本发明涉及化工领域，具体为一种高纯度肝素季铵盐的制备方法及其应用。
背景技术：
自二十世纪三十年代起，普通肝素(ufh)就被用于血栓的预防和治疗。普通肝素是不同长度和分子量的硫酸粘多糖的混合物。随着分子大小的不同，其抗凝效果和药理学特性也有所差异。肝素主要来自于猪的小肠以及牛的肺组织。
低分子肝素(low-molecular-weightheparin，lmwh)是一类以普通肝素为起始物料经过分级或降解而得到的具有较低分子量的低聚糖混合物，它具有抗xa活性，可抑制体内、体外血栓和动静脉血栓的形成，但不影响血小板聚集和纤维蛋白原与血小板的结合。低分子肝素最早于八十年代在欧洲应用于临床，由于在临床使用中具有比较明显的优势，如临床应用出血风险比普通肝素更低，lmwhs逐渐取代了普通肝素的很多适应症，成为治疗或预防急性静脉血栓、急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。
通过不同的解聚方法制成的不同品种的lmwhs，其药物动力学特性和抗凝活性有不同程度的差异，适应症也各不相同，在临床上不能相互代替，因此每种产品都可被认为是独一无二的。目前世界各地在用的lmwhs有：依诺肝素钠(enoxaparin),达肝素钠(dalteparin),那屈肝素钙(nadroparin),亭扎肝素钠(tinzaparin),舍托肝素钠(certoparin),瑞肝素钠(reviparin)，帕肝素钠(parnaparin)以及贝米肝素钠(bemiparin)等。
欧洲药典对依诺肝素钠制备方法简要描述为：依诺肝素钠是一种低分子肝素钠盐，它通过对猪肠黏膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得。专利us5389618即采用这种碱解聚的β-消除法，其基本步骤为：以猪小肠粘膜肝素为起始原料，经肝素季铵盐制备、肝素苄酯制备、对肝素苄酯进行碱解聚，以酸中和、醇沉淀，精制、脱色，脱水干燥，得到依诺肝素钠成品。
肝素苄索氯铵盐是生产依诺肝素钠的关键中间体，us5389618等文献中关于肝素苄索氯铵盐中间体的特征和制备过程表述不尽详细，而且研究显示，苄索氯铵和其它杂质会影响进一步的酯化和解聚反应，使得依诺肝素钠生产批间差异较大，终产品着色严重，纯化困难，收率低。因此，如何获得高纯度并有明显特征的肝素苄索氯铵盐，是依诺肝素钠生产工艺的关键问题。
技术实现要素：
针对背景技术中存在的问题，本发明提供了一种高纯度肝素季铵盐的制备方法，旨在获得高纯度肝素苄索氯铵盐，用于依诺肝素钠的制备或其他用途。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，包括以下步骤：.一种高纯度肝素季铵盐的制备方法，以肝素和季铵盐为原料，制得高纯度肝素季铵盐，以高纯度肝素苄索氯铵盐为原料进行酯化反应得到肝素苄酯。
作为本发明一种优选的技术方案，包括以下步骤：①、将肝素和苄索氯铵按一定比例各溶解于纯化水中，再将两种溶液混合，使肝素和苄索氯铵在水相中反应，肝素苄索氯铵盐从水相中大量析出，将沉淀分离后溶于适量的能与水互溶的有机溶媒中，至样品全部溶解；
②、搅拌步骤①所得溶液中，并加入适量的纯化水，肝素苄索氯铵盐将再次析出，将固相沉淀物与液相混合溶剂分离；
③、检测肝素苄索氯铵盐中游离苄索氯铵的含量，再将肝素苄索氯铵盐减压干燥，得到高纯度的肝素苄索氯铵盐，用于制备依诺肝素钠；
④、将步骤③所得高纯度的肝素苄索氯铵盐溶于非水体系中与氯化苄进行酯化反应，反应结束后，向体系中加入与水互溶的有机溶媒，将沉淀出的肝素苄酯分离，再用含5-10％(w/v)醋酸钠的甲醇溶液洗涤后，减压干燥，得到肝素苄酯；
⑤、将步骤④所得肝素苄酯用纯化水溶解，至浓度为2-10％，加热至55-65℃，再加入适量氢氧化钠，进行β裂解反应，反应1-2小时后，加入2-4倍甲醇，析出依诺肝素钠；
⑥、将步骤⑤中所得依诺肝素钠沉淀用纯化水溶解，至浓度为5-20％，用0.22微米滤膜进行一级或二级过滤后冷冻干燥，得到成品依诺肝素钠。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤①中所述，肝素和苄索氯铵物料比为1:2-1:3，肝素水溶液浓度为5-15％(w/v)，苄索氯铵溶液的浓度为15-25％(w/v)。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤③检测肝素苄索氯铵盐中游离苄索氯铵的含量前，可以重复步骤②。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤①中所述与水互溶的有机溶媒指醇类溶剂。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤②中所述的适量的纯化水为步骤①所得肝素苄索氯铵盐溶液体积的1-10倍。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤③中所述的肝素苄索氯铵盐中游离苄索氯铵含量控制在1.0％以内。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤④中所述的非水体系指二氯甲烷或n,n-二甲基甲酰胺(dmf)或二氯甲烷与n,n-二甲基甲酰胺的混合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明巧妙的利用肝素苄索氯铵盐在水和醇中溶解性差异，采用特别的水/有机相交替溶解-析出工艺，并通过检测杂质残留的过程控制方法，尽可能去除肝素苄索氯铵盐中的游离苄索氯铵杂质，得到的高纯度肝素苄索氯铵盐，可用于制备高纯度的肝素苄酯，进一步制备高纯度的依诺肝素钠。使用高纯度的肝素苄索氯铵盐制备依诺肝素钠，可稳定地控制依诺肝素钠生产的批间差异，同时控制杂质的产生，减少精制步骤，提高依诺肝素钠成品质量的同时，提高收率，最终成品依诺肝素钠完全符合欧洲药典和美国药典对依诺肝素钠原料药及其制剂的质量要求。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
肝素苄索氯铵盐的制备：
常温下将100g注射级普通肝素溶解于1l纯化水，得到肝素溶液，将250g苄索氯铵溶解于1.25l纯化水，并在剧烈搅拌下缓慢加入肝素溶液，常温下维持搅拌30min，沉淀过滤后水洗数遍，至不产生泡沫为止。
将沉淀加入30倍于肝素钠重量(3l)的甲醇中，持续搅拌使其完全溶解，再向溶液中缓慢加入纯化水，共3l，肝素苄索氯铵盐再次在甲醇/水溶液中析出，过滤，滤饼60℃烘干，中间体批号为hy160901，称重333g，取样测定游离苄索氯铵含量为0.42％。
实施例二
肝素苄索氯铵盐的制备：
常温下将100g注射级普通肝素溶解于1l纯化水，得到肝素溶液，将250g苄索氯铵溶解于1.25l纯化水，并在剧烈搅拌下缓慢加入肝素溶液，常温下维持搅拌30min，沉淀过滤后水洗数遍，至不产生泡沫为止。
将沉淀加入30倍于肝素钠重量(3l)的甲醇中，持续搅拌使其完全溶解，再向溶液中缓慢加入纯化水，共3l，肝素苄索氯铵盐再次在甲醇/水溶液中析出，过滤，滤饼重复前述甲醇溶解/加水析出步骤一次，过滤，滤饼60℃烘干，中间体批号为hy160902，称重320g，取样测定苄索氯铵含量为0.15％。
实施例三
肝素苄索氯铵盐的制备：
常温下将100g注射级普通肝素溶解于1l纯化水，得到肝素溶液，将250g苄索氯铵溶解于1.25l纯化水，并在剧烈搅拌下缓慢加入肝素溶液，常温下维持搅拌30min，沉淀过滤后水洗数遍，至不产生泡沫为止。
将沉淀加入30倍于肝素钠重量(3l)的甲醇中，持续搅拌使其完全溶解，再向溶液中缓慢加入纯化水，共6l，肝素苄索氯铵盐再次在甲醇/水溶液中析出，过滤，滤饼60℃烘干，中间体批号为hy160903，称重325g，取样测定游离苄索氯铵含量为0.26％。
实施例四
肝素苄酯的制备及解聚：
在有冷凝回流装置的1000ml三口瓶中，将前述实施例中三个批次的肝素苄索氯铵盐样品各40g溶于200ml二氯甲烷，35℃水浴保温搅拌，然后加40ml氯化苄，反应20h后冷却至室温，加240ml含10％醋酸钠的甲醇溶液，常温下维持搅拌30min，沉淀过滤后用甲醇洗涤2-3遍，滤饼60℃真空干燥，各得到白色的高纯度肝素苄酯，用hplc法测定各肝素苄酯的酯化率。
将制备的肝素苄酯各10g分别用纯化水250ml溶解(浓度w/v＝4％)，加热至60℃，再分别加入1g氢氧化钠，进行β裂解反应，反应1.5小时后，立即降至室温，用6mol/l盐酸溶液调节ph至6.5-7，再加入750ml甲醇，析出依诺肝素钠，将所得依诺肝素钠沉淀用纯化水溶解，分别用5ml纯化水溶解(依诺肝素钠浓度介于10-20％之间)，用0.22微米滤膜过滤后冷冻干燥，得到成品依诺肝素钠。经检测，所有依诺肝素钠成品分子量分布、1,6-酐含量、抗fxa和抗iia活性及比值均符合欧洲药典和美国药典标准。
实施例总结表
基于上述，本发明具有的优点在于：本发明巧妙的利用肝素苄索氯铵盐在水和醇中溶解性差异，采用特别的水/有机相交替溶解-析出工艺，并通过检测杂质残留的过程控制方法，尽可能去除肝素苄索氯铵盐中的游离苄索氯铵杂质，得到的高纯度肝素苄索氯铵盐，可用于制备高纯度的肝素苄酯，进一步制备高纯度的依诺肝素钠。使用高纯度的肝素苄索氯铵盐制备依诺肝素钠，可稳定地控制依诺肝素钠生产的批间差异，同时控制杂质的产生，减少精制步骤，提高依诺肝素钠成品质量的同时，提高收率，最终成品依诺肝素钠完全符合欧洲药典和美国药典对依诺肝素钠原料药及其制剂的质量要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。