肿瘤相关基因FGFR3突变短肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及肿瘤相关基因突变抗原肽及其应用，特别涉及肿瘤相关基因fgfr3突变短肽及其应用。
背景技术：
：2017年2月，国家癌症中心发布了中国最新癌症报告。报告显示：在中国，每年新发癌症病例达429万，也就是说全国每天约1万人确诊癌症，每1分钟约7人确诊患癌。若中国人均预期寿命是85岁，那么每个人的累计患癌风险高达36％。在世界范围内，大约22％的新增癌症病例和27％的癌症死亡发生在中国。大部分癌症疾病早期缺乏特异的临床症状，在确诊时往往处于中晚期，针对中晚期肿瘤的治疗目主要是延长患者生存期。因此，解决癌症问题的出路在于预防。癌症发生的具体机理尚未研究清楚，但可以肯定的是癌症由基因突变引起，这里说的突变包括基因碱基的点突变、缺失、插入，基因的非正常扩增以及基因的异常融合。1990年，ericft.fearon和bertvogelstein在《cell》上发表论文，提出肠癌癌变的模型，该过程显示基因突变远早于临床表现，可以作为癌症早期诊断标志物。斯特拉顿教授领导的研究小组，通过分析乳腺癌患者的基因组，解析了癌症发生发展的全过程。他们发现在癌变发生的过程中，多数乳腺癌患者在有临床症状之前，体内的癌变就已开始。如果以体细胞突变为起点算起，患者早在十余年前就已经患上癌症，而当时并无任何临床症状。因此，清除体内突变的体细胞是预防癌症的关键。fgfr3基因定位于人类染色体4p16.3，长约16.5kb，由19个外显子和18个内含子组成。fgfr3的cdna大小为4.4kb，可译框架有2520个核昔酸，编码840个氨基酸组成的蛋白。fgfr3家族包括4个有活性的成员fgfrl-4，它们是进化过程中在氨基酸水平高度保守的、有高亲和力的细胞表面相关受体，这些受体有相似的结构，其中胞膜外区域包括疏水性的氨基信号肤并连接3条免疫球蛋白样区域，及疏水性跨膜区域和细胞内酪氨酸蛋白酶区域，fgfr1和fgfr2密切相关(72％的氨基酸相同)，fgfr1与fgfr4是相关性最低的(55％的氨基酸相同)，fgfr3的生物合成是以3种不同程度n—糖基化亚基为特点的:98kd非糖基化，120kd中等程度膜相关性糖蛋白，130kd成熟糖蛋白，fgfr3是配体结合后激活，由受体二聚化、反磷酸化和激活引起，这导致了特殊信号转导途径和成纤维细胞生长因子靶基因的激活，特别是在胚胎形成、发育、血管再生和组织修复中是至关重要的，fgfr3基因的突变在人类多种常染色体中被发现，其可导致骨骼发育异常综合症，包括软骨发育不全、骨骼发育不良、发育迟缓和黑棘皮症及致死性侏儒样发育异常症i型和ii型，其突变在长骨的软骨发育成熟过程中起重要的作用。研究发现在一些肿瘤组织中也常常检测出fgfr3的突变：膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、血液肿瘤、皮肤癌等。免疫学研究证实，cd8阳性t淋巴细胞ctl发挥细胞免疫的原理为，ctl细胞通过识别与mhc-i分子结合的抗原肽被激活，激活的ctl可以杀死相应的靶细胞，发挥免疫监视作用。发明人通过t细胞表位预测综合平台netctl数据库(http://www.cbs.dtu.dk/services/netctl)在线分析，通过生物信息学预测，发现cosm714、cosm715、cosm716、cosm17461、cosm718的突变多肽能够与mhc-i类分子结合，说明该位点是免疫清除fgfr3基因突变细胞的重要靶点。技术实现要素：基于此，本发明提供肿瘤相关基因fgfr3突变短肽及其应用。本发明采取的技术方案是：fgfr3突变短肽，其序列为seqidno:2-seqidno:27中的一条。如seqidno:2-seqidno:27所述的fgfr3突变短肽能够诱导特异性细胞毒性t淋巴细胞的产生。特异性细胞毒性t淋巴细胞的诱导方法，使用seqidno:2-seqidno:27的fgfr3突变短肽中的至少一条经抗原提呈细胞与cd8+t细胞共培养，诱导得到fgfr3突变特异性细胞毒性t细胞。一种多肽疫苗，由活性抗原成分和辅剂组成，活性抗原成分为如seqidno:2-seqidno:27所述的fgfr3突变短肽中的至少一条。一种用于fgfr3突变防治的dc疫苗，主要由seqidno:2-seqidno:27所述的fgfr3突变短肽中的至少一条和树突状细胞加载得到。本发明通过生物信息学技术预测fgfr3突变序列与t淋巴细胞受体(tcr)及mhci类分子的结合能力，同时分析其表达定位于细胞膜外，筛选出多肽序列：seq:2-27，所筛选出的fgfr3抗原肽具有与dc细胞上mhci分子高度的亲和力并能有效地刺激、诱导产生特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctls)，说明其具备良好的多肽疫苗及dc疫苗的潜力，并且提示其具有良好的临床转化及疾病预防前景。附图说明：图1是fgfr3seq2特异性ctlifn-γ释放实验；图2是fgfr3seq4特异性ctlifn-γ释放实验；图3是fgfr3seq9特异性ctlifn-γ释放实验；图4是fgfr3seq11特异性ctlifn-γ释放实验；图5是fgfr3seq17特异性ctlifn-γ释放实验；图6是fgfr3seq23特异性ctlifn-γ释放实验。具体实施方式fgfr3基因介绍：fgfr3基因定位于人类染色体4p16.3，长约16.5kb，由19个外显子和18个内含子组成。fgfr3的cdna大小为4.4kb，可译框架有2421个核苷酸(如seqidno:28所示)，编码806个氨基酸组成的蛋白(如seqidno.1所示)。研究发现，在多种肿瘤组织中检测到fgfr3基因突变，尤其是在泌尿系统肿瘤中。fgfr3氨基酸序列为：(seqidno:1)下面结合实验，进一步地说明本发明的技术方案。fgfr3基因突变肽的t细胞表位预测：本发明通过t细胞表位预测数据综合平台(http://www.cbs.dtu.dk/services/netctl)，预测与t细胞表位及mhci类分子高亲和力的多肽序列，所得候选肽由专业公司合成，多肽序列与mhci类分子结合，具体如表1：表1pos序列seqidno:pos序列seqidno:241ldvlecsphrpi2268eadeacsvyagi15241ldvlercphrpi3268eadeacsvyag16241dvlecsphrpi4268eadeagcvyagil17242vlecsphrpi5268eadeagcvyagi18243ldvlecsphrp6268eadeagcvyag19243ldvlecsphr7269adeagcvyagil20243ldvlercphrp8268deagcvyagil21243ldvlercphr9268deagsvcagilsy22244dvlercphrpi10268deagsvcagils23245vlercphrpi11268deagsvcagil24265eadeacsvyagil12269eagsvcagilsy25266adeacsvyagil13270agsvcagilsy26267deacsvyagil14271gsvcagilsy27基于预测结果，本发明随机挑选其中8条进行实验，具体实验如下：fgfr3短肽特异性ctl克隆建立的操作如下:同一健康捐献者的105个cd8+t细胞通过负载fgfr3肽的104个mo-dcs间隔1周刺激2次后，再通过自体105个丝裂霉素c处理过的负载fgfr3短肽的pbmc刺激1次后，经标准细胞毒试验筛选获得。t2细胞加载5umfgfr3短肽作为靶细胞，ctl的fgfr3短肽特异性细胞毒性通过ldh释放试验得以证实。采用以上体外诱导建立fgfr3短肽特异性ctl克隆的方法，发明人还建立了mhci限制性ctl克隆，通过工ifn-γ释放试验证实其多肽特异性免疫应答效应。如图1至图6，其中，图1：1表示seqidno:2多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；图2：1表示seqidno:4多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；图3：1表示seqidno:9多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；图4：1表示seqidno:11多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；图5：1表示seqidno:17多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；图6：1表示seqidno:23多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽。上述实验数据表明，本发明所建立的ctl表位是极其有效的，预测结果与实验结果符合性非常好。可见，通过将上述fgfr3短肽中的至少一条(seqno:2-seqno:27)经抗原提呈细胞与细胞毒性淋巴t细胞共培养，可诱导筛选得到肿瘤抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞。这种fgfr3突变抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞可用于肿瘤的预防。将上述fgfr3短肽中的至少一条(seq：2-seqno:27)与树突状细胞(dendriticcell,dc)加载回输，可以作为dc疫苗用于肿瘤免疫，刺激机体产生多肽特异性抗细胞毒性t细胞，进而实现fgfr3基因突变相关肿瘤的预防和治疗。本发明的fgfr3短肽长度仅为10-14个氨基酸，化学合成难度小，可以直接合成得到高纯的产物，应用成本大大降低，同时效果明确，具有很好的应用潜力。序列表<110>生命谷（海南）生物科技股份有限公司<120>肿瘤相关基因fgfr3突变短肽及其应用<160>28<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>806<212>prt<213>人(homosapiens)<400>1metglyalaproalacysalaleualaleucysvalalavalalaile151015valalaglyalasersergluserleuglythrgluglnargvalval202530glyargalaalagluvalproglyprogluproglyglnglnglugln354045leuvalpheglyserglyaspalavalgluleusercyspropropro505560glyglyglyprometglyprothrvaltrpvallysaspglythrgly65707580leuvalprosergluargvalleuvalglyproglnargleuglnval859095leuasnalaserhisgluaspserglyalatyrsercysargglnarg100105110leuthrglnargvalleucyshispheservalargvalthraspala115120125proserserglyaspaspgluaspglygluaspglualagluaspthr130135140glyvalaspthrglyalaprotyrtrpthrargprogluargmetasp145150155160lyslysleuleualavalproalaalaasnthrvalargpheargcys165170175proalaalaglyasnprothrproserilesertrpleulysasngly180185190argglupheargglygluhisargileglyglyilelysleuarghis195200205glnglntrpserleuvalmetgluservalvalproserasparggly210215220asntyrthrcysvalvalgluasnlyspheglyserileargglnthr225230235240tyrthrleuaspvalleugluargserprohisargproileleugln245250255alaglyleuproalaasnglnthralavalleuglyseraspvalglu260265270phehiscyslysvaltyrseraspala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