一对检测伯杰氏菌属的特异性引物、试剂盒及PCR检测方法与流程

本发明涉及一种细菌的检测方法，具体涉及一对检测伯杰氏菌属的特异性引物、试剂盒及pcr检测方法。

背景技术

伯杰氏菌属(bergeyella)是一种革兰氏阴性、不形成芽孢、氧化酶阳性的非发酵细菌，于1994年由vandamme提议设立。目前伯杰氏菌属(bergeyella)包括两个种，即动物溃疡伯杰氏菌(bergeyellazoohelcum)和猪伯杰氏菌(bergeyellaporcorum)。

动物溃疡伯杰氏菌主要存在于猫、狗或者其他哺乳动物口腔或者鼻腔微生物菌群中。2002年，a.decostere等，第一次报道动物溃疡伯杰氏菌与猫呼吸道病有关。在被狗或者猫咬伤后，动物溃疡伯杰氏菌可能会引发稀少而严重的人类临床病，例如导致蜂窝组织、腿脓肿、败血症等。

2016年，西班牙学者l.zamoraa等人，从3头病猪的肺脏组织和1头健康猪的扁桃体中，分离出4株革兰氏阴性，接触酶和氧化酶试验均为阳性的杆状细菌。通过形态学和生化试验鉴定，判定分离的4株细菌归属为伯杰氏菌属。通过16srrna基因同源性比较、主要脂肪酸测定、dna中g+c含量测定，表明新分离的4株细菌与先前的动物溃疡伯杰氏菌不属于同一个种，认定其是伯杰氏菌属中一个新种，命名为猪伯杰氏菌(bergeyellaporcorum)。

2018年，m.lorenzodearriba等报道从8个商业化猪场和一个野猪场，采集鼻拭子接种巧克力琼脂，分离出29株伯杰氏菌，共鉴定为11个基因类型。研究表明这些伯杰氏菌具有血清补体耐受性和抗吞噬作用，表明来自鼻腔伯杰氏菌分离株在体外具有某些致病性特征。药敏试验表明，在11个基因型中有9个基因型具有多重耐药性，其中包括一个分离自从来没有使用过抗菌药物的野猪场的基因型。

目前，针对伯杰氏菌属鉴定主要是通过染色镜检、生化试验、16srrna基因测序和比对等鉴定，十分繁琐与费时，成本昂贵，因此急需建立一种快速、简便的诊断方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一对检测伯杰氏菌属的特异性引物、试剂盒及pcr检测方法，该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一对检测伯杰氏菌属的特异性引物，包括上游引物bergeyella-f：5’-ttgaaagctccggcggatag-3’和下游引物bergeyella-r：5’-accctcacgagagtaggttt-3’。

伯杰氏菌属包括猪伯杰氏菌、动物溃疡伯杰氏菌。

一种伯杰氏菌属的pcr检测试剂盒，包括上游引物bergeyella-f：5’-ttgaaagctccggcggatag-3’和下游引物bergeyella-r：5’-accctcacgagagtaggttt-3’。

一种伯杰氏菌属的pcr检测试剂盒，还包括2×taqpcrmastermix、去离子水。

一种伯杰氏菌属的pcr检测试剂盒在检测伯杰氏菌属中的应用。

一种伯杰氏菌属的pcr检测方法，包括以下步骤：提取待测菌种样品的dna，作为模板；以提取的dna为模板，利用引物进行pcr扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳，根据条带分析结果。

pcr体系组成为：2×taqpcrmastermix10.0μl，10μm上、下游引物各0.5μl，dna模板1.0μl，去离子水8μl。

pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

当pcr扩增产物条带为266bp时，则检测样品为伯杰氏菌。

本发明从genbank数据库中下载链球菌、猪丹毒杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、猪伯杰氏菌、动物溃疡伯杰氏菌16srrna基因序列，通过mega5.05软件进行序列比对，经反复比较和观察，寻找伯杰氏菌16srrna特异性序列，然后以genbank数据库中伯杰菌d658菌株16srrna基因部分序列(登录号nr_104718.1)作为参考序列，选择该基因片段170bp-201bp位点序列作为上游引物设计选择序列和419bp-450bp位点序列作为下游引物设计选择序列，利用primer-blast设计仅能扩增伯杰氏菌一对特异性引物，建立一种伯杰氏菌属pcr快速检测方法，能够鉴定伯杰氏菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)快速、简便：相比染色镜检、生化鉴定以及16srrna基因测序和同源性比对，伯杰氏菌属pcr检测方法鉴定伯杰氏菌更加快速，这个鉴定过程不超过4h。如果仅仅采用染色镜检形态学鉴定伯杰氏菌，耗时而且还不准确。如果采用生化试验鉴定，一般需要耗时1～2d，除了耗时，操作繁琐，劳动力量大，要求购买试剂多，成本昂贵。16srrna基因测序和同源性比对，同样需要专业公司帮助测序，期间耗时大约2～5d，测序数据分析需要专业人员。

(2)灵敏度高：利用紫外线，测定提取细菌dna模板。将测定动物溃疡伯杰氏菌和猪伯杰氏菌dna模板浓度分别为53.2μg/ml和89.6μg/ml，使用去离子水，按照10倍稀释倍数进行稀释，稀释度分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11，10^-12。然后，将上述各稀释度的dna溶液分别取一定量作为pcr反应模板，检测最低检测下限。通过实验，结果表明动物溃疡伯杰氏菌和猪伯杰氏菌dna模板最低检测浓度分别为5.32×10^-3pg/μl和8.96×10^-1pg/μl，即最低检测dna量分别为5.32×10^-3pg和0.896pg。

(3)特异性强：利用建立的伯杰氏菌pcr检测方法，对从猪内分离10株动物溃疡伯杰氏菌和1株猪伯杰氏菌进行pcr扩增，全部检测为阳性，阴性对照无扩增条带。对大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、副猪嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、巴氏杆菌、链球菌、猪丹毒杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、气单胞菌进行检测，均为阴性。研究结果表明，建立的伯杰氏菌pcr检测方法仅能扩增出伯杰氏菌，而不能扩增其他细菌，具有较强的特异性。

附图说明

图1为本发明的伯杰氏菌pcr检测方法对分离鉴定、保存的11株伯杰氏菌的检测结果。图中，1为分子dnamaerker2000；2-12分别为yld7，sqt1，dc-10，dj-5，dy-10，dy-8，sqt6，js2-4，xcsf，zwsf，fqwf2；13为去离子水作阴性对照。

图2为本发明的伯杰氏菌pcr检测方法的特异性检测结果。图中，1为分子dnamaerker2000；2-11分别为大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、副猪嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、巴氏杆菌、链球菌、猪丹毒杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、气单胞菌，12为伯杰氏菌；13为去离子水作阴性对照。

图3为本发明的动物溃疡伯杰氏菌pcr检测方法的灵敏度检测结果。图中，1为分子dnamaerker2000；2-13分别为dna稀释度10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11，10^-12；14为去离子水作阴性对照。

图4为本发明的猪伯杰氏菌pcr检测方法的灵敏度检测结果。图中，1为分子dnamaerker2000；2-13分别为dna稀释度10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11，10-12；14为去离子水作阴性对照。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、伯杰氏菌属的pcr检测方法建立

1.1引物设计

本发明从genbank数据库中下载链球菌、猪丹毒杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、猪伯杰氏菌、动物溃疡伯杰氏菌的16srrna基因序列，通过mega5.05软件进行序列比对，寻找伯杰氏菌16srrna特异性序列，然后以genbank数据库中伯杰菌d658菌株16srrna基因部分序列(登录号nr_104718.1)作为参考序列，选择该基因片段170bp-201bp位点序列作为上游引物设计选择序列和419bp-450bp位点序列作为下游引物设计选择序列，利用primer-blast设计仅能扩增伯杰氏菌一对特异性引物，具体如下：

上游引物bergeyella-f：5’-ttgaaagctccggcggatag-3’(seqidno.1)

下游引物bergeyella-r：5’-accctcacgagagtaggttt-3’(seqidno.2)

1.2dna模板提取

dna模板提取为常规方法，本发明采取煮沸法提取。具体步骤，首先挑取分离培养的单菌落，接种于胰蛋白胨大豆琼脂肉汤(含有体积浓度5％的犊牛血清和浓度10μg/ml的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad))，37℃培养18h～24h，取1ml培养物，加入1.5ml灭菌ep管中，12000rpm离心1min，弃去上清后，加入去离子水，涡旋30s，封口胶密封后，水浴煮沸10min，放入-20℃冰箱5min，12000rpm离心2.5min，取上清作为pcr扩增模板。

同时设置去离子水作为阴性模板。

1.3pcr扩增

pcr体系组成为：2×taqpcrmastermix10.0μl，10μm上、下游引物各0.5μl，dna模板1.0μl，去离子水8μl。

pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

1.4电泳分析

琼脂糖凝胶板制备，按照1.5％的比例配制琼脂糖凝胶。用分析天平称取0.5g琼脂糖，加入到50ml1×tae稀释液中摇匀，微波炉加热90s使其完全溶解，将5μl核酸染料加入溶液后混匀，放置大制胶板于胶槽中，插入适当齿数梳子，倒入溶液于胶槽中，室温冷却静置20min，待凝固后，两边同时拔掉梳子，除去边缘多于凝胶，制备即完成。

电泳及鉴定检测，将制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽中，加入1×tae稀释液使其覆盖于胶板上。开始加样，先加dl2000dnamarker5μl，之后依次加入待检样品扩增产物6μl，最后加入阴性对照扩增产物6μl。接下来电泳，按照一定恒定电压进行核酸电泳，电泳时间一般为30～60min即可停止。通过凝胶成像系统，观察各待测样品扩增条带，分析鉴定结果。

根据样品pcr扩增产物结果，做出诊断判定。当去离子水作为阴性模板，无扩增条带，待检样品扩增目的条带为266bp，判定为阳性；当去离子水作为阴性模板，待检样品无扩增条带，判定为阴性；当去离子水作为阴性模板，有扩增条带(无论条带大小)，待检样品是否出现目的条带，均需要重做。

本发明伯杰氏菌属的pcr检测试剂盒包括：上游引物bergeyella-f、下游引物bergeyella-r、2×taqpcrmastermix、去离子水。

实施例2、检测方法验证

利用建立伯杰氏菌pcr检测方法，对发明人分离鉴定、保存的11株伯杰氏菌(其菌株分别命名为yld7，sqt1，dc-10，dj-5，dy-10，dy-8，sqt6，js2-4，xcsf，zwsf，fqwf2)进行检测，其中fqwf2为猪伯杰氏菌，其他为动物溃疡伯杰氏菌。结果表明，11株伯杰氏菌pcr扩增条带均为266bp大小，即扩增结果为阳性(图1)。进一步说明所建立伯杰氏菌pcr检测方法能够对分离保存的伯杰氏菌进行检测。

实施例3、特异性检测

以动物溃疡伯杰氏菌以及10种常见细菌为检测样品，对所建立伯杰氏菌pcr检测方法进行特异性检测。10种细菌分别为大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、副猪嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、巴氏杆菌、链球菌、猪丹毒杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、气单胞菌。结果表明，所建立伯杰氏菌pcr检测方法，检测动物溃疡伯杰氏菌为阳性，其他10种常见细菌均为阴性(图2)。进一步说明，所建立的伯杰氏菌pcr检测方法，特异性强，仅伯杰氏菌检测为阳性，其他非伯杰氏菌检测为阴性。

实施例4、灵敏度检测

所建立的伯杰氏菌灵敏度检测时，首先测定所提取动物溃疡伯杰氏菌和猪伯杰氏菌dna浓度分别为53.2μg/ml、89.6μg/ml，然后分别按照10倍梯度依次稀释，稀释度均分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11，10^-12，将上述稀释好的伯杰氏菌dna分别作为pcr扩增模板。扩增结果(图3、图4)表明，当动物溃疡伯杰氏菌和猪伯杰氏菌，分别按照10⁷和10⁵倍数稀释后为最低检测浓度，即为5.32×10^-3pg/μl和8.96×10^-1pg/μl；由于每个pcr扩增反应加dna模板量为1μl，因此，动物溃疡伯杰氏菌和猪伯杰氏菌最低检测dna量为5.32×10^-3pg和0.896pg，表明所建立的pcr检测方法十分敏感。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河南牧业经济学院

<120>一对检测伯杰氏菌属的特异性引物、试剂盒及pcr检测方法

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