一种定性检测嗜热链球菌的引物及方法与流程

本申请属于基因工程技术领域，特别涉及一种定性检测嗜热链球菌s10的引物、试剂盒及定性检测方法。

背景技术

嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)是一种低gc含量(gc含量是指在dna的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)、兼性厌氧、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢、革兰氏染色阳性非致病性、同型发酵的乳酸菌。嗜热链球菌是“公认安全性(gras)”菌株，被广泛应用于一些重要的发酵乳制品的工业生产中，是继乳酸乳球菌之后的第二个重要的工业乳酸菌，市场价值约400亿美元。嗜热链球菌常与保加利亚乳杆菌一起作为发酵剂广泛应用于酸奶、奶酪和其他乳制品的工业生产中。

嗜热链球菌具有酸化能力，蛋白水解酶活性，增长快速，能够产生胞外多糖、细菌素、风味物质及抗噬菌体等特点，直接或间接影响着发酵乳的质量，其中酸化能力，蛋白水解酶活性，胞外多糖与风味物质的产生能力是筛选生产菌株的关键特性。

嗜热链球菌s10是一株分离自我国传统发酵乳制品中发酵性能优异的乳酸菌。嗜热链球菌s10产酸速率较快，发酵7小时可以使发酵乳的ph到达4.6。嗜热链球菌s10的发酵性能优异，适合作为发酵剂在工业使用。

嗜热链球菌包括多达千株以上的具体菌株，因此，亟需一种定性检测发酵制品中是否含有嗜热链球菌s10菌株的方法。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种定性检测嗜热链球菌s10的引物及方法，从而能够以发酵制品为样本快速定性检测发酵制品中是否含有嗜热链球菌s10。

本申请的目的是通过如下技术方案实现的：

本申请所述嗜热链球菌s10(streptococcusthermophiluss10)分离自我国传统发酵乳制品，具体地，是通过如下方法分离筛选得到的：

嗜热链球菌s10(streptococcusthermophiluss10)分离自我国青海自然发酵酸牛乳中，通过tpy选择性培养基分离，通过挑取单个菌株扩配得到。

本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.16129；分类命名为：嗜热链球菌streptococcusthermophilus(streptococcusthermophiluss10)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)；保藏时间：2018年7月17日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本申请所分离的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10具有如下生物学特性：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)隶属于链球菌属，革兰氏阳性菌。细胞形态呈现圆球形或者椭圆形，链状排列，且无芽孢无鞭毛，长0.7～1.1μm，宽0.6～0.9μm，呈成对，或短链状出现，最适生长条件为38～43℃，ph6.0～7.0。

所述嗜热链球菌s10的发酵方法包括：将嗜热链球菌(streptococcusthermophiluss10)接入到m17液体培养基，42℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行10倍比稀释，得到10^-1～10^-7稀释梯度，分别吸取200μl的10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度稀释液，均匀涂布于m17固体培养基平皿内，42℃厌氧培养24h，挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温厌氧培养箱中培养24h，待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，保存分离株。

本申请提供的用于定性检测嗜热链球菌s10的特异性引物，所述特异性引物根据嗜热链球菌s10的基因序列特性，特异性设计对嗜热链球菌s10具有特异扩增作用的一对pcr引物，即，特异分子检测引物，所述特异性引物包括上游引物s10f和下游引物s10r，或者为所述上游引物s10f/下游引物s10r的互补链序列，其中，上游引物s10f的序列如seqno.1所示；下游引物s10r的序列如seqno.2所示，具体地，

上游引物s10f：5’-atgtttgaacgaactaccaagat-3’；

下游引物s10r：5’-tcactaactgttctccctgtctc-3’。

进一步地，所述嗜热链球菌s10的微生物保藏编号为cgmccno.16129。

本申请还提供前述特异性引物在制备pcr定性检测嗜热链球菌s10的试剂盒中的应用。

本申请还提供一种用于pcr定性检测嗜热链球菌s10的试剂盒，所述试剂盒包括前述的特异性引物。

进一步地，所述试剂盒还包括：标准品、特异性引物和pcr体系。

可选地，其工作程序为95℃变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸7min，4℃保存。

本申请还提供前述的特异性引物或者试剂盒在荧光pcr方法中用以定性检测嗜热链球菌s10的应用。

本申请还提供一种定性检测嗜热链球菌s10的方法，所述方法包括：

步骤1，从待检测样品中提取所有细菌的dna，作为进一步扩增的模板dna，其中，提取菌株的总dna的方法和试剂本领域技术人员公知的，例如可以采用ctab法或试剂盒等来提取dna作为模板dna；其中，所述试剂盒可以为任意一种细菌dna提取试剂盒。

步骤2，利用权利要求1所述特异性引物步骤1制得的模板dna进行pcr扩增，其中，pcr扩增的条件为：95℃变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸7min，4℃保存；

步骤3，对步骤2制得的pcr扩增产物进行凝胶电泳检测，其中，凝胶电泳的条件为：电压为5v/cm，电泳时间为20-30min，特征条带的位置约为298bp处。

本申请提供的特异性引物以嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10的全基因组序列中一段特异性的片段为依据，设计针对该菌的特异性引物，特异性好、灵敏度高、稳定性好、重复性好，使用该特异性引物目的菌株嗜热链球菌s10进行pcr分析，从而实现对嗜热链球菌s10快速准确地定性检测，特别是对发酵乳制品中嗜热链球菌s10的定性检测。

附图说明

图1：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10特异性引物特异性检验；

图2：4个样品的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10特异性扩增条带，条带1为s10发酵乳制品样品，条带2为阳性对照，条带3为阴性对照，条带4为非s10发酵乳制品样品。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本申请并不受这些实例的限制。

实施例1发酵乳制品样品中的宏基因组dna提取

取1.0g样品洗涤处理，将洗涤的菌体置于1.5ml离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴5min，反复冻融3次，加0.1ml％sds和10.0μl10mg/ml蛋白酶k，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000×g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000×g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000×g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的冰异丙酸沉淀总dna，然后70％乙醇洗涤沉淀两次，回溶备用。

实施例2嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10特异性引物特异性检测

以嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10的全基因组序列中一段特异性的片段为依据，设计如下引物序列：

s10r：tcactaactgttctccctgtctc；

s10f：atgtttgaacgaactaccaagat。

在设计嗜热链球菌s10特异性引物后，对该引物的特异性进行了验证，挑选分类学地位上与嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)st10同源性较高并且发酵性能良好的20株嗜热链球菌(不包括嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10)进行了pcr扩增，作为对照。

作为对照的菌种均购自用atcc、jsm或者dsm菌株资源库，其在相应菌株资源库中的编号依次为，(1)streptococcusthermophilesatcc19258^t、(2)streptococcusthoraltensisatcc700865^t、(3)streptococcustigurinusdsm24864^t、(4)streptococcussuisatcc43765^t、(5)streptococcussobrinusatcc33478^t、(6)streptococcussinensisdsm14990^t、(7)streptococcusshiloiatcc51499^t、(8)streptococcussanguinisatcc10556^t、(9)streptococcussaliviloxodontaejsm19288^t、(10)streptococcussalivariusatcc7073^t、(11)streptococcussaccharolyticusatcc43076^t、(12)bacteroidesfragilisjcm11019^t、(13)bifidobacteriumanimalisdsm10140、(14)bifidobacteriumbreveatcc15700、(15)bifidobacteriumlongumatcc15697、(16)clostridiumcoccoidesjcm1395^t、(17)enterococcusfaecalisatcc19433^t、(18)enterococcusfaeciumatcc19434、(19)escherichiacolijcm1649和(20)lactobacillusacidophilusatcc4356^t，共计20株菌进行了pcr扩增比对分析。

扩增体系：

反应体系50μl：10×pcrmix10μl，10mol/l上下游引物各0.4μl，dna模板100ng，ddh2o补充至20μl；

扩增条件：

95℃变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸7min，4℃保存。

将pcr产物与1％琼脂糖凝胶中以5v/cm的电压，电泳20-30min，染色，紫外拍照，检测扩增效果；其中，以含有目的扩增片段的嗜热链球菌s10菌株dna作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在298bp处是否出现预期特征条带，定性确定样品中是否含有嗜热链球菌s10，结果如图1所示，其中，以h2o作为阴性对照。

分析结果表明，该引物只能扩增嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10，不能扩增出其余20株嗜热链球菌。

上述比对扩增实验表明，本发明设计的引物具有良好的特异性。

实施例3嗜热链球菌s10定性检测

1.发酵乳制品样品中宏基因组dna的提取

以嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10发酵的酸奶样品作为待测样品1，以其它嗜热链球菌发酵而成的酸奶作为待测样品2。

采用液氮冻融-ctab法：取1.0g样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5ml离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0.1ml10％sds和10.0μl10mg/ml蛋白酶k，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于10000g离心10min(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总dna，然后70％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。

2.嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10特异性引物特异性扩增。

2.1扩增体系：

反应体系50μl：10××pcrmix10μl，10mol/l上下游引物各0.4μl，dna模板100ng,ddh2o补充至20μl；

2.2扩增条件：

95℃变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸7min，4℃保存。

2.3引物序列：

s10r：tcactaactgttctccctgtctc；

s10f：atgtttgaacgaactaccaagat。

3.琼脂糖凝胶电泳

将pcr产物与1％琼脂糖凝胶中以5v/cm的电压，电泳20-30min,染色，紫外拍照，检测扩增效果；其中以含有目的扩增片段的嗜热链球菌s10菌株dna作为模板的阳性对照，以灭菌水作为模板的阴性对照，根据在298bp处是否出现预期特征条带，确定样品中是否含有嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10。

扩增效果如图2所示，由图2可知，样品1为待测样品1，样品2为含有目的扩增片段的菌株dna作为模板的阳性对照，样品3为以灭菌水作为模板的阴性对照，样品4为待测样品2。从图2中可以看出，阳性对照可以扩增出条带清晰明亮的目的条带，而阴性对照无相应扩增产物。

样品1(待测样品1)中含有嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10，而样品4(待测样品2)中不含有嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s10。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110>北京科拓恒通生物技术股份有限公司

<120>一种定性检测嗜热链球菌的引物及方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2629

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

acaccgaagaacattcataatctacttctaaagaagcacaagtaatctggatgaaggcct60

tcaaaaactaagtaggtcgtcagcctcttcctgaggaatttcttataggtaggtcttcag120

gttatgatgtgtcgatcatctatcagtttatctcatatggtaaggctgctaaactggcca180

atccagccatggcaaaaggaaagaaaatcctgattattgctggtattgttgtggtagtct240

tagcgcttgctggttatggatttggtttttattattactcacgtggtcaagtagcagatc300

gttatgaagcagcaacttatggtaagtttgatagttatgcctcaaatcataacacaacac360

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cggctgatattgatagaaatactacgggtgctaaaaaccgtgccgctgatagtattactt480

tctcggacgttgacgtcacagaagtcgttcagactggtgagaagaccttcaaggtgacct540

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aaatcgacgattgttaatgctaagcagatttattctttagagaagtctttttcggggact1320

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tattggcttgaacattctcttcaattcttctagtaaaacaaagaatcgctttggactggg1740

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gaccaaatatctcaatgaccagcaatttacacatgggagtgcggatgttagtttaggaca1860

ggcttccgtttattttgataattgccgtattgaggggccatctgctcagtttgatgtgga1920

cgtttctcttggaagtcttagcctctatgtgcccagtgattggcgggtgcatgtgaatgt1980

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