专利名称：快速检测副溶血弧菌的lamp试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，属于食品检测领域。
背景技术：
副溶血性弧菌(又称嗜盐菌Vibrio Parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3% 6%食盐水繁殖迅速，每8 9分钟为I周期，低于O. 5%或高于8%盐水中停止生长。在食醋中I 3分钟即死亡，加热56°C 5 10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌溃品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血
坐寸ο近年来发展起来的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因定性检测方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65°C左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。传统检测副溶血弧菌的培养方法，需要分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4 6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，有较多应用于副溶血弧菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此隳待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，提供一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒及其使用方法。为达到上述目的，本发明采用以下技术方案一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，该试剂盒由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有引物，引物为以下4组特异性引物中的任意一组(I)上游外引物 F3 :5' -ACGCCTCTGCTAATGAGGT-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3' ；(SEQ ID No. 2)
上游内引物 FIP : 5' -GCGCTTCTGGTTCAACGATTGCAGAAACGATCGTAGAGCCGT-3'；(SEQ ID No. 3)下游内引物BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；(SEQ ID No. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -CGCCTCTGCTAATGAGGTAG-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游内引物FIP :5' -TGGCGCTTCTGGTTCAACGATTAAACGATCGTAGAGCCGTCT-3'； (SEQ ID No. 7)下游内引物BIP :5' -TGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；(SEQ ID No. 8) (3)上游外引物 F3 :5' -AGAAACGATCGTAGAGCCGT-3' ; (SEQ ID No. 9)下游外引物B3:5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3' ; (SEQ ID No. 10)上游内引物FIP :5' -AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTCGACGACTTCTGACGCAAT-3'；(SEQ ID No. 11)下游内引物BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；(SEQ ID No. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -CGTAGAGCCGTCTTTAGCG-3' ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3:5' -CGGAACTGAGATTCCGCTG-3' ; (SEQ ID No. 14)上游内引物FIP :5' -AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACGACTTCTGACGCAATCG-3'；(SEQ ID No. 15)下游内引物BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'。(SEQ ID No. 16)具体地说，a) LAMP 反应液LAMP反应液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L 的内引物、5mol/L 甜菜碱、50mmol/L MgSO4 和 IOmmoI/L dNTPs 组成。在本发明的一个具体方案中，LAMP反应液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L内引物FIP、BIP各 2· 0 μ 1，10 μ mol/L 外引物 F3、Β3 各 L O μ 1，IOmmoI/L dNTPs3. 0 μ 1，50mmol/L MgSO43. 0μ 1，5. Omol/L甜菜碱4. 5μ l，Bst DNA聚合酶大片段I. 0 μ I组成，反应液总体积20 μ I。b)标准阳性模板标准阳性模板是含有副溶血弧菌高度保守基因toxR基因328个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-toxR载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖。toxR基因的核苷酸序列为5 ' -AACGCCTAAGCCCGCTTTCTTCAGACTCAAGCTCAATTGAAGTTGAAGAACCTGCTTCTGATAACAATGACGCCTCTGCTAATGAGGTAGAAACGATCGTAGAGCCGTCTTTAGCGACGACTTCTGACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCAGTAGTACCTGAAAAAGCACCTGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTTGGATTCCACGCGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCGATTTGCGTACTGCTGTTTACAAACCCAGCGGAATCTCAGTTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAGAACGTACCAGTGATGACACCTGTAAATCA-3'。(SEQ IDNo. 17)实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pMD18-T_toxR，该质粒转化大肠杆菌DH5 α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，_20°C保存。c)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。本试剂盒的工作原理使用本发明提供的快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒，在恒温条件下(65°C左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，并伴随产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。反应结束后，12000r/min离心30s，即可用肉眼观察管底白色沉淀。在本发明提供的快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒中，针对副溶血弧菌检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物、dNTPs、Mg2+浓度、甜菜碱等的优化，通过优化方案，反复实验，建立了检测副溶血弧菌的环介导等温扩增方法，并研制出检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测副溶血弧菌的要求。
使用上述LAMP试剂盒检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤①用缓冲蛋白胨水(BPW)按照国标法培养待检样品l_4h ；②用水煮法从待测样品中提取DNA ；③将DNA加入到LAMP反应体系中，65°C保温Ih ；④反应结束后，离心，肉眼观察沉淀，对样品进行定性分析。本发明提供的快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒，可对副溶血弧菌进行定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清法检测方法。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果I、与传统培养法相比，检测速度快，仅lh，加上样品DNA的提取制备，总共不超过5h。2、特异性好，灵敏度高；3、步骤简单，可重复性高；4、可同时进行多个样品检测。
图I为实施例I中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中I一标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阳性样本，4一副溶血弧菌阳性样本,5—副溶血弧菌阳性样本，6-副溶血弧菌阴性样本，7—副溶血弧菌阴性样本，8—副溶血弧菌阴性样本；图2为实施例I中副溶血弧菌I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图中M-DNA Marker, I一标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阳性样本，4一副溶血弧菌阳性样本,5-副溶血弧菌阳性样本，6—副溶血弧菌阴性样本，7—副溶血弧菌阴性样本，8-副溶血弧菌阴性样本；图3为实施例2中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中I一标准阳性模板，2—阴性对照，3-副溶血弧菌阴性样本，4一副溶血弧菌阴性样本,5—副溶血弧菌阴性样本，6-副溶血弧菌阳性样本，7-副溶血弧菌阳性样本，8—副溶血弧菌阳性样本；图4为实施例3中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中
I一标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阴性样本，4一副溶血弧菌阴性样本,5—副溶血弧菌阴性样本，6—副溶血弧菌阳性样本，7—副溶血弧菌阳性样本，8—副溶血弧菌阳性样本；图5为实施例4中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中I一标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阴性样本，4一副溶血弧菌阴性样本,5—副溶血弧菌阴性样本，6—副溶血弧菌阳性样本，7—副溶血弧菌阳性样本，8—副溶血弧菌阳性样本；图6为实施例5中副溶血弧菌LAMP试剂盒特异性实验观察白色沉淀结果，图中I一标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌样本，4一单增李斯特菌样本，5—痢疾志贺氏菌样本，6—甲型副伤寒沙门氏菌样本，7一金黄色葡萄球菌样本,8—大肠杆菌样本； 图7为实施例6中副溶血弧菌LAMP试剂盒灵敏度实验观察白色沉淀结果，图中I一稀释10 1倍,2一稀释10 2倍,3一稀释10 3倍,4一稀释10 4倍,5一稀释10 5倍，6一稀释10 6倍，7一稀释10 7倍,8一稀释10 8倍,9一稀释10 9倍，10一稀释10 10倍。
具体实施例方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D. L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。实施例I :I、新型可视化快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制a) LAMP反应混合液LAMP 反应混合液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L 内引物 FIP、BIP各 2.0 μ 1，10 μ mol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，10mmol/L dNTPs 3. O μ I, 50mmol/LMgS043. 0 μ 1,5. Omol/L甜菜碱4. 5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I组成，反应液总体积20 μ I。其中引物序列如下上游外引物F3:5' -ACGCCTCTGCTAATGAGGT-3'；下游外引物B3:5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3'；上游内引物FIP :5' -GCGCTTCTGGTTCAACGATTGCAGAAACGATCGTAGAGCCGT-3'；下游内引物BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；b)标准阳性模板标准阳性模板pMD18-T-toxR是含有副溶血弧菌高度保守基因toxR基因328个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-toxR载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖；实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pMD18-T-toxR，该质粒转化大肠杆菌DH5 α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，-20°C保存。c)阴性质控标准品
阴性质控标准品为无菌双蒸水。2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤a、食物样品预处理取3份经传统培养法鉴定的副溶血弧菌阳性食品，3份副溶血弧菌阴性食品，分别称取25g样品放入盛有225mL BPff的无菌均质杯中，以8000r/min 10000r/min均质Imin 2min,或置于盛有225mL BPff的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打Imin 2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混勻即可。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36°C 土1°C培养l_4h。如为冷冻产品，应在450C以下不超过15min解冻。b、细菌模板DNA的制备分别取100 μ L细菌培养物，12000r/min离心2min，去上清，加入50 μ L无菌水,充分混勻，100°C水浴lOmin, 12000r/min离心2min,上清即为模板DNA。c、LAMP反应分别取5 μ I b)步中样本上清加入到20 μ I LAMP反应液中，65°C恒温扩增60min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。d、结果判定待反应结束后12000r/min离心30S，观察有无沉淀产生(见附图I)。取5 μ I LAMP产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本都有条带，阴性样本则无条带(见附图2)。附图I为离心后观察白色沉淀结果，附图2为I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。e、结论反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀或电泳条带，对照组均无沉淀或电泳条带，与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，沉淀观察法与电泳检测法效果一致，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。实施例2 I.新型快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制，与实施例I所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -CGCCTCTGCTAATGAGGTAG-3'；
下游外引物B3:5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3'；上游内引物FIP :5' -TGGCGCTTCTGGTTCAACGATTAAACGATCGTAGAGCCGTCT-3'；下游内引物BIP :5' -TGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法与实施例I所述方法完全相同，反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀，对照组均无沉淀(见附图3)，与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。实施例3 I.新型快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制，与实施例I所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -AGAAACGATCGTAGAGCCGT-3'；下游外引物B3:5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3'；上游内引物FIP :5' -AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTCGACGACTTCTGACGCAAT-3/ ；下游内引物BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；
2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法与实施例I所述方法完全相同，反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀，对照组均无沉淀(见附图4)，与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。实施例4:I.新型快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制，与实施例I所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -CGTAGAGCCGTCTTTAGCG-3'；下游外引物B3:5' -CGGAACTGAGATTCCGCTG-3'；上游内引物FIP :5' -AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACGACTTCTGACGCAATCG-3'； 下游内引物BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'；2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法与实施例I所述方法完全相同，反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀，对照组均无沉淀(见附图5)，与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。实施例5 :基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒的特异性实验a、DNA模板的制备分别取经过DNA有效性验证的副溶血弧菌、单增李斯特菌、痢疾志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌液10μ l，12000r/min离心2min,去上清,加入50 μ L无菌水,充分混勻，100°C水浴lOmin, 12000r/min离心2min,上清即为模板DNA。b、LAMP反应分别取5μ I a)步中样本上清加入到20 μ I LAMP反应液中，65°C恒温扩增60min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。C、结果判定待反应结束后12000r/min离心30S，观察有无沉淀产生(见附图6)。附图6为副溶血弧菌LAMP试剂盒特异性实验观察白色沉淀结果。d、结论结果显示只有阳性对照组和副溶血弧菌有白色沉淀，而单增李斯特菌、痢疾志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和阴性对照没有白色沉淀。上述实验说明本试剂盒具有良好的特异性。实施例6 :快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒灵敏度实验a、取Iml过夜培养的副溶血弧菌培养液做10倍倍比稀释，稀释至10_9。取每个稀释度的菌液10 μ 1,120001'/111；[11离心2111；[11,去上清,加入5(^ L无菌水,充分混勻，100°C水浴lOmin, 12000r/min 离心 2min,上清即为模板 DNA。b、LAMP反应取5μ I a)步中样本上清加入到20 μ I LAMP反应液中，65°C恒温扩增 60min。C、结果判定反应结束后，12000r/min离心30s观察管底是否产生白色沉淀，结果显示KT1-KT8样本管底均有白色沉淀，10_9-10_1(1样本管底则没有白色沉淀(见附图7)。附图7为副溶血弧菌LAMP试剂盒灵敏度实验观察白色沉淀结果。d、结论结果显示当菌液稀释至10_8时仍能检测出，最低检测极限为50CFU/ml。
上述实验说明本试剂盒具有良好的灵敏度。
从上述实例可以说明，LAMP检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简便，而且LAMP检测试剂盒对样品的检测仅需不到5个小时就能完成，而传统的培养法约需I周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。
该试剂盒的操作只需I人即可完成整个操作过程，一次可检测多个(由实际检测需要决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。
权利要求
1.ー种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，其特征在干，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有引物，引物为以下4组特异性引物中的任意一组 (I)上游外引物 F3 :5' -ACGCCTCTGCTAATGAGGT-3'； 下游外引物 B3 :5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3'； 上游内引物 FIP : 5' -GCGCTTCTGGTTCAACGATTGCAGAAACGATCGTAGAGCCGT-3'； 下游内引物 BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'； (2 )上游外引物 F3 :5' -CGCCTCTGCTAATGAGGTAG-3'； 下游外引物 B3 :5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3'； 上游内引物 FIP : 5' -TGGCGCTTCTGGTTCAACGATTAAACGATCGTAGAGCCGTCT-3'； 下游内引物 BIP :5' -TGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'； (3 )上游外引物 F3 :5' -AGAAACGATCGTAGAGCCGT-3'； 下游外引物 B3 :5' -GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3'； 上游内引物 FIP : 5' -AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTCGACGACTTCTGACGCAAT-3'； 下游内引物 BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'； (4 )上游外引物 F3 :5' -CGTAGAGCCGTCTTTAGCG-3'； 下游外引物 B3 :5' -CGGAACTGAGATTCCGCTG-3'； 上游内引物 FIP : 5' -AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACGACTTCTGACGCAATCG-3'； 下游内引物 BIP :5' -TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3'。
2.根据权利要求I所述的LAMP试剂盒，其特征是，所述LAMP反应液是由BstDNA聚合酶大片段、LAMP 10 Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L的内引物、5mol/L舌甘菜碱、SOmmoI /T, MgSO4 和 10mmol /T, dNTPs 组成。
3.根据权利要求I或2所述的LAMP试剂盒。其特征是，标准阳性模板是含有副溶血弧菌高度保守基因toxR基因328个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-toxR载体，toxR基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 17所示。
4.使用权利要求I 3所述的LAMP试剂盒检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 ①用缓冲蛋白胨水按照国标法培养待检样品l_4h； ②用水煮法从待测样品中提取DNA； ③将DNA加入到LAMP试剂盒的反应体系中，65°C保温Ih； ④反应结束后，离心，肉眼观察沉淀，对样品进行定性分析。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有Bst DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜碱。引物分为正向引物和反向引物。本发明具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对工业食品中副溶血弧菌进行快速定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清学诊断方法。
文档编号C12Q1/04GK102864228SQ20121035637
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者王业富, 郑虎, 卢晅 申请人:武汉真福医药科技发展有限公司