一种利用CDDP标记构建重楼属植物指纹图谱的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及重楼属植物品种鉴别方法，具体涉及一种利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，以及所述方法在重楼属种质资源鉴定、遗传多样性分析中的应用。

背景技术

重楼是我国一味传统的民族药，《神农本草经》中以“蚤休”之名载入，重楼作为其正式药名始于《滇南本草》的记载。本品为百合科植物云南重楼parispolyphyllasmithvar.yunnanensis(franch.)hand.-mazz.或七叶一枝花parispolyphyllasmithvar.chinensis(franch.)hara的干燥根茎。主要用于治疗疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐，具有凉肝定惊，消肿止痛，清热解毒的功效。重楼作为一种重要的中成药原料，云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶囊等产品的主要原料均来源于重楼，因此，近年来市场需求旺盛，重楼的价格也随之暴涨，供不应求。

重楼属植物的外貌特征一致，即均具有一轮叶、一个茎和顶生一只花，故该属植物分类学地位至今未有定论，不同种间外部形态特征较为相似，不容易区分。近年来，伴随着重楼市场需求的增长，过度采挖及生境的破坏导致重楼属植物野生资源急剧减少，很多地区出现了同属多种植物相混入药的现象，导致商用药材基原混杂，药材品质参差不齐，亟需开发出一种快速鉴定重楼药材的有效方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决通过形态鉴定的主观性，以有效保障药材基源的准确性和稳定性，确保用药安全。基于此，本发明给出一种利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法。本发明通过构建重楼属植物的分子指纹图谱，为合理利用重楼属植物种质资源、鉴定商用重楼基源种提供了理论指导，同时对于保障重楼用药安全和药材质量具有重要的参考价值。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

一种利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，其包括重楼属植物基因组dna的提取与检测；cddp多态性引物的筛选；利用筛选的cddp多态性引物对重楼属植物进行pcr扩增与电泳检测；选取核心引物构建重楼属植物的cddp指纹图谱。

具体地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，其包括步骤：

1)采集重楼属植物，提取重楼属植物基因组dna，并检测基因组dna的完整性和浓度；

2)选取两种重楼属植物的基因组dna进行cddp多态性引物的筛选；

3)利用筛选的cddp多态性引物对重楼属植物进行pcr扩增与电泳检测；

4)从cddp多态性引物中选取核心引物，构建重楼属植物的cddp指纹图谱。

进一步优选地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，在步骤1)中，选取野外采集的重楼属植物叶片，分别编号，提取叶片的基因组dna；1％琼脂糖电泳30min检测基因组dna完整性，紫外分光光度计测定dna浓度。

进一步优选地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，在步骤1)中，所采集的重楼属植物资源包括七叶一枝花(parispolyphylla)、狭叶重楼(p.polyphyllavar.stenophylla)、华重楼(p.polyphyllavar.chinensis)、金线重楼(p.delavayi)、长药隔重楼(p.polyphyllavar.thibetica)、球药隔重楼(p.fargesii)、短瓣球药隔重楼(p.fargesiivar.brevipetalata)、白花重楼(p.palyphyllavar.alba)、宽瓣球药隔重楼(p.fargesiivar.latipetala)、滇重楼(p.palyphyllavar.yunnanensis)、黑籽重楼(p.thibetica)、无辦黑籽重楼(p.var.apetala)、具柄重楼(p.fargesiivar.petiolata)。这13种重楼属植物资源的信息见表1。

表1野外采集的13种重楼属植物资源信息

进一步优选地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，在步骤2)中，所选择的两种重楼属植物为华重楼(p.polyphyllavar.chinensis)、长药隔重楼(p.polyphyllavar.thibetica)。

进一步优选地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，在步骤3)中，cddp-pcr扩增的反应体系为：20μl反应体系中包含10.5μl2×taqmastermix，5.4μl2.5μmol·l^-1的引物，1.8μl的dna(50ng·μl^-1)，加灭菌ddh2o补齐体积至20μl；

cddp-pcr扩增程序为：94℃，5min；然后94℃，0.5min，45-55℃，1min，72℃，1.5min，40个循环；循环结束后72℃再延伸10min。

进一步优选地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，在步骤4)中，选取3个核心引物构建重楼属植物的cddp指纹图谱。

具体地，所述3个核心引物的信息分别为：序列5′-acsccsatccaccgg-3′，退火温度45.0℃；序列5′-cacgaggacctscagg-3′，退火温度45.9℃；序列5′-cactaccgcggsctscg-3′，退火温度51.5℃。所述3个核心引物的信息见表2。

表2用于构建重楼属植物指纹图谱的3个核心引物的信息

进一步优选地，所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法，在步骤4)中，利用筛选的核心引物对重楼属植物资源的基因组dna进行pcr扩增，统计条带的有无，以重楼属植物编号为横行，分子量大小为纵行，有带标记为实心黑色方框，无带标记为空白方框，构建重楼属植物的cddp指纹图谱。

另一方面，本发明还给出了所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法在重楼属种质资源鉴定、遗传多样性分析中的应用。

作为所述应用的优选实施方式，利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法鉴定未知重楼属植物时，首先按权利要求1所述方法构建未知重楼属植物的cddp指纹图谱的构建，将其与按权利要求1所述方法已构建的cddp指纹图谱进行比对分析，当cddp指纹图谱吻合度达到95％时，判定是同一种；当cddp指纹图谱介于90％-95％时，判定为是近缘种；当cddp指纹图谱吻合度低于90％时，判定不属于已知重楼属植物。

与重楼属植物形态鉴定方法相比，本发明所述利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱的方法及其应用的优点在于：

(1)本发明采用cddp标记构建重楼属药用植物的指纹图谱，用于构建指纹图谱的核心引物扩增产物多态性高，基因分型能力高，该标记是依据植物中功能基因和基因家族的保守氨基酸序列设计引物，因此扩增得到的标记片段可能是目的基因的一部分或与基因紧密连锁。

(2)此外，本发明可在重楼属药用植物苗期进行鉴定，可以有效的保障药材基源的准确性和稳定性，确保用药安全。与传统的化学色谱指纹图谱鉴定相比，本发明取材少，取样时期不受发育时期的限制以及植株外界生长环境的干扰。

(3)与利用传统的dna条形码鉴定相比，本发明不需要进行pcr扩增后的测序以及数据库比对，仅需要dna提取、pcr扩增以及电泳检测分析，操作简单，鉴定方法快捷可靠，省时、省钱、省力。

附图说明

图1是实施例所述利用cddp标记构建的重楼属植物指纹图谱，图中编号同表1中对应的重楼属植物材料编号，黑色框表示有条带，白色框表示无条带，图中右侧编号为扩增条带的编号，条带编号最后一个连字符的数字为对应的扩增条带长度。

具体实施方式

为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不用于限制本发明的范围。在不违背本发明精神和实质的基础上，对本发明方法、步骤或者条件所做的修改或替换，均属于本发明范围。

实施例1，利用cddp标记构建重楼属植物指纹图谱

(1)3个核心引物的获取

本实施例以华重楼(p.polyphyllavar.chinensis)、长药隔重楼(p.polyphyllavar.thibetica)的基因组dna为模板，通过分析扩增产物的条带的数量、多态性、清晰度以及稳定性等指标，开展核心引物的筛选。核心引物的筛选步骤如下。

步骤1，采用植物基因组dna提取试剂盒提取华重楼和长药隔重楼的基因组dna。

步骤2，以华重楼和长药隔重楼的基因组dna为模板，以collard等开发出的21条cddp引物为扩增引物，筛选多态性好、条带清晰稳定的引物。

本步骤采用的cddp-pcr扩增的反应体系为：20μl的反应体系中包含10.5μl2×taqmastermix，5.4μl2.5μmol·l^-1的引物，1.8μl的dna(50ng·μl^-1)。

本步骤进行cddp-pcr反应的扩增条件为：94℃，5min；然后94℃，0.5min，45-55℃，1min，72℃，1.5min，40个循环；循环结束后72℃再延伸10min。

步骤3，利用筛选的多态性引物对表1中13个重楼属药用植物的基因组dna进行pcr扩增，扩增结果见表3。

表3用于重楼属遗传资源多样性分析的cddp引物及其扩增结果

步骤4，根据表3的结果，结合琼脂糖电泳图谱条带清晰度、稳定性评价，对表3中的11个多态性引物进行复筛，选取abp1-2，abp1-3，erf-1三个引物为核心引物进行指纹图谱构建。

(2)cddp指纹图谱的建立

以abp1-2，abp1-3，erf-1三个引物为核心引物，对表1中13份重楼属药用植物的基因组dna进行pcr扩增，琼脂糖电泳获得电泳图谱，统计条带的有无，以重楼属植物编号为横行，分子量大小为纵行，有带标记为实心黑色方框，无带标记为空白方框，构建重楼属植物的cddp指纹图谱。本实施例构建的重楼属植物cddp指纹图谱见图1。

实施例2，未知种属的重楼属植物样品的鉴定

把未知的重楼属样品按照实施例1所述方法进行cddp指纹图谱的构建，将其与图1指纹图谱进行比对分析，当其与图1的指纹图谱吻合度达到95％时，可以判定是同一种；当其与图1的指纹图谱吻合度介于90％-95％时，可以判定为是近缘种；当其与图1的指纹图谱吻合度低于90％时，可以认为不属于表1中的任何一种重楼属植物。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。