一种布舍瑞林的液相合成方法与流程

本发明涉及一种化合物的制备方法，具体涉及布舍瑞林的液相合成方法。

背景技术：

布舍瑞林是一种促性腺素释放激素（gnrh）类似物，其结构序列为：pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg-pro-nhet。其结构式如下所示：

目前合成布舍瑞林的方法有固相法、液相法还有固液结合法。固相合成方法主要是国内的专利报道，涉及到不同的全保护肽的策略选择，然后通过不同的保护剂脱除法进行脱保护获得产品。深圳翰宇制药布舍瑞林制备方法（申请号201410185283.1），采用his(trt)、tyr(bzl)、arg(no2)的保护策略，先用金属催化剂pd催化脱除bzl和no2，再用5%的tfa脱除保护剂，进行纯化后得到成品。中国公开专利文献（申请号201010256054.6）报道一种固相制备布舍瑞林的方法：先合成全保护九肽，然后进行乙胺化，最后脱除保护剂得到布舍瑞林产品。以上两种方法最后脱除侧脸保护剂，会导致部分ser的侧链保护剂脱除而生成杂质。中国公开专利文献（申请号201510005951.2）采用的保护策略为his(trt)、tyr(bzl)、arg(no2)，脱保护方法采用tfa脱除酸敏感保护剂trt，再用pd催化剂脱除bzl和no2保护剂。存在一个问题，用tfa脱保护剂，必将使得ser(otbu)侧链损失，形成杂质。中国公开专利文献（申请号201410269996.6）采用了片段法合成全保护肽，最终氢化得到布舍瑞林。但是该方法也未摆脱常规缩合方法，导致成本偏高，且产生较多的杂质，不易纯化。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的上述缺陷，提供了一种适合放大生产、收率高、纯度好的布舍瑞林液相合成方法，采用了5+4的片段合成法。

本发明所要解决的技术方案是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种布舍瑞林的液相合成方法，其特点是：所述的布舍瑞林pyr-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-nhet是在液相条件下由五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh与四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4å的分子筛作用下缩合反应、脱保护而成。

进一步地，所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh由以下步骤合成：首先合成r1-pyr的活化酯，再与羧基端保护his(r2)反应，生成r1-pyr-his(r2)；合成r1-pyr-his(r2)的活化酯，与羧基端保护trp(r3)-r11反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)的活化酯，与羧基端保护ser(r4)-r11反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)的活化酯，与nh2-tyr(r5)-r11反应，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh还可以由以下步骤合成：首先合成tyr(r5)-r11，再与α氮端保护的r12-ser(r4)反应，生成r12-ser(r4)-tyr(r5)-r11，脱保护，与α氮端保护的r13-trp(r3)反应，生成r13-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11，脱保护，与α氮端保护的r14-his(r2)反应，生成r14-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11，脱保护，与α氮端保护的r1-pyr反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11，最后进行皂化，得到五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

上述五肽片段的合成步骤中，r1可以为boc、z、fmoc或h；r2可以为boc、z、bzl、trt、tos、bom、dnp或h；r3可以为boc、for、h或z；r4可以为bzl、h、tbu、z、boc或tos；r5可以为bzl、h、tbu、2，6-di-cl-bzl、me、z或2-cl-z；r11为r11为ome、oet、otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐；r12可以为boc、z或fmoc；r13可以为boc、z或fmoc；r14可以为boc、z或fmoc。

进一步地，所述的四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r8-pro-nhet，脱保护，再与α氮端保护、侧链r7保护的r9-arg(r7)-oh反应，生成α氮端保护的r9-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与α氮端保护的r10-leu-oh反应，生成α氮端保护的r10-leu-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与r6-d-trp-oh反应，生成r6-d-trp-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet。

所述的四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-ser(r4)的活化酯，然后与羧基端保护leu-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu；合成r6-d-ser(r4)-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)；合成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-nhet反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet。

所述的四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-ser(r4)的活化酯，然后与羧基端保护leu-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu；合成r6-d-ser(r4)-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)；合成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-oh；生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-oh与nh2et，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet。

上述四肽片段的合成步骤中，r6可以为boc、z或fmoc；r7可以为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts；r8可以为boc、z或fmoc；r9可以为boc、z或fmocr10可以为boc、z或fmoc。r11为ome、oet、otbu、苄酯、者有机盐、无机盐。

本发明中的名词说明如下：

r1-pyr为氨基r1保护的焦谷氨酸；

his(r2)为侧链r2保护的组氨酸；

trp(r3)为侧链r3保护的色氨酸；

ser(r4)为侧链r4保护的丝氨酸；

tyr(r5)为侧链r5保护的酪氨酸；

leu为亮氨酸；

arg(r7)为侧链r7保护的精氨酸；

pro为脯氨酸；

r14-his(r2)为α氮端r14保护、侧链r2保护的组氨酸；

r13-trp(r3)为α氮端r13保护、侧链r3保护的色氨酸；

r12-ser(r4)为α氮端r12保护、侧链r4保护的丝氨酸；

tyr(r5)为侧链r5保护的酪氨酸；

nh2-his(r2)-r11为羧基端r11保护、侧链r2保护的组氨酸；

nh2-trp(r3)-r11为羧基端r11保护、侧链r3保护的色氨酸；

nh2-ser(r4)-r11为羧基端r11保护、侧链r4保护的丝氨酸；

tyr(r5)-r11为羧基端r11保护、侧链r5保护的酪氨酸；

nh2et为乙基氨；

r8-pro为α氮端r8保护的脯氨酸；

r9-arg(r5)为α氮端r9保护、侧链r5保护的精氨酸；

r10-leu为α氮端r10保护的亮氨酸；

r6-d-ser(r4)为α氮端r6保护、d型-侧链r4保护的丝氨酸。

与现有技术相比，本发明方法采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段和四肽片段在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4å的分子筛作用下缩合形成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet。本发明方法可以同时开展两个片段的合成，耗时只要逐个偶联的一半，不但避免了5+4片段合成中各类缩合试剂的使用，缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、易于纯化、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。

附图说明

图1为实施例合成的布舍瑞林的质谱图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1、一种布舍瑞林的液相合成方法，所述的布舍瑞林pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg-pro-nhet是在液相条件下由五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11与四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4å的分子筛的作用下缩合反应、脱保护而成；

其中：r1为boc、z、fmoc或h；

r2为boc、z、bzl、trt、tos、bom、dnp或h；

r3为boc、for、h或z；

r4为bzl、h、tbu、z、boc或tos；

r5为bzl、h、tbu、2，6-di-cl-bzl、me、z或2-cl-z；

r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts。

所述的缩合反应通过催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4å的分子筛催化反应完成，通过混合酸酐完成缩合反应。

所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11由以下步骤合成：首先合成tyr(r5)-r11，再与α氮端保护的r12-ser(r4)反应，生成r12-ser(r4)-tyr(r5)-r11，脱保护，与α氮端保护的r13-trp(r3)反应，生成r13-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11，脱保护，与α氮端保护的r14-his(r2)反应，生成r14-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11，脱保护，与α氮端保护的r1-pyr反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11，得到五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh；

其中：r11为ome、oet、otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐；

r12为boc、z或fmoc；

r13为boc、z或fmoc；

r14为boc、z或fmoc。

所述的四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r8-pro-nhet，脱保护，再与α氮端保护、侧链r7保护的r9-arg(r7)-oh反应，生成α氮端保护的r9-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与α氮端保护的r10-leu-oh反应，生成α氮端保护的r10-leu-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与r6-d-ser(r4)-oh反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；

其中：r8为boc、z或fmoc；

r9为boc、z或fmoc；

r10为boc、z或fmoc。

实施例2、一种布舍瑞林的液相合成方法，所述的布舍瑞林pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg-pro-nhet是在液相条件下由五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-r11与四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4å的分子筛的作用下缩合反应、脱保护而成；

其中：r1为boc、z、fmoc或h；

r2为boc、z、bzl、trt、tos、bom、dnp或h；

r3为boc、for、h或z；

r4为bzl、h、tbu、z、boc或tos；

r5为bzl、h、tbu、2，6-di-cl-bzl、me、z或2-cl-z；

r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts。

所述的缩合反应通过催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4å的分子筛催化反应完成，通过活化酯反应完成缩合反应。

所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh由以下步骤合成：首先合成r1-pyr的活化酯，再与羧基端保护his(r2)-r11反应，生成r1-pyr-his(r2)；合成r1-pyr-his(r2)的活化酯，与羧基端保护trp(r3)-r11反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)的活化酯，与羧基端保护ser(r4)-r11反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)的活化酯，与nh2-tyr(r5)-r11反应，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh；

其中：r11为ome、oet、otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐。

所述的四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-ser(r4)的活化酯，然后与羧基端保护leu-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu；合成r6-d-ser(r4)-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)；合成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-nhet反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；

或者，所述的四肽片段r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-ser(r4)的活化酯，然后与羧基端保护leu-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu；合成r6-d-ser(r4)-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)；合成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-r11反应，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-oh；生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-oh与nh2et，生成r6-d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-ser(r4)-leu-arg(r7)-pro-nhet；

实施例3，一种布舍瑞林的液相合成方法实验：

一、合成五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh

1、boc-pyr-his(trt)-oh的合成：

溶液1：称取100毫摩的boc-pyr-oh、120毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2：称取120毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用

溶液3：称取130毫摩的nh2-his(trt)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用

在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。

hplc纯度：大于95.5%，收率为92.4%。

2、boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-oh的合成：

溶液1：称取100毫摩的boc-pyr-his(trt)-oh、120毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2：称取120毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用

溶液3：称取130毫摩的nh2-trp(boc)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用

在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。

hplc纯度：大于95.2%，收率为88.5%。

3、boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-oh的合成：

溶液1：称取100毫摩的boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-oh、120毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2：称取120毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用

溶液3：称取130毫摩的nh2-ser(tbu)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用

在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。

hplc纯度：大于93.3%，收率为85.5%。

4、boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh的合成：

溶液1：称取100毫摩的boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-oh、120毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2：称取120毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用

溶液3：称取130毫摩的nh2-tyr(tbu)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用

在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。

hplc纯度：大于92.8%，收率为83.4%。ms=1478.5

二、合成四肽片段d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet

1、fmoc-pro-nhet的合成

称取fmoc-pro-oh(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中，用55毫升dmf溶解，之后加入hosu(22mmol)，冰水浴下加入dcc(22mmol)的dmf溶液20毫升，室温下反应4小时，滤除沉淀，将溶液浓缩至40毫升，加入浓乙胺水溶液20毫升，室温下反应过夜，点板反应完成，滤除沉淀，将溶液除去，用大量乙酸乙酯溶解，用稀碱洗涤，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到浅黄色固体(fmoc-pro-nhet)。

hplc纯度：大于93.1%，收率为93.2％。

2、fmoc-arg(no2)-pro-nhet的合成

称取fmoc-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-pro-nhet)。

在50毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-arg(no2)-oh(20mmol)，nh2-pro-nhet(20mmol)，hosu(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用nahco3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(fmoc-arg(no2)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于92.2%，收率为91.6％。

3、fmoc-leu-arg(no2)-pro-nhet的合成

称取fmoc-arg(no2)-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-arg(no2)-pro-nhet)。

在50毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-leu-oh(20mmol)，nh2-arg(no2)-pro-nhet(20mmol)，hosu(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用nahco3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(fmoc-leu-arg(no2)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于93%，收率为90％

4、fmoc-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet的合成

称取fmoc-leu-arg(no2)-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-leu-arg(no2)-pro-nhet)。

在50毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-d-ser(otbu)-oh(20mmol)，nh2-leu-arg(no2)-pro-nhet(20mmol)，hosu(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用nahco3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(fmoc-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于94.5%，收率为88.1％

5、d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet的合成

称取fmoc-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于93.5%，收率为91％。

三、pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet的合成

在50毫升的圆底烧瓶中加入boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh(20mmol)，在室温下加入脱保护试剂（tfa：苯甲硫醚：水：edt=92:4:2:2）200ml，室温下裂解1.5小时，将裂解液倒入预先冷却好的（0℃）无水乙醚中，搅拌沉降3小时，离心，用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到白色固体,pyr-his-trp-ser-tyr-oh。

在50毫升的圆底烧瓶中加入pyr-his-trp-ser-tyr-oh(20mmol)，用无水dmf40毫升溶解，加入nh2-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet(20mmol)的dmf溶液20毫升，加入2-碘-4-甲氧基-苯硼酸(0.1mmol)和直径4å的分子筛（2g），加入磁子后在室温下搅拌2小时，检测反应完全。过滤回收分子筛，慢慢滴加饱和碳酸氢钠溶液100ml，产生大量白色沉淀，过滤得到白色产品，用100ml纯水打浆洗涤白色沉淀，过滤并合并滤液。白色产品为pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet。

hplc纯度：大于90.3%，收率为85.5%

滤液浓缩除去水分，得到白色沉淀，过滤除去dmf，固体用3ml水溶解，用稀柠檬酸调节ph值至2-3，产生大量白色沉淀，过滤，纯水洗涤，回收催化剂。

四、pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg-pro-nhet的合成

称取20毫摩的pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg(no2)-pro-nhet置于100ml的氢化反应釜中，加入四氢呋喃60ml加入5%的pd/c催化剂0.1g，氢气置换釜内空气，置换3次后，加压至2mpa，室温反应15h，hplc检测反应结束。过滤回收催化剂备用。旋蒸除去溶剂，获得白色固体。采用制备柱对产品进行纯化制备。hplc纯度：大于99.5%，收率为85.1%ms＝1239.4223，其

质谱图参照图1。