纤维二糖水解酶突变体及其生产方法和应用与流程

文档序号：16893880发布日期：2019-02-15 23:22阅读：324来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体、含有酶的组合物、dna分子、重组载体、宿主细胞及该突变体的生产方法，以及其在纤维素降解中的应用。

背景技术：

目前，清洁、可再生的木质纤维素质乙醇燃料越来越受到人们的关注。利用纤维素酶降解木质纤维素最后生产包括乙醇在内的生物基产品对人类可持续发展至关重要。但是，纤维素酶降解木质纤维素的成本仍然很高，其成本主要受限于纤维素酶的水解效率。因此说，在纤维素酶降解木质纤维素的过程中，纤维素酶的水解效率是纤维素转化的一个主要瓶颈。故此，在获取水解效率高的纤维素酶的研究方向上，科研工作者一直在孜孜不断地探索着。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种纤维二糖水解酶突变体，以解决纤维素酶的水解效率低的问题，加速纤维二糖水解酶的水解效率。

本发明再有一个目的是提供纤维二糖水解酶突变体的生产方法。

本发明另有一个目的是提供纤维二糖水解酶突变体于纤维素降解中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种纤维二糖水解酶突变体，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)如seqidno：1所示的氨基酸序列的第393位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸或谷氨酸，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能。

含有一种或几种所述酶的组合物。所述酶为所述的纤维二糖水解酶突变体。这几种酶中的一种或任意几种同时用于酶系复配中从而用于降解纤维素。

一种dna分子，所述dna分子编码所述的酶。

优选的是，所述的dna分子中，所述dna分子的碱基序列如seqidno：4所示。

一种重组载体，其含有所述的dna分子和与所述dna分子可操作地连接的用于表达的调节序列。

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的dna分子或所述的重组载体。

纤维二糖水解酶突变体的生产方法，包括如下步骤：将所述的宿主细胞在培养基中培养，在所述宿主细胞中生产基于重组载体所含有的纤维二糖水解酶突变体基因编码的纤维二糖水解酶突变体。

所述的纤维二糖水解酶突变体或所述的组合物于纤维素水解中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的酶具有良好的降解纤维素的功能，纤维二糖产量可提高9.52％～28.57％，提高了对纤维素的水解效果。可将其单独或与其他突变体组合使用，以提高水解效率。本发明的酶的表达量高且活性高，可用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。水解率的提高可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量。

定义为了便于理解本发明，本发明涉及的术语和短语的含义定义如下：

“基因”，是指一种dna分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码rna或蛋白质的碱基序列称为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。

“载体”，是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的dna片段可与其连接的环状双链dna环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的dna片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。

“重组载体”，是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

“纤维素酶”，纤维素酶是指能降解纤维素1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，适当调节组合物(即对组分酶系)中这三种主要成分活性的比例，实现完成纤维素的降解。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的纤维二糖水解酶及其突变体表达后凝胶电泳图；

图2是本发明所述的纤维二糖水解酶突变体t393k产纤维二糖的柱状图；

图3是本发明所述的纤维二糖水解酶及其突变体产纤维二糖的柱状图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种纤维二糖水解酶突变体，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)如seqidno：1所示的氨基酸序列的第393位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸或谷氨酸，

本发明还提供含有一种或几种所述酶的组合物，所述酶为所述的纤维二糖水解酶突变体。本发明的酶可单独用于降解纤维素，也可与其他几个突变体中的任一种或几种同时用于降解纤维素，提高纤维素的水解效率。本发明提供的所述酶与其他用于降解纤维素比如β-1，4-葡萄糖酶、内切葡聚糖酶的酶共同作用，用于降解纤维素。本发明提供的酶也可单独用于降解纤维素。

本发明还提供一种dna分子，所述dna分子编码所述的酶。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述dna分子的碱基序列如seqidno：4所示，其编码氨基酸序列如seqidno：3所示的序列，为如seqidno：1所示的氨基酸序列的第393位的苏氨酸被取代为赖氨酸的酶突变体。由于氨基酸密码子存在简并性，对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子(synonymouscodon)。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，但仍然能编码出原氨基酸。密码子的简并性也使dna分子上碱基组成有较大余地的变动。所以，本发明所述的dna分子包括但不限于以上的多核苷酸序列，还存在很多能够编码所述酶的可能的多核苷酸序列，这里不在一一列举。

本发明还提供一种重组载体，其含有所述的dna分子和与所述dna分子可操作地连接的用于表达的调节序列，该dna分子的序列选自：seqidno:4、6和10。本发明中使用的用于表达的ppiczαa载体，当然，也可以使用其他适于编码所述酶的核苷酸序列的表达载体，使其能够在多种真核宿主细胞中表达即可。

本发明还提供宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的dna分子或所述的重组载体。该重组载体所含的dna分子能够编码所述酶。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)细胞。

本发明还提供纤维二糖水解酶突变体的生产方法，包括如下步骤：将所述的宿主细胞在培养基中培养，在所述宿主细胞中生产基于重组载体所含有的纤维二糖水解酶突变体基因编码的纤维二糖水解酶突变体。

本发明还提供所述的纤维二糖水解酶突变体或所述的组合物于纤维素水解中的应用。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

氨基酸缺陷型培养基(ypds)购买自zeocin(thermofisherscientific,runcorn,cheshire,uk)，其配方为：1％酵母提取物(yeastextract)，2％蛋白胨(peptone)，2％葡萄糖(glucose)，1m山梨醇(sorbitol)，2％琼脂(agar)。

含有甘油的缓冲性复杂培养基(bufferedglycerol-complexmedium)，配方为：

1％酵母提取物(yeastextract)，2％蛋白胨(peptone)，100mm磷酸钾ph6.0(potassiumphosphate)，1.34％无氨基酸氮源和1％甘油(glycerol)。

bufferedminimalmethanol(bmmh)medium，配方为：

100mm磷酸钾(potassiumphosphate)ph6.0，1.34％无氨基酸氮源，0.5％甲醇(methanol)。

野生型纤维二糖水解酶，来源于埃默森篮状菌(talaromycesemersonii)，其氨基酸序列如seqidno:1所示，dna分子序列如seqidno：2所示。

本发明提供的纤维二糖水解酶突变体为通过对如seqidno：2所示的dna分子编码的蛋白质进行突变而来。得到纤维二糖水解酶突变体t393k(seqidno：3)、t393r(seqidno：5)、t393d(seqidno：7)、t393e(seqidno：9)、t393q(seqidno：11)和t393a(seqidno：12)。

野生型纤维二糖水解酶及其突变体的工程菌株，含有纤维二糖水解酶突变体t393k(seqidno：3)、t393r(seqidno：5)、t393d(seqidno：7)、t393e(seqidno：9)、t393q(seqidno：11)和t393a的载体分别为：ppiczαa-t393k、ppiczαa-t393r、ppiczαa-t393d、ppiczαa-t393e、ppiczαa-t393q、ppiczαa-t393a。上述构建方法中使用的表达载体指ppiczαa。将连有野生型纤维二糖水解酶及其突变体的载体转入毕赤酵母感受态细胞，挑取阳性克隆，即得到含有本发明的突变基因的工程菌株。

含本发明纤维二糖水解酶突变基因工程菌的表达与蛋白纯化

将得到的野生型纤维二糖水解酶及其突变体的工程菌株涂板到含有100μg/ml博莱霉素的氨基酸缺陷型培养基中，并在30℃下培养3天。之后将阳性菌落接种到含有甘油的缓冲性复杂培养基(bufferedglycerol-complexmedium)在240rpm，30℃过夜培养至od600＝2-6(以unicouv2102紫外可见分光光度计，以培养用含有甘油的缓冲性复杂培养基为空白对照。将培养液在4000g离心，收集菌体后，用bufferedminimalmethanol(bmmh)medium重悬菌体。之后每隔12小时补充0.5％甲醇，在240rpm，30℃条件下培养3天。

粗酶液经过ni-nta柱层析进行纯化，洗脱液中咪唑浓度为300mm，洗脱10个柱体积。之后得到的蛋白经过检测达到sds-page纯度的要求。通过以上方法得纤维二糖水解酶蛋白(氨基酸序列seqidno：1)和纤维二糖水解酶突变体(氨基酸序列seqidno：3)。

使用超高效液相色谱法测定蛋白的酶活，实际是以微晶纤维素为底物进行的测定，测定氨基酸序列seqidno：3所示的纤维二糖水解酶突变体t393k活性及水解率，具体方法和步骤为：

样品：1％(w/v)微晶纤维素在60℃恒温金属浴预热5-10min，加入1.33μm的酶稀释液。

水浴：将混合均匀的样品、底物和酶的对照组同时置于60℃恒温金属浴中，反应60h。

灭活：反应结束时，将样品、底物和酶的对照组一起煮沸5min使酶失活。

测定：利用示差检测器测量纤维二糖吸收峰，并利用纤维二糖标准曲线计算纤维二糖的含量。如图2所示，水解60小时后，野生型释放出0.21g纤维二糖，突变体t393k释放出0.27g纤维二糖，提高了28.6％。

依照上述同样的方法，将构建的蛋白t393r、t393d、t393e、t393q和t393a载体各自分别转化入了毕赤酵母感受态细胞中，得到工程菌株，并进行了蛋白表达，测定纤维二糖水解酶突变体t393k(seqidno：3)、t393r(seqidno：5)、t393d(seqidno：7)、t393e(seqidno：9)、t393q(seqidno：11)和t393a(seqidno：13)的纤维二糖产量，依照上述高效液相色谱法测定蛋白的酶活的方法，测定蛋白活性及其水解率，计算得出纤维二糖产量，如图3所示，水解60h时，野生型和突变体t393k、t393r、t393d、t393e、t393q和t393a的纤维二糖产量分别为0.21g，0.27g，0.25g，0.22g，0.23g、0.22g和0.21g。

本发明中，序列表和对应序列如下所示：

本发明提供的纤维二糖水解酶突变体的酶活性的提高可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量，提高在酶系复配中平衡酶系提高整体水解率的作用，具有广泛的应用前景。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的纤维二糖水解酶突变体及其应用的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，根据本发明，由于提供了酶活性提高的酶及其组合物，可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量，提高在酶系复配中平衡酶系提高整体水解率的作用，具有广泛的应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

<110>南开大学

<120>纤维二糖水解酶突变体及其生产方法和应用

<130>2017

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>503

<212>prt

<213>埃默森篮状菌（talaromycesemersonii）

<400>1

glnglnalaglythralathralagluasnhisproproleuthrtrp

151015

glnglucysthralaproglysercysthrthrglnasnglyalaval

202530

valleuaspalaasntrpargtrpvalhisaspvalasnglytyrthr

354045

asncystyrthrglyasnthrtrpaspprothrtyrcysproaspasp

505560

gluthrcysalaglnasncysalaleuaspglyalaasptyrglugly

65707580

thrtyrglyvalthrserserglyserserleulysleuasnpheval

859095

thrglyserasnvalglyserargleutyrleuleuglnaspaspser

100105110

thrtyrglnilephelysleuleuasnargglupheserpheaspval

115120125

aspvalserasnleuprocysglyleuasnglyalaleutyrpheval

130135140

alametaspalaaspglyglyvalserlystyrproasnasnlysala

145150155160

glyalalystyrglythrglytyrcysaspserglncysproargasp

165170175

leulyspheileaspglyglualaasnvalgluglytrpglnproser

180185190

serasnasnalaasnthrglyileglyasphisglysercyscysala

195200205

glumetaspvaltrpglualaasnserileserasnalavalthrpro

210215220

hisprocysaspthrproglyglnthrmetcysserglyaspaspcys

225230235240

glyglythrtyrserasnaspargtyralaglythrcysaspproasp

245250255

glycysasppheasnprotyrargmetglyasnthrserphetyrgly

260265270

proglylysileileaspthrthrlysprophethrvalvalthrgln

275280285

pheleuthraspaspglythraspthrglythrleusergluilelys

290295300

argphetyrileglnasnserasnvalileproglnproasnserasp

305310315320

ileserglyvalthrglyasnserilethrthrgluphecysthrala

325330335

glnlysglnalapheglyaspthraspasppheserglnhisglygly

340345350

leualalysmetglyalaalametglnglnglymetvalleuvalmet

355360365

serleutrpaspasptyralaalaglnmetleutrpleuaspserasp

370375380

tyrprothraspalaaspprothrthrproglyilealaargglythr

385390395400

cysprothraspserglyvalproseraspvalgluserglnserpro

405410415

asnsertyrvalthrtyrserasnilelyspheglyproileasnser

420425430

thrphethralaserasnproproglyglyglythrthrthrthrthr

435440445

thrthrthrthrserlysproserglyprothrthrthrthrasnpro

450455460

serglyproglnglnthrmettrpglyglncysglyglyglnglytrp

465470475480

thrglyprothralacysglnserproserthrcyshisvalileasn

485490495

aspphetyrserglncysphe

500

<210>2

<211>1512

<212>dna

<213>埃默森篮状菌（talaromycesemersonii）

<400>2

caacaggcaggaacagctacagccgaaaatcatcccccgttaacatggcaagaatgtacg60

gcacccggttcctgtacaacacagaatggtgcagtagtattagatgccaattggcgttgg120

gtgcatgatgttaacgggtatactaactgttataccggaaatacctgggaccccacatac180

tgcccagacgatgaaacgtgcgctcaaaactgtgcattggatggtgcagattacgaagga240

acttacggagtgacatcctccggtagcagtttaaaattgaattttgtgactgggtccaac300

gttggttcaagactgtatctattgcaggatgatagcacctatcagattttcaaacttttg360

atcgcgagttcagtttcgacgttgatgtttctaacttgccttgcggtttaaatggtgct420

ttatactttgttgctatggacgccgacggtggtgtatccaagtaccccaataacaaagcg480

ggtgcgaagtatgggaccggatactgtgacagccaatgtccaagagatttgaagtttatt540

gatggcgaagccaacgtagaaggctggcagcctagctccaacaacgcaaataccggcata600

ggagatcatggctcatgttgtgcagaaatggatgtttgggaggctaactcaatcagtaat660

gctgttaccccccatccatgcgatactccaggacaaacgatgtgttccggcgacgattgc720

ggaggtacatattcgaatgatagatatgccggaacctgtgatcctgatggttgtgatttc780

aacccatatagaatgggtaacacgtctttttatggtccgggtaaaattatagatacaaca840

aagccattcactgttgttacccagtttcttaccgatgacggtaccgacacagggacactt900

agcgagatcaaaagattttatattcagaactcaaacgttattcctcaaccaaatagtgac960

ataagcggtgttactggcaactctattacgactgaattttgtacggctcaaaaacaagcc1020

tttggagataccgatgattttagtcagcatgggggactggctaaaatgggggcagctatg1080

caacagggtatggttttagttatgtcattatgggatgattacgctgcacaaatgctttgg1140

ttagattccgattacccgactgatgccgatccaacaactcctggtatcgcgcgtggaaca1200

tgtccgactgactctggcgttcctagcgacgttgaatctcagagtcctaatagctatgtc1260

acatactccaatataaaatttggtcctatcaattcaacattcaccgccagcaatccccca1320

ggtggtggtactacaacaacaaccaccacaactaccagtaagccgtcaggtccaacgaca1380

actacgaacccatccggaccacagcagacgatgtggggacaatgcgggggtcaaggttgg1440

accggtcctacagcctgtcagagtccttcgacctgtcacgtaatcaacgacttttactct1500

caatgtttctaa1512

<210>3