本发明涉及一种基于副溶血性弧菌的直接溶血素基因(tdh)双重pcr检测试剂盒在非诊断非治疗性的鉴别并区分副溶血性弧菌的用途。
背景技术：
：副溶血性弧菌(vibrioparahemolyticus，vp)如今已成是中国乃至全世界范围内尤为关注的食源性致病菌，主要是通过人类食用受该菌污染的水源及水产品而造成食物中毒，能够引发急性肠胃炎，重者可引发败血症甚至危及人的生命。在影响人类健康的同时也制约着水产品养殖业的发展。从中国食源性疾病监测网上查证的数据表明，由副溶血性弧菌引发食物中毒事件已经高过了其他类型的致病性弧菌的比例，在某些沿海城市由副溶血性弧菌引发的食物中毒现象比例高达60％以上，远远高于其他类型食源性致病菌。随着检测技术不断进步，研究人员开始关注能够引起食物中毒或临床检出占比最高的的副溶血弧菌“大流行菌群”，并通过各种技术手段进行区分和归类，从而进一步分析流行病学情况。如今，全世界的研究者对vp毒力因子及致病机理取得了长足的进步，通过现代生物学技术对vp毒力因子，包括黏附因子、侵袭因子、产耐热直接相关溶血素(thermostabledirectrelatedhemolysin，trh)、产耐热直接溶血素(thermostabledirecthemolysin，tdh)、不耐热溶血素(thermolabilehemolysin.tlh)、尿素酶、脂多糖、外膜蛋白、蛋白酶、ⅲ型分泌系统和摄铁系统等都有了更具体的认识。目前用于检测副溶血弧菌的pcr体系较多。利用普通pcr方法对vp的靶基因进行检测，大部分情况下选择vp的trh或tdh基因的保守序列，其他还有toxr基因序列、gyrb基因序列和pr72h基因序列。然而，这些pcr检测方法在实验的灵敏度、特异性、抗干扰的能力上或多或少存在局限性。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于副溶血性弧菌的直接溶血素基因(tdh)及不耐热溶血素(tlh)的双重pcr检测试剂盒在非诊断非治疗性的鉴别并区分副溶血性弧菌的用途。本发明根据副溶血性弧菌的流行株特征性位点(tdh1_368)和tlh基因，建立优化双重pcr检测试剂盒，首次实现国内单一指标同时检测副溶血性弧菌流行与非流行菌群。具体是以tlh筛查样本中是否存在副溶血性弧菌、以tdh中特异性位点tdh1_368设计的引物对vp“大流行菌群”检测，从而通过一次性扩增区分副溶血性弧菌流行群与非流行群，显著提高常规流行株检测的灵敏性及特异性，简便有效。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本发明涉及一种双重pcr检测试剂盒在非诊断非治疗性的鉴别并区分副溶血性弧菌流行菌群与非流行菌群的用途，所述检测试剂盒包括序列如seqidno.1、seqidno.2所示的直接溶血素基因检测用引物对，以及序列如seqidno.3、seqidno.4所示的不耐热溶血素检测用引物对；所述检测试剂盒还包括primestarmaxdnapolymerase预混液和无菌双蒸水。作为优选方案，所述检测试剂盒的工作条件为：95℃预变性3min；接着进行热循环29次，过程包括95℃变性30s；62℃退火1min；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，12℃维持至产物检测。第二方面，本发明还涉及一种双重pcr检测试剂盒在非诊断非治疗性地鉴别粪便样品中副溶血性弧菌流行菌群的用途，所述检测试剂盒包括序列如seqidno.1、seqidno.2所示的直接溶血素基因检测用引物对，以及序列如seqidno.3、seqidno.4所示的不耐热溶血素检测用引物对；所述检测试剂盒还包括primestarmaxdnapolymerase预混液和无菌双蒸水。作为优选方案，所述检测试剂盒的工作条件为：95℃预变性3min；接着进行热循环29次，过程包括95℃变性30s；62℃退火1min；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，12℃维持至产物检测。第三方面，本发明还涉及一种双重pcr检测试剂盒在非诊断非治疗性地鉴别水产样品中副溶血性弧菌的用途，所述检测试剂盒包括序列如seqidno.1、seqidno.2所示的直接溶血素基因检测用引物对，以及序列如seqidno.3、seqidno.4所示的不耐热溶血素检测用引物对；所述检测试剂盒还包括primestarmaxdnapolymerase预混液和无菌双蒸水。作为优选方案，所述检测试剂盒的工作条件为：95℃预变性3min；接着进行热循环29次，过程包括95℃变性30s；62℃退火1min；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，12℃维持至产物检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明提供的dpcr检测试剂盒，通过实验室保存对照菌株的灵敏性实验显示对副溶血性弧菌大流行菌群最低检出为1.5ng/μl，特异性实验显示无非特异性靶基因扩增，实验检测周期为3小时。2、经本发明的dpcr检测试剂盒现场检测应用，在266件临床腹泻病例粪便标本中分离副溶血性弧菌31株，阳性率11.7％，其中经dpcr确认的副溶血性弧菌的大流行株为29株，构成比为93.5％；经血清分型共获得4种副溶血性弧菌血清型：o3：k6有22株；o4：k68有7株，均符合已知的国内外副溶血性弧菌流行株的表型特征；其余的非流行株为：o4：kut1株；o3：k51株。3、经本发明的dpcr检测试剂盒现场检测应用，在流行季节对30份市售水产品的分离和dpcr检测结果显示，有20份样品存在副溶血弧菌株阳性基因，其中1份扇贝样品确认存在tdh1_368核酸片段，显示海鲜中贝壳类的扇贝具有富集副溶血性弧菌流行克隆的可能；而使用常规分离方法(gb4789.7—2013)，经选择性增菌培养后，在30份市售水产品分离到20株副溶血弧菌菌，经dpcr确认均不符合副溶血性弧菌大流行株基因特征。4、本发明提供的dpcr检测试剂盒，能快速筛查和识别临床粪便标本和食品标本中是否存在副溶血性弧菌“大流行菌群”；具体来说，利用传统方法分离鉴定副溶血弧菌大流行株需要5-6天时间，且耗费的人工和材料成本较高，而利用本发明的dpcr试剂盒进行筛选检定，可缩短为1-2天时间，若作为定性试验只在24h内即可完成，同时可以大大节省人力成本和材料消耗。5、本发明提供的dpcr检测试剂盒，可排除杂菌干扰，替代多个副溶血性弧菌毒力基因检测，以tlh筛查样本中是否存在副溶血性弧菌、以tdh1_368筛查样本中是否存在副溶血性弧菌“大流行菌群”，从而通过一次性扩增区分副溶血性弧菌流行群与非流行群，这有助于提高常规流行株检测的灵敏性及特异性，简便有效；另外，该试剂盒可对散发病例进行快速甄别，辅以血清学及分子分型等手段便于发现新的流行趋势。6、本发明提供的dpcr检测试剂盒，能够满足传统方法对于食品中副溶血性弧菌的定性要求，同时能对由食源性引起的临床副溶血性弧菌流行情况进行精准监测，这较传统方法更为高效、准确和价廉，便于进一步对副溶血性弧菌开展深入研究。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为退火温度优化结果示意图；图2为引物配比优化结果示意图；图3为表6中临床分离vp流行菌株1-15对应的种内特异性试验结果示意图；图4为表6中临床分离vp非流行菌株16-30对应的种内特异性试验结果示意图；图5为表7中菌株1-11对应的种间特异性试验结果示意图；图6为表7中菌株12-18对应的种间特异性试验结果示意图；图7为灵敏度试验结果示意图；图8为人工染菌试验结果示意图；图9为对30份水产品进行dpcr检测初筛的结果示意图；图10为对初筛结果为tlh(+)挑取单个菌落进行dpcr复核的结果示意图；其中，4-1～4-10为初筛tlh(+)、tdh1_368(+)同一平板上的10个单菌落。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例本实施例涉及一种基于副溶血性弧菌的直接溶血素基因(tdh)及不耐热溶血素(tlh)的双重pcr检测试剂盒及其检测体系。具体包括如下步骤：1.1dpcr体系建立1.1.1引物设计和dpcr体系构建参照特异性编码基因tlh序列和副溶血性弧菌大流行菌株编码基因tdh1_368，设计特异性引物，如表1所示。引物序列通过blast在线与genbank数据库进行比对，没有发现与其他物存在非特异结合。tlh和tdh1_368目的条带大小分别为:450bp、208bp，通过primerblast的验证，dpcr体系能同时识别大流行菌群tdh1_368和非大流行的副溶血弧菌序列。1.1.2双重pcr反应条件优化考虑到tdh1_368的上游引物3'末端有2个碱基匹配率不高，故选择primestarmaxdnapolymeras，因其有3'-5'外切酶活性，在引物3'末端结合不好的情况下，可以通过酶活性发挥作用，提高扩增效率，primestarmaxdnapolymerase的保真性是taqdnapolymerase的10倍，另对反应体系中退火温度、引物浓度组合等因素进行试验优化，具体见表2-4。表2表3表4其中，退火温度优化试验对应的电泳图如图1，引物配比优化的电泳图如图2所示；最终优化的pcr反应体系如下表5所示：表5反应体系体积(μl)primestarmaxdnapolymerase预混液12.5tlh上游引物(10μm)1tlh下游引物(10μm)1tdh1_368上游引物(10μm)1tdh1_368下游引物(10μm)1无菌双蒸水7dna模版1.5选择primestarmaxdnapolymerase预混液，反应条件为95℃3min，接着进行热循环29次，过程包括(95℃变性30s；62℃退火1min；72℃延伸1min)，72℃延伸5min，12℃维持至产物检测。1.1.3dna模板制备对菌株复苏后，接种于血平板培养18～24h，挑取2-3个单个菌落同100μl灭菌去离子水研磨混匀，95℃10min，12000r/min离心，5min，取上清液体作为dna模板。1.1.4pcr扩增dpcr体系总体积为25μl，其中pcr预混液12.5μl，dna模版1.5μl，tlh和tdh1_368上下游引物各1μl，用灭菌去离子水补足体系至25μl。dpcr体系94℃预变性3min；95℃变性30s，根据不同引物设置温度退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸3min，12℃维持至产物检测，各对引物退火温度见表1。1.1.5电泳取dpcr产物5μl加入10×loadingbuffer2μl，然后加于1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.1μg/ml)中，电泳缓冲液为0.5×tbe，电压为6v/cm。电泳30min后将凝胶置紫外灯下成像。1.1.6种间与种内特异性试验根据此前体系优化后反应条件及引物配比和浓度，以灭菌去离子水水为空白对照，对表6、7中副溶血性弧菌和其他菌株的基因组dna，以上述步骤1.1.3-1.1.5条件进行pcr扩增及电泳成像，另分别以tdh、trh和gs-pcr引物pcr进行检定(见表1)，以灭菌去离子水补足体系。其中，表6中副溶血性弧菌菌株均为上海市疾病预防控制中心收集和保存，共30株腹泻病人临床分离株，用以dpcr种内特异性的验证，包含15株为流行株，15株为非流行株。对应的种内特异性试验的dpcr扩增电泳图如图3、4所示。表7中副溶血性弧菌大流行株等相关标准菌株对应的种间特异性试验结果如图5(1为vp大流行菌株、2为vp非流行菌株、3为vp标准菌株)、图6所示，dpcr对副溶血性弧菌流行与非流行菌株均有阳性扩增，其他种属菌株均无扩增，dpcr结果显示较好的种间特异性。1.1.7灵敏度试验选取质控菌株中副溶血性弧菌大流行株，复苏后刮取菌落用灭菌双蒸水配成菌悬液，活菌稀释菌落计数后，再以灭菌双蒸水对副溶血性弧菌大流行株进行10-3～10-8cfu/ml的稀释。从各稀释度中取100ul，用于核酸浓度检测，确认核酸浓度呈10倍梯度稀释，且具备dpcr反应条件后，按1.1.3-1.1.5步骤完成dpcr检测，进行灵敏度评价。结果如图7所示，结果显示150ng/μl、15ng/μl、1.5ng/μl均有较好扩增条带，dna模板浓度为0.15ng/μl时未出现完整扩增条带，因此判定dpcr对副溶血性弧菌大流行株最低检出为1.5ng/μl。1.1.8人工染菌实验选取质控菌株中副溶血性弧菌大流行株经3％nacl营养琼脂平板18h纯培养后，用灭菌pbs做10倍列稀释，选取10-4、10-5、10-6倍稀释度进行平板计数，得出纯培养的原始浓度。经稀释后，选取初始浓度分别为10cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml的vp大流行株菌液各1ml，分别加入在25g生鱼肉、青口贝两种样品(两种样品经gb/t4789.7—2013法检测为vp阴性)中，再加入到225mlapw，另外多一份加1ml生理盐水作为空白对照。在37℃、150r/min条件下，将污染样品置于摇床上进行振荡培养。前增菌后4、6、8、10、18h，分别取培养液1ml，采用1.1.3中的方法进行细菌基因组dna提取，取1.5μl作为模板进行dpcr检测，试验重复3次。apw增菌液培养的青口贝和生鱼肉样品，经过dpcr检测结果表明，当样品中副溶血性弧菌大流行菌株初始浓度为103cfu/ml时，增菌4h后可检出核酸片段，在增菌6h后可通过tcbs平板分离获得菌落；当初始浓度为102cfu/ml、10cfu/ml增菌8h后可检出并通过tcbs平板分离获得菌落，见图8。1.2临床粪便标本应用评价试验临床粪便标本参照《感染性腹泻诊断标准》(ws271-2007)进行样本处理及通过dpcr方法对副溶血性弧菌大流行菌群进行检测。1.2.1副溶血弧菌分离及生化检定1.2.1.1分离培养将沾有粪便标本的棉拭子转种至8ml～10ml氯化钠结晶紫培养液或3％氯化钠碱性蛋白胨水中，置36℃±1℃培养6h～8h后(可适当延长增菌培养时间至12h～16h)，取一接种环，划线接种于tcbs平板或弧菌显色平板，于37℃培养18h～24h后观察有无可疑菌落。1.2.1.2分离纯化挑取tcbs上绿色、中等大小的可疑菌落(注意从培养箱取出平板后，应尽快挑取该平板上的目标菌，否则可疑菌落会变粘稠，不易挑取)，或科玛嘉弧菌显色平板上紫色、中等大小的可疑菌落，接种于3％nacl胰蛋白胨大豆琼脂平板，置37℃24h进行纯培养。1.2.1.3氧化酶试验：用牙签或塑料的一次性接种环取生长在营养琼脂小斜面或其他非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加氧化酶试剂(1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液)，如培养物在1min～2min内出现粉红-紫红-紫蓝色，有的最后呈紫黑色，则判断为氧化酶试验阳性，培养物不显色判为阴性。，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。注：取标本时避免接触含铁物质或使用含铁的接种环，以免出现假阳性。同时该实验应用相关标准菌株作为阳性、阴性对照。1.2.1.4生化初筛：选取纯培养的单个菌落接种在3％nacl三糖铁琼脂斜面并低层穿刺，37℃24h后观察结果。若底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深为副溶血性弧菌典型生化特征。1.2.1.5嗜盐性试验：选取纯培养的单个菌落接种在0、3、6、8、10％的不同nacl浓度的胰蛋白胨水，37℃24h后观察液体混浊情况。1.2.1.6生化鉴定：选用api20e或api20ne梅里埃生化检测卡或全自动微生物生化鉴定仪进行鉴定。按产品操作说明进行操作。1.2.1.7菌株保存生化鉴定结果符合副溶血弧菌的单克隆阳性菌株，经纯培养后，置microbank菌种保藏管中，-70℃冷冻保存待用。1.2.2毒力基因检测1.2.2.1菌株的复苏及dna模版的制备挑取-70℃冷冻保存的阳性菌株接种血平板，36±1℃培养18-24h后，用无菌棉签刮取原始区适量菌苔，于1.5ml无菌生理盐水尖底离心管中碾磨混匀。4℃，12000rpm离心5min，弃去上清液后，加入100μlte，振荡混匀后，放置100℃加热模块中，10min，12000r/m离心5min，取上清液作为dna模版，用于dpcr反应检测毒力基因。1.2.2副溶血性弧菌毒力基因引物对vp“大流行菌群”有关的毒力基因进行检测，毒力基因引物及退火温度见表1。采用上述优化后的pcr反应体系进行检测，检测步骤同1.1.4-1.1.5。6家哨点医院2016年6-9月间腹泻患者临床粪便标本266件中，共检出副溶血性弧菌31株，检出率11.7％，其中大流行株29株，构成比93.5％(29/31)；结果中31株副溶血性弧菌中tlh均为阳性，其中29株tdh1_368检测阳性；同时发现29株tdh1_368检测阳性菌株均为tdh(+)trh(-)gs-pcr(+)菌株，剩余1株为tdh(-)trh(-)gs-pcr(+)菌株，1株为tdh(+)trh(-)gs-pcr(-)菌株。可见引起这6家哨点医院2016年6-9月间腹泻的vp菌株，其毒力基因特征主要是tdh(+)trh(-)gs-pcr(+)菌株，其所占比例达到93.5％。本研究中，tlh和tdh1_368基因的dpcr检测结果符合6家哨点医院抽检样本中所有副溶血弧菌菌株传统方法检测结果，流行菌株的复核结果正确率100％；此外对这31株副溶血性弧菌进行血清学鉴定，共获得4种副溶血性弧菌血清型：o3：k6有22株；o4：k68有7株，均符合已知的国内外副溶血性弧菌流行株的表型特征，其余的非流行株为：o4：kut1株；o3：k51株，如表8：表8临床31株副溶血弧菌菌株毒力基因和血清型1.3市售水产品应用评价1.3.1样品制备市售水产品样品采集后应立即回到实验室进行检验。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；鱼类取表面组织、肠或鳃；甲壳类取动物的中心部分，包括肠和鳃。以无菌操作取样品25g(ml)，加入3％nacl碱性蛋白胨水225ml，于无菌食品袋中击打4分钟，制备成1:10的匀液。1.3.2增菌上述制备好的1:10的匀液于37℃培养18h。1.3.3dpcr操作1.3.3.1分别取培养液1ml，10000r/min离心，5min，使得菌体富集离心管底部，弃去多余增菌液，再加入100μl灭菌去离子水振荡混匀，95℃10min，12000r/min离心，5min，取上清作为dna模板。进行1.1.4所述的pcr扩增。1.3.3.2取pcr产物5μl加入10×loadingbuffer2μl，然后加于1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.1μg/ml)中，电泳缓冲液为0.5×tbe，电压为6v/cm。电泳30min后将凝胶置紫外灯下成相。1.3.4分离1.3.4.1对dpcr结果显示存在副溶大流行株阳性的增菌液，用接种环在增菌液液面以下1-2cm处取一环，然后在tcbs平板上划线分离。一次取样划线一块平板。于37℃培养24h。1.3.4.2从温箱中拿出tcbs平板后，及时挑取典型的菌落。副溶血性弧菌在tcbs平板上呈半透明、圆形、光滑的绿色菌落，用接种环触及类似橡皮糖的质感，直径2～3mm。1.3.5纯培养选取5个或以上的可疑菌落，接种3％nacl胰蛋白胨大豆琼脂平板，37℃培养24h。1.3.6初步鉴定取纯培养物，重复1.1.4dpcr操作步骤，通过dpcr结果鉴定菌株是否为副溶血弧菌大流行菌株。1.3.7确定鉴定对所获得疑似副溶血性弧菌的菌株采用用vitek2全自动微生物生化鉴定系统进行检定，使用trh、tdh、gs-pcr相关检测检定副溶血弧菌大流行株。同步进行《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》gb4789.7—2013操作。对30份样品增菌液进行dpcr扩增，同时以副溶血弧菌：atcc17802(非流行株)、副溶大流行株(实验室分离)和灭菌去离子水分别作阳性和阴性对照。结果显示，20份样品在450bp处扩增出单一的特异性条带；其中扇贝样品在208bp处扩增出单一的特异性条带。此结果表明，20份样品增菌液中存在副溶血性弧菌，而且在扇贝样品增菌液中可能存在副溶血弧菌大流行株，见图9。按照gb4789.7—2013方法同步进行实验，30份样品增菌液在tcbs琼脂上分离培养，20个tcbs平板上发现有蓝色或蓝绿色菌落，其中对于扇贝样本的tcbs平板中挑取10个疑似菌落，转接至科玛嘉培养基上得到紫红色菌落37个。之后对29株在科玛嘉培养基上分离的菌株进行生化鉴定以及双重pcr检测，结果为副溶血性弧菌，见图9、10。dpcr方法显示30份水产品中有20份存在副溶血性弧菌，此结果与传统方法检出结果一致；同时dpcr提示其中扇贝样本存在副溶血性弧菌大流行株存在可能。综上所述，当前对副溶血弧菌大流行株的鉴别的研究目的只有一个，就是通过更为简便的方法能够将副溶血性弧菌大流行菌群进行快速鉴别和检测。但由于环境或食品样本中存在很多不同菌型的副溶血性弧菌，并且tdh或gs-pcr各自呈阳性的菌株能够在同一份标本中，所以传统的检测手段不能满足在原始样品中判定副溶血性弧菌大流行菌群是否存在和相应的占比；本发明建立的副溶血性弧菌dpcr检测试剂盒，通过实验室保存对照菌株的灵敏性实验显示对副溶血性弧菌大流行菌群最低检出为1.5ng/μl，特异性实验显示无非特异性靶基因扩增，实验检测周期为3小时。此外，能同时检测副溶血性弧菌流行与非流行菌群，且经过trh、tdh、gs-pcr的联合验证，无论在种间还是种内都有很好的特异性。本发明进一步对夏秋腹泻病高发季节266件临床粪便标本进行检测发现，该dpcr检测体系可排除杂菌干扰，替代多个vp毒力基因检测，至经过一次pcr扩增就能对副溶血性弧菌流行群与非流行群进行区分。另外，该体系可对散发病例进行快速甄别，辅以血清学及分子分型等手段便于发现新的流行趋势。此外，本发明通过tlh和tdh1形成dpcr单一的指标，可以实现对原始标本或其增菌液进行检测。过程中发现，人工染菌实验经国标法(gb4789.7—2013)可成功分离回收副溶血性弧菌大流行菌株，而随机采样的市售高危水产品经国标法(gb4789.7—2013)无法分离得到副溶血性弧菌大流行菌株，另外双重pcr扩增结果显示水产样品中存在副溶血性弧菌大流行菌群活菌或毒力基因，以上事实表明国标法(gb4789.7—2013)已经无法满足食品中副溶血性弧菌大流行菌群的监测风险评估的要求；而本发明的试剂盒可排除杂菌干扰，替代多个副溶血性弧菌毒力基因检测，以tlh筛查样本中是否存在副溶血性弧菌、以tdh1_368筛查样本中是否存在副溶血性弧菌“大流行菌群”，从而通过一次性扩增区分副溶血性弧菌流行群与非流行群，进而提高了常规流行株检测的灵敏性及特异性，简便有效。当前第1页12当前第1页12