猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及以一种猪流行性腹泻病毒m蛋白单域抗体。

背景技术：

猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,ped）是由猪流行性腹泻病毒（pedv）感染引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。感染pedv的病猪主要通过粪便传播病毒，发病猪主要表现腹泻、呕吐和脱水等临床特征，是导致哺乳仔猪死亡的主要传染病之一。1971年，ped首次在英国发生，随后扩散到世界各地。我国于1980年首次分离到pedv，2010年国内大部分养猪地区发生ped疫情，从哺乳仔猪到繁殖母猪均有发病，给养猪户造成了严重地经济损失。pedv属于尼多病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)，基因组是单股正链具有感染性的rna,与其他冠状病毒相似,基因组5′端有一个帽子结构(cap),3′端有1个poly(a)尾,基因组全长为2,8033nt，分别编码s、e、m和n等4个病毒结构蛋白。s担保存在的中和表位能够诱导机体产生中和抗体，对仔猪具有良好的保护效果。pedv感染早期，机体能够产生抗n和n蛋白的高水平抗体，是研发病毒血清抗体诊断方法的候选抗原。e蛋白在抗病毒研究方面具有应用前景。

骆驼属外周血中存在的天然缺失轻链的重链抗体（variabledomainoftheheavychainofhcabs，vhh）具有其他陆生生物所不具备的生物学特征，它的抗原结合位点仅由重链可变区单一结构域组成，却同普通igg抗体一样保持着良好和特异的抗原结合能力。vhh是目前可以得到的、具有完整功能的、最小igg抗体分子片段，分子量为15kda，是常规igg的1/10，单克隆抗体的1/3，分子高度4.8nm，直径2.2纳米，也称为纳米抗体（nanobody）。vhh抗体抗原结合位点具有伸展的抗原互补结合区和组织穿透性，可结合普通igg抗体无法接触的抗原表位。另外，体外重组vhh具有易表达和水溶性好等独特性质，在作为小型化基因工程抗体、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体；

本发明的另一个目的是提供一种编码所述猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体的核苷酸序列；

本发明的再一个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体或其编码序列在e.coli中的表达。

本发明采用以下技术方案，一种猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：seqidno.1，seqidno.2,seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6，seqidno.7或seqidno.8。

一种重组表达载体，含有上述的核苷酸序列。

一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。

优选的，所述宿主细胞为含有上述表达载体的原核细胞。

所述猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体或其编码序列在e.coli中的表达。

本发明的效果在于：利用噬菌体展示技术构建pedvm蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼igg重链抗体高变区抗m蛋白vhh抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和elisa实验证明其均可以同m蛋白相结合，吸光度od405值的不同表明其同m蛋白结合能力各有差异。8株vhh抗体可通过e.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。

附图说明

图1是是抗pedvm蛋白vhh克隆氨基酸序列比对结果图；

图2是e.coli中抗pedvm蛋白vhh抗体sds-page分析图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1、猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体的制备

1.材料和方法

1.1实验动物和试剂

2峰10月龄雌性双峰驼作为实验动物，牛淋巴细胞分离液，96孔酶标板；限制性内切酶，dna片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒为omega产品，镍亲和层析树脂(qiagen)；e.coli重组表达pedvm抗原（his标签和gst标签）；菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌tg1和bl21star(de3)、辅助噬菌体m13k07、载体phen2购于neb公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1骆驼免疫和抗体监测

首次免疫，用206佐剂（购于法国seepic公司），乳化500μg重组m蛋白皮下多点（背部，后腿和颈部两侧肌肉）接种骆驼。首免21天后加强免疫，剂量为206乳化1000μgm蛋白，与首免间隔35天、42天和63天加强免疫，抗原接种剂量均为1000μgm蛋白。在首次免疫前和每次加强免疫前均采集静脉血并分离到血清，用m蛋白（gst标签）作为抗原的间接elisa检测pedv抗体。本次免疫实验过程中，骆驼饲养管理，免疫，血液样品的采集均在专业兽医工作人员监督指导下完成。

1.2.2外周血的分离

最后一次免疫后7天（即第63天）颈静脉采抗凝血10ml（抗凝剂为肝素钠，10iu/ml），加入等量的han`s液做1倍稀释，而后加入等体积淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心分离外周血总淋巴细胞。分离的淋巴细胞用mem重悬中加入到六孔板中（37℃，5%co2）静止30min，吸附除去细胞碎片和巨噬细胞，离心收集淋巴细胞加入mem，保存在液氮中用于细胞rna提取。

1.2.3vhh抗体免疫文库构建

设计3对引物（参见表1-vhh基因扩增用引物）通过三轮扩增得到编码vhh蛋白目的基因。通过trizol试剂抽提淋巴细胞总rna，用g1作为反转录引物，合成第一链cdna，以cdna为模板，h1、g1为引物扩增得到600bp和900bp大小2条dna带，回收600bp条带作为模板，进行第2轮pcr扩增。

以第2轮pcr产物为模板，h2、h3为引物得到450bpdna带。以2轮pcr产物为模板，p1，tn为上下游引物进行第3轮扩增得到450bp带。将第3轮pcr产物经过sfii/noti双酶切克隆到phen2载体，电转化方法将连接产物转化到tg1中，37℃，180r/min培养1h，离心浓缩后涂在氨苄抗性的2×ytg平板（2%葡萄糖，100μg/mlamp^r）。同时取10μl稀释至1×10⁴倍涂板，37℃过夜培养，计算库容。转化后平板37℃温箱中培养16小时，用10ml的2×yt培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在-70℃备用，此为获得的抗pedvm蛋白vhh免疫抗体库。随机挑选电转化后的克隆进行测序，根据多样性和克隆数目来计算库容量。

1.2.4通过二次筛选过程获得特异的抗pedvm蛋白vhh抗体

筛选抗体操作步骤如下：

（1）抗原包被：将m抗原（gst标签）稀释至20ug/ml，50ul/孔，4℃过夜。pbs洗3次；

（2）封闭：加入300ul/孔的2%m-pbs，与37℃封闭1h，pbs洗3次；

（3）结合：取20ulphage+180ul0.1mpbs，混匀，50ul/孔，37℃静置1h；甩出多余的噬菌体溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1%pbst洗3次；

（4）一抗：用0.1mpbs按1：1000稀释兔抗m1350ul/孔37℃静置1h；甩出多余的液体，倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1%pbst洗3次；

（5）二抗：用0.1mpbss按1：10000稀释hrp-羊抗兔50ul/孔37℃静置1h；甩出多余的液体倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1%pbst洗4次；

（6）显色：取0.2m/lna2hpo4+0.1m/l柠檬酸各0.5ml加入少量opd，10ulh2o2混匀50ul/孔；2m硫酸终止25ul/孔，波长490nm检测结果。

1.2.5vhh可溶表达和elisa检测

随机挑选40个克隆，转化到e.colibl21star(de3)表达感受态中，然后挑单克隆于1ml培养基中，快速诱导表达，tg1空菌体作为空白对照。收集诱导的1ml菌液，12000rpm离心2min，弃上清，沉淀用0.5mltbs重悬；400w（6s超声，4是间隔）超声10min；将加入超声上清50ul/孔，37℃静置1h，tbs洗3次；加入2%m-tbs，200ul/孔，37℃封闭1h，0.1%tbst洗4次；取1m二乙醇胺+0.5mmmgcl2加入4mgpnpp，25ul/孔，3mnaoh终止，25ul/孔。波长405nm条件检测结果。选择阳性反应克隆进行序列测定和比对。

2.结果

2.1骆驼血清中m抗体水平检测

以2峰10月龄雌性双峰驼作为实验对照动物。

四次m抗原（his标签）免疫骆驼血清抗体做1∶50稀释检测表明（参见表2-m蛋白抗体检测（od450nm）），第2次加强免疫后，2头实验对照动物抗m的抗体已经是阳性，最后一次免疫后7天测抗体效价时，2峰骆驼的血清抗体od450nm达到1.58和1.92，因此可以判断此时机体内体液和细胞免疫水平均处在持续上升阶段，符合采集外周血淋巴细胞的实验要求。

2.2抗m蛋白vhh免疫文库构建和筛选

经过四轮的筛选后，可以检测到较为明显的富集效应（参见表3-每一轮噬菌体筛选的富集指数）。单克隆噬菌体elisa实验结果显示了40个阳性克隆，每个克隆的od450nm值见表4，表4中m13ko7、1%m-pbs为阴性对照。对这些克隆进行dna测序和核苷酸序列比对得到8个vhh基因碱基序列，通过氨基酸比对后获得6个独特型抗m蛋白vhh抗体基因。

2.3vhh可溶表达和elisa检测

利用m蛋白作为抗原包被酶标板，在30℃和37℃条件下同获得的6个独特型抗m蛋白vhh抗体基因进行可溶性表达和elisa检测发现，他们均可以同m蛋白相结合，通过吸光度值（od405nm）的高低说明其与抗原的结合能力各有不同（参见表5-m蛋白elisa鉴定）。

2.4抗m蛋白vhh基因序列比对和在e.coli中的表达

通过对所获得vhh基因进行核苷酸测序和序列分析见图1，氨基酸序列比对结果见图2。通过thekabatetal.(kabat,1991)比对方法进行分析，图1方框中氨基酸表示双峰驼源vhh抗体特有的标志性氨基酸，带下划线的氨基酸表示不同vhh克隆间的差异氨基酸。为了稳定获得vhh抗体，分别将vhh基因序列克隆到pet-28a载体，转入e.colibl21（de3）感受态细胞中，1.0mmiptg进行诱导表达，sds-page蛋白电泳分析发现目的条带，分子量大小在25kda附近（vhh约13.6kda，组氨酸标签约8～10kda），目的条带如图中箭头所示，证实所有vhh抗体均以成功表达。

通过图1和表4说明：利用噬菌体展示技术筛选得到8株编码pedvm蛋白vhh抗体序列，氨基酸序列比对结果表明，抗体fr2区序列具有典型的重链抗体氨基序列特征，即序列中的氨基酸残基分别为f37/e44/r45/g47（图1），证明这些抗体序列来自于重链抗体的高变区。抗体的cdr1区氨基酸残基31s和或n、32s和或n位，cdr2氨基酸残基54d或n存在变异，说明编码8株抗体的氨基酸序列的多样性存在显著差异。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种猪流行性腹泻病毒m蛋白特异性重链抗体

<130>2015

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

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