物组包括两条外引物f3和b3；两条内引物fip和bip，所述内引物fip具有seqidno.1所示的核苷酸序列；所述内引物bip具有seqidno.2所示的核苷酸序列；所述外引物f3具有seqidno.3所示的核苷酸序列；所述外引物b3具有seqidno.4所示的核苷酸序列。本发明提供了一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的试剂盒，包括上述方案所述的引物组、mgso4溶液、dntp溶液、甜菜碱溶液、bstdna酶溶液和去离子水。优选的，所述外引物和内引物的浓度独立的为25μm/l；所述mgso4的浓度为6mmol/l；所述dntp的浓度为7mmol/l；所述甜菜碱的浓度为3mmol/l。优选的，每25μl反应体系中包括如下组分：所述的外引物f3和b30.4μl、所述的内引物fip和bip2.8μl，mgso42.5μl、dntp1.75μl、甜菜碱2.0μl、bstdna酶1μl和余量的去离子水。本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒鉴别布鲁氏菌新疆流行株与s2疫苗株的检测方法，包括如下步骤：1)提取待测菌dna，得到dna模板；2)将所述步骤1)的2μldna模板与引物组、mgso4溶液、dntp溶液、甜菜碱溶液、bstdna酶溶液和去离子混合，进行lamp反应，反应结束后判断检测结果；所述lamp反应的条件为：在64.1～64.9℃恒温扩增60min后升温至80～81℃终止反应。优选的，所述步骤2)中扩增的温度为64.7℃。优选的，所述步骤2)中在80.5℃终止反应。优选的，所述步骤2)中判断检测结果的方法为：采用3％琼脂糖凝胶电泳进行检测。优选的，所述步骤2)中将dna模板与引物组、mgso4溶液、dntp溶液、甜菜碱溶液、bstdna酶溶液和去离子水混合时还包括加入1μl钙黄绿素，反应终止后通过颜色变化判断检测结果。本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌新疆流行株与s2疫苗株中的应用。本发明提供了一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的引物、试剂盒及其应用。本发明中，采用lamp法进行鉴别，操作简单，快捷，在1h左右即可完成。采用本发明提供的方法特异性好、灵敏度高，实施例结果表明：采用lamp鉴别方法检测大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌等均为阴性，而布鲁氏菌新疆流行株为阳性。lamp法的检测极限在7.5fg/μl左右，而pcr方法的检测极限为7.5pg/μl，实验结果表明本发明提供的方法的灵敏性为pcr方法的1000倍。同时，本发明提供的引物设计合理，在特定反应体系及反应条件下进行扩增，使凝胶条带清晰，成功率高。附图说明图1为实施例1中布鲁氏菌属内lamp特异性电泳检测图(图1中m:dnamarker500；1:阴性对照；2为布鲁氏菌027株阳性对照；3为布鲁氏菌s2株；4为布鲁氏菌m5株)；图2为实施例1中布鲁氏菌027株与苍白杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌及链球菌lamp特异性电泳检测图(图2中m:dnamarker500；2:布鲁氏菌027株；3为链球菌；4为大肠杆菌；5:沙门氏菌)；图3为实施例1中采用钙黄绿素验证lamp特异性图(图3中1:s2；2为布鲁氏菌027株阳性对照；3为沙门氏菌；4为大肠杆菌；5为m5；6为苍白杆菌)图4为实施例2中不同浓度样本采用lamp法扩增后的检测电泳(图4中m为dnamarker1000；1为阴性对照；2为75ng/μl；3为7.5ng/μl；4为750pg/μl；5为75pg/μl；6为7.5pg/μl；7为750fg/μl；8为75fg/μl；9为7.5fg/μl；10为750ag/μl；11为75ag/μl；12为7.5ag/μl)；图5为实施例2中不同浓度样本采用pcr法扩增后的检测电泳图(图5中m为dnamarker1000；1为阴性对照；2为75ng/μl；3为7.5ng/μl；4为750pg/μl；5为75pg/μl；6为7.5pg/μl；7为750fg/μl；8为75fg/μl；9为7.5fg/μl；10为750ag/μl；11为75ag/μl；12为7.5ag/μl)；图6为实施例3中采用omp22引物检测布鲁氏菌027株混匀奶样电泳图；图7为实施例3中采用omp22引物检测布鲁氏菌m5株混匀奶样电泳图；图8为实施例3中采用omp22引物检测布鲁氏菌s2株混匀奶样电泳图；图9为实施例3中采用omp22引物检测pbs混匀奶样电泳图；图10为实施例3中采用lamp法检测检测布鲁氏菌027株混匀奶样电泳图；图11为实施例3中采用lamp法检测检测布鲁氏菌m5株混匀奶样电泳图；图12为实施例3中采用lamp法检测检测布鲁氏菌s2株混匀奶样电泳图；图13为实施例3中采用lamp法检测检测pbs混匀奶样电泳图；图14为实施例3中采用pcr法检测检测布鲁氏菌027株混匀奶样电泳图；图15为实施例3中采用pcr法检测检测布鲁氏菌m5株混匀奶样电泳图；图16为实施例3中采用pcr法检测检测布鲁氏菌s2株混匀奶样电泳图；图17为实施例3中采用pcr法检测检测pbs混匀奶样电泳图。具体实施方式本发明提供了一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的引物，所述引物组包括两条外引物f3和b3；两条内引物fip和bip，所述内引物fip具有seqidno.1所示的核苷酸序列；所述内引物bip具有seqidno.2所示的核苷酸序列；所述外引物f3具有seqidno.3所示的核苷酸序列；所述外引物b3具有seqidno.4所示的核苷酸序列。在本发明中，所述内引物fip具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：tgagaacttgaacgcggccagtcgccatggcttcaatgc。在本发明中，所述内引物bip具有seqidno.2所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：ttgttcgaaacggttgctgcccgagggacgcatagacgata。在本发明中，所述外引物f3具有seqidno.3所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：ccgaggttctgccttcc。在本发明中，所述外引物b3具有seqidno.4所示的核苷酸序列ctggagcgtcttcttgtcg。本发明提供了一种lamp法鉴别布鲁氏菌新疆流行株与s2疫苗株的试剂盒，包括上述方案所述的引物组、mgso4溶液、dntp溶液、甜菜碱溶液、bstdna酶溶液和去离子水。在本发明中，所述外引物和内引物的浓度独立优选为25μm/l。在本发明中，所述外引物和内引物由上海祥音生物科技技术公司合成。在本发明中，所述mgso4的浓度优选为6mmol/l。本发明对所述mgso4的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述dntp的浓度优选为7mmol/l。在本发明中，所述dntp购自北京康为世纪生物科技有限公司。在本发明中，所述甜菜碱的浓度优选为3mmol/l。本发明对所述甜菜碱的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，每25μl反应体系中包括如下组分：上述方案所述的外引物0.4μl、上述方案所述的内引物2.8μl，mgso42.5μl、dntp1.75μl、甜菜碱2.0μl、bstdna酶1μl和余量的去离子水。本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒鉴别布鲁氏菌新疆流行株与s2疫苗株的检测方法，包括如下步骤：1)提取待测菌dna，得到dna模板；2)将所述步骤1)的2μldna模板与引物组、mgso4溶液、dntp溶液、甜菜碱溶液、bstdna酶溶液和去离子混合，进行lamp反应，反应结束后判断检测结果；所述lamp反应的条件为：在64.1～64.9℃恒温扩增60min后升温至80～81℃终止反应。2)将所述步骤1)的2μldna模板、加入上述方案所述的反应体系中，在64.1～64.9℃扩增60min后升温至80～81℃终止反应。本发明提取待测菌dna，得到dna模板。在本发明中，提取待测菌dna的方法优选为采用细菌基因组dna提取试剂盒进行提取。本发明对所述提取试剂盒的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中购自北京天根生物科技股份公司。本发明中，所述提取待测菌dna的方法按照试剂盒说明书进行即可。得到dna模板后，本发明将2μldna模板与引物组、mgso4溶液、dntp溶液、甜菜碱溶液、bstdna酶溶液和去离子水混合，进行lamp反应，反应结束后判断检测结果；所述lamp反应的条件为：在64.1～64.9℃恒温扩增60min后升温至80～81℃终止反应。在本发明中，所述扩增的温度优选为64.7℃。所述终止反应的温度优选为80.5℃。在本发明中，将dna模板加入到反应体系中时优选还包括加入1μl钙黄绿素，反应终止后通过颜色变化判断检测结果。或者通过3％琼脂糖凝胶电泳进行检测判断检测结果。在本发明中，所述钙黄绿素购自北京蓝谱生物科技公司。在本发明中，所述琼脂糖凝胶用琼脂糖粉购自香港bd公司。本发明提供了一种上述方案所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌新疆流行株与s2疫苗株中的应用。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1引物的设计与具体实施方式中的引物设计相同，在此不再赘述，引物序列与具体实施方式中的引物的序列相同，在此不再赘述。配制反应体系：外引物0.4μl、内引物2.8μl，mgso42.5μl、dntp1.75μl、甜菜碱2.0μl、bstdna酶1μl和补加去离子水至25μl。以布鲁氏菌027株为阳性对照，以布鲁氏菌m5株，s2株，沙门氏菌，大肠杆菌，苍白杆菌为实验组，采用细菌基因组dna提取试剂盒提取dna，分别吸取上述得到的dna2μl，分别加入到反应体系中，在64.7℃扩增60min后升温至80.5℃终止反应，通过3％琼脂糖凝胶电泳观察实验结果，具体结果如图1～2所示。由图1和图2可以看出，以苍白杆菌，沙门氏菌，大肠杆菌及链球菌基因组dna为扩增模板时未出现梯形条带，而布鲁氏菌027株，m5株出现较为明显的梯形条带。在布鲁氏菌属内，可以鉴别区分布鲁氏菌s2株与布鲁氏菌027株，但不能鉴别布鲁氏菌027株与m5株。而以苍白杆菌，沙门氏菌，大肠杆菌，链球菌为扩增模板，却无梯形条带出现，实验结果表明：本发明提供的检测方法特异性好。同时，分别吸取2μl各组dna，分别吸取1μl钙黄绿素，分别加入到反应体系中，同时设置以无rna水为模板的阴性对照。在64.7℃扩增60min后升温至80.5℃终止反应，在紫外灯下照射，检测试验结果，具体结果如图3所示。由图3可以看出，在紫外灯下照射发现阳性对照与m5株为黄绿色，而s2株与其他阴性对照菌株与阳性对照颜色差异特别明显。实验结果表明：本发明提供的检测方法能够有效检测出布鲁氏菌新疆流行株，检测方法特异性好。实施例2采用无rna酶水对被检测基因质粒10倍梯度稀释至7.5ag/μl后，以各稀释度的质粒为模板采用实施例1的反应条件进行lamp扩增，反应结束后采用3％琼脂糖凝胶电泳，检测lamp法的灵敏性，具体检测结果如图4所示。由图4可以看出，经3％琼脂糖凝胶电泳后，梯形条带从75ng/μl的稀释度至7.5fg/μl稀释度明亮度依次降低。当稀释度为7.5fg/μl梯形条带几乎消失，实验结果表明本发明提供的lamp法的检测极限在7.5fg/μl左右。同时使用外引物用pcr法进行检测。pcr方法的反应体系如表1所示，具体反应条件如表2所示。反应结束后采用3％琼脂糖凝胶电泳检测pcr法的灵敏性，具体检测结果如图5所示。由图5可以看出，采用pcr法的检测极限为7.5pg/μl。由图4和图5比较可知，本发明提供的lamp法的灵敏性为pcr方法的1000倍。表1pcr反应体系表2pcr反应条件温度循环数时间95℃15min94℃1min59℃3030s72℃20s72℃110min4℃11min实施例3分别吸取200μl已鉴定过无布鲁氏菌核酸的新鲜牛奶，分别与20μl布鲁氏菌027株，m5株，s2株与pbs混匀。提取基因组dna，采用提取的基因组dna为扩增模板。使用omp22引物(所述omp22的正向引物具有seqidno.5所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：tgatgggagggaccgacta；所述omp22的反向引物具有seqidno.6所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：tggttcttcaggttgttacgc)，采用上述提取的基因组dna为扩增模板进行扩增，验证待测液中是否含有布鲁氏菌。具体反应体系如表3所示，具体反应条件如表4所示。具体检测结果如图6～9所示。由图6～9可以看出：027组、m5组与s2组均出现526bp大小的条带与预期条带大小一致。实验结果表明：027组、m5组和s2组均含有布鲁氏菌。在检测pbs组混匀奶样时，无条带出现，实验结果表明pbs组无布鲁氏菌。表3omp22pcr反应体系(25μl)组分用量无rna酶水9.7μl上游引物0.4μl下游引物0.4μl模板2.0μlmix12.5μl表4omp22pcr反应条件提取的基因组dna为扩增模板，采用实施例1的扩增条件与反应体系进行lamp反应，反应结束后采用3％琼脂糖凝胶电泳检测结果，具体如图10～13所示。由图10～13可以看出：采用本发明提供的lamp法检测混匀奶样时，检测布鲁氏菌027组与m5组时出现梯形条带，而检测布鲁氏菌s2组与pbs组时未出现梯形条带。同时，采用f3，b3为引物采用pcr法进行检测，具体反应体系如表5所示，具体反应条件如表6所示。具体检测结果如图14～17所示。由图14～17可以得出：布鲁氏菌027组与m5组213bp大小的条带与预期条带大小一致。s2组与pbs组无条带出现。实验结果表明：混匀奶样中无布鲁氏菌流行株027株存在。本发明提供的lamp法与pcr法检测含有布鲁氏菌027株、m5株、s2株与pbs混匀奶样的检测结果相一致。实验结果表明：本发明提供的方法能够有效鉴别布鲁氏菌027株与s2株。表5pcr反应体系组分用量无rna酶水9.7μl上游引物0.4μl下游引物0.4μl模板2μlmix12.5μl表6pcr反应条件以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>石河子大学<120>一种lamp法鉴别布鲁氏菌流行株和s2株的引物、试剂盒及其应用<130>gw2018i2555<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgagaacttgaacgcggccagtcgccatggcttcaatgc39<210>2<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttgttcgaaacggttgctgcccgagggacgcatagacgata41<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccgaggttctgccttcc17<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctggagcgtcttcttgtcg19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgatgggagggaccgacta19<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tggttcttcaggttgttacgc21当前第1页12