本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域,更具体涉及用于猕猴桃猕枣2号品种鉴定的分子标记引物及应用。
背景技术
中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃遗传资源的原始起源中心。近年来,我国猕猴桃产业稳步扩增,截至2017年全国栽培面积达240万亩,产量290万吨,均居世界首位。在品种格局上,我国立足于本土猕猴桃遗传资源研究,选育出了‘金艳’、‘东红’等猕猴桃新品种,在全球范围广泛栽培,彻底改变了世界猕猴桃产业唯‘海沃德’品种的单一格局,推动了猕猴桃市场多样化和消费的多元化。
随着猕猴桃新品种的日益推出,新品种的鉴定是亟待解决的一大难题。目前,对猕猴桃专利品种的鉴定仅通过树势、叶片形态、花期、花形态、果实外观等传统手段,难免受到环境和其他人为因素的影响。对猕猴桃品种的不确定性,限制了产业的健康持续发展,且苗木品种不纯甚至错误将造成果农经济效益严重受损。
分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。选择适宜的分子标记及其配套检测技术,建立一套简便、经济、准确而高效的品种鉴定和指纹图谱技术体系,是打击假冒伪劣种苗、保护植物遗传育种工作者和农民的合法权益,规范我国农业市场的迫切需要。
分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异,从而对不同个体进行区分,是继形态标记和生化标记之后,发展的一种较为理想的遗传标记。在植物种质资源鉴定及育种中,对分子标记的应用已日趋成熟。ssr分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组,呈共显性,等位变异高,操作简便且稳定性好,已应用于大豆、苹果和葡萄等品种鉴定方面。在猕猴桃中,分子标记技术应用于猕猴桃雄性系列品种的鉴定,已为多个优异猕猴桃品种准确提供授粉雄株,提升猕猴桃的育种效率。
‘猕枣2号’果实短圆柱形,平均果重6~10g,最大果重10.2g;果皮和果肉均为绿色,果面光滑可食,软熟果实含可溶性固形物24%~27%,总糖11%,总酸1.1%,vc30mg/100g。2015年申请农业部植物新品种权保护。开发适用于猕猴桃‘猕枣2号’品种的分子鉴定标记,有利于从分子水平上明确界定专利品种,利于对猕猴桃品种进行鉴定和品种保护。
技术实现要素:
本发明的目的在于利用分子标记技术,提供一种用于猕猴桃‘猕枣2号’品种鉴定的分子标记引物,所述的分子标记命名为geo11-126,针对其设计的引物为geo11-126-f:aaaaggggaacaaaccaagg和geo11-126-r:tgcctcatttaaacatctccaa。
本发明的另一个目的在于提供了用于猕猴桃‘猕枣2号’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
用于猕猴桃‘猕枣2号’品种鉴定的分子标记引物的获得:申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过ssrfinder软件在全基因组范围内开发ssr标记,根据基因结构注释结果,选择基因位点设计ssr标记引物。利用设计合成的引物,对猕猴桃‘猕枣2号’品种进行pcr扩增,筛选得到分子标记geo11-126,针对其设计的引物为geo11-126-f:aaaaggggaacaaaccaagg和geo11-126-r:tgcctcatttaaacatctccaa。
用于猕猴桃‘猕枣2号’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用,包括利用本发明的引物用于猕猴桃育种,或是利用本发明的引物对猕猴桃品种,特别是‘猕枣2号’品种进行鉴定,或是根据不同条带的大小和数目,对不同品种包括:‘布鲁洛’、‘翠玉’、‘贵长’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金农’、‘金桃’、‘金艳’、‘满天红’、‘mbr’、‘米良1号’、‘磨山4号’、‘庆元秋翠’、‘秦美’、‘通山5号’、‘wh-1’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘徐香’、‘豫皇一号’、‘江山娇’猕猴桃进行区分。
与现有技术相比,本发明的优点:
1.形态标记简单直观,但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便,在植物体的各个组织和发育时期,均可检测,不受季节和环境限制。数量多,遍及整个基因组。多态性高,品种间存在许多等位变异。
2.本发明的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的dna片段。该分子标记扩增稳定性,能用于进行猕猴桃‘猕枣2号’品种的鉴定。
3.本发明提供的分子标记引物特异性高,适用范围广,可从40多个不同品种的猕猴桃中对‘猕枣2号’品种进行鉴定,利用分子标记geo11-126引物对dna进行扩增,仅猕枣2号可特异性的扩增出245bp、251bp、283bp的条带。
4.除了根据特异性条带鉴定‘猕枣2号’品种,还可根据条带大小和数目,对不同品种包括:‘布鲁洛’、‘翠玉’、‘贵长’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金农’、‘金桃’、‘金艳’、‘满天红’、‘mbr’、‘米良1号’、‘磨山4号’、‘庆元秋翠’、‘秦美’、‘通山5号’、‘wh-1’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘徐香’、‘豫皇一号’、‘江山娇’猕猴桃进行区分。
具体实施方式
本发明所述技术方案,如未特别说明,均为本领域的常规方案;所述试剂或材料,如未特别说明,均来源于商业或公开的渠道。
实施例1:
用于猕猴桃‘猕枣2号’品种鉴定的分子标记引物的获得:
申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过ssrfinder软件在全基因组范围内开发ssr标记,根据基因结构注释结果,选择基因位点设计ssr标记引物。利用设计合成的引物,对猕猴桃‘猕枣2号’品种进行pcr扩增,筛选得到分子标记geo11-126,针对其设计的引物为geo11-126-f:aaaaggggaacaaaccaagg和geo11-126-r:tgcctcatttaaacatctccaa。
实施例2:
用于猕猴桃‘猕枣2号’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用:
(1)按照ctab法分别提取40多个不同品种猕猴桃的dna样品(具体品种名称如表1所示)。
(2)使用加样器吸取990ulhidi和10ulrox500或liz500的混合物,加入到96孔反应板中,每孔10ul。
(3)将96孔板置于平板离心机中,离心500g即停。
(4)在96孔板对应的孔中分别加入各样本dna,每个样品50pg。
(5)参照以下pcr反应体系加入相应试剂到96孔板,使用封板膜密封96孔板,振荡,将96孔板置于平板离心机中,离心500g即停。按照以下程序进行pcr反应。
a.pcr反应体系
25μl体系的配制
所述的引物f和引物r为:geo11-126-f:aaaaggggaacaaaccaagg和geo11-126-r:tgcctcatttaaacatctccaa。
b.pcr反应条件
(6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却,再将96孔板置于平板离心机中,离心2000g即停。
(7)使用3730xl测序分析仪(美国abi公司)检测扩增片段。
(8)使用genemapper软件分析ssr扩增数据,利用str毛细管电泳检测扩增片段峰,横坐标为片段大小,纵坐标为荧光强度值。
(9)利用标记geo11-126扩增猕猴桃品种,仅猕枣2号可特异性的扩增出245bp、251bp、283bp的条带,同时根据不同条带的大小和数目,对不同品种包括:‘布鲁洛’、‘翠玉’、‘贵长’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金农’、‘金桃’、‘金艳’、‘满天红’、‘mbr’、‘米良1号’、‘磨山4号’、‘庆元秋翠’、‘秦美’、‘通山5号’、‘wh-1’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘徐香’、‘豫皇一号’、‘江山娇’猕猴桃进行区分。具体扩增结果如表1所示。
表1不同品种猕猴桃名称及geo11-126引物pcr扩增结果
序列表
<110>中国科学院武汉植物园
<120>用于猕猴桃猕枣2号品种鉴定的分子标记引物及应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aaaaggggaacaaaccaagg20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aaaaggggaacaaaccaagg20