一种柱状田头菇抗氧化肽及其用途的制作方法

本发明属于生物领域，涉及一种柱状田头菇抗氧化肽及其用途。
背景技术：
：目前，人们从动物、植物和微生物中分离、制备得到了多种生物活性肽，这些活性肽有多种生理功能，如抗氧化、降血脂、抑制病毒等。其中抗氧化性多肽是具有特定氨基酸序列的肽段从一些原隐藏于蛋白质分子的内部中释放出来，通过清除氧自由基、羟自由基等达到抗氧化的作用，相较与合成抗氧化剂，其安全性较高，它不仅能够防止食品体系中的氧化，而且可以防止人体内自由基的危害，延缓衰老导致的各种退化性疾病，如癌症、冠心病、糖尿病等。柱状田头菇(agrocybeaegerita)又名茶树菇，属伞菌目、粪锈伞科、田蘑属，是食用菌中的珍贵品种。其味道鲜美，营养价值高，有降压、抗肾炎、抗水肿等功效，有“中华神菇”之美誉。主要在我国福建省、广东省和广西省栽培，年生产量达100万吨。我国是世界食用菌生产大国，但是主要是以初级加工农产品为主，精深加工较少。cn102224879a公开了一种香菇多肽的制备方法，具有调节血脂及抗疲劳作用；cn101709320a公开了一种香菇多肽粉的制备方法，主要用于保健品和食品加工领域，这些文献都是利用香菇粉蛋白进行酶解制备活性肽。目前关于柱状田头菇抗氧化肽的文献报导较少。技术实现要素：本发明的目的是提供一种柱状田头菇抗氧化肽。本发明所提供的柱状田头菇抗氧化肽是按以下方法制备而成：①称取柱状田头菇子实体粉，加水温浸提取，离心后向浸提液中加入饱和硫酸铵进行盐析，将盐析后的沉淀用水溶解，然后经截留分子量为3000-4000da的透析袋透析，将透析后的沉淀烘干，得到柱状田头菇粗蛋白；②向粗蛋白中加入20-50倍重量的水，调节ph至7.5-8.5，再按照粗蛋白重量的1-5％加入中性蛋白酶，50-60℃酶解5-10小时，然后煮沸灭活后离心，收集滤液；③将滤液先经微滤膜过滤，然后用截留分子量为3000-4000da的超滤膜进行超滤，收集超滤液；④将超滤液经制备级高效液相色谱仪进一步分离组分，采用prc-ods色谱柱，以0.05-0.5％(体积百分比)三氟乙酸与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱，215nm下检测，根据出峰位置收集第二组分，浓缩，干燥后即得。优选地，所述温浸提取的温度为50-80℃，时间为2-8小时。优选地，所述硫酸铵的饱和度为80％。优选地，所述微滤膜的孔径为0.22μm。优选地，所述超滤膜的截留分子量为3500da。根据本发明的一个实施例，最佳的制备工艺是：1)称取柱状田头菇子实体粉，加入10倍重量的水，60℃温浸提取4小时，离心后向浸提液中加入饱和硫酸铵进行盐析，至硫酸铵的饱和度为80％，将盐析后的沉淀用水溶解，然后经截留分子量为3000-4000da的透析袋透析，将透析后的沉淀烘干，得到柱状田头菇粗蛋白；2)向粗蛋白中加入35倍重量的水，调节ph至8.0，再按照粗蛋白重量的3％加入中性蛋白酶，50℃酶解6小时，然后煮沸灭活后离心，收集滤液；3)将滤液先经孔径为0.22μm的微滤膜过滤，然后用截留分子量为3500道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液；4)将超滤液经制备级高效液相色谱仪进一步分离组分，采用prc-ods色谱柱，以0.1％三氟乙酸与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱(洗脱流程见表1)，流速为1ml/min，215nm下检测，根据出峰位置收集第二组分，浓缩，干燥后即得。表1梯度洗脱流程洗脱时间0.1％三氟乙酸相乙腈相0～5min100→95％0→5％5～25min95→85％5→15％25～40min85→80％15→20％40～45min80→70％20→30％45～50min70→60％30→40％经检测，所得柱状田头菇抗氧化肽含有氨基酸序列为paqpppppnr的肽段。本发明的有益效果是：1)本发明首次从柱状田头菇中分离得到一种生物活性肽，并验证了其抗氧化活性，可作为添加剂用于制备保健品、食品、化妆品和日化用品。2)本发明提供的柱状田头菇抗氧化肽具有纯度高、产量大等优点，实现了柱状田头菇子的深加工与利用，提高了产品附加值。附图说明图1为柱状田头菇抗氧化肽的半制备高效液相色谱图，图中共有三个分离组分，本发明为第二组分(出峰时间在第32分钟)。图2为柱状田头菇抗氧化肽所含paqpppppnr肽段质谱图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。实施例11)称取柱状田头菇子实体粉1kg，加入10倍重量的水，60℃浸提4小时，离心后向浸提液中加入饱和硫酸铵进行盐析，硫酸铵终浓度的饱和度为80％。将盐析后的沉淀用水溶解，然后经截留分子量为4000da的透析袋透析，将透析后的沉淀烘干，得到柱状田头菇粗蛋白；2)向粗蛋白中加入35倍重量的水，调节ph至8.0，再按重量加入3％的中性蛋白酶(比活力为2.0万国际单位)，50℃酶解6小时，然后煮沸灭活后离心，收集滤液；3)将滤液先经0.22μm的滤膜微滤，然后用3500道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液；4)将超滤液经制备级高效液相色谱仪(hplc)进一步分离纯化，采用prc-ods柱(250mm×20mm,5μm,shimadzu,japan)，0.1％三氟乙酸与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱(洗脱流程见表1)，流速为1ml/min，215nm下检测，根据出峰位置收集第二组分(结果见图1，经检测，第二组分的抗氧化活性明显高于其它两个组分)，浓缩，干燥，得到柱状田头菇抗氧化肽15.7g，纯度91.8％(参考标准：gb18186-2000)。实施例21)称取柱状田头菇子实体粉1kg，加入20倍重量的水，搅拌均匀，80℃浸提3小时，离心后向浸提液中加入饱和硫酸铵进行盐析，硫酸铵终浓度的饱和度为80％。将盐析后的沉淀用水溶解，然后经截留分子量为3000da的透析袋透析，将透析后的沉淀烘干，得到柱状田头菇粗蛋白；2)向粗蛋白中加入25倍重量的水，调节ph至7.5，再按重量加入4％的中性蛋白酶，60℃酶解5小时，然后煮沸灭活后离心，收集滤液；3)将滤液先经0.22μm的滤膜微滤，然后用3500道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液；4)将超滤液经制备级高效液相色谱仪进一步分离纯化，采用prc-ods柱，0.05％三氟乙酸与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱(洗脱流程与实施例1相同)，流速为1ml/min，215nm下检测，根据出峰位置收集第二组分，浓缩，干燥，得到柱状田头菇抗氧化肽14.6g，纯度90.5％。实施例31)称取柱状田头菇子实体粉1kg，加入6倍重量的水，搅拌均匀，65℃浸提5小时，离心后向浸提液中加入饱和硫酸铵进行盐析，硫酸铵终浓度的饱和度为80％。将盐析后的沉淀用水溶解，然后经截留分子量为4000da的透析袋透析，将透析后的沉淀烘干，得到柱状田头菇粗蛋白；2)向粗蛋白中加入50倍重量的水，调节ph至8.5，再按重量加入2％的中性蛋白酶，55℃酶解10小时，然后煮沸灭活后离心，收集滤液；3)将滤液先经0.22μm的滤膜微滤，然后用3500道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液；4)将超滤液经制备级高效液相色谱仪进一步分离纯化，采用prc-ods柱，0.5％三氟乙酸与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱(洗脱流程与实施例1相同)，流速为1ml/min，215nm下检测，根据出峰位置收集第二组分，浓缩，干燥，得到柱状田头菇抗氧化肽15.2g，纯度91.1％。试验1：抗氧化活性检测使用总抗氧化能力检测试剂盒，采用abts法测定抗氧化肽的自由基清除能力。测得实施例1-3所得抗氧化肽的抗氧化活性分别为1.62umolte/mg、1.55umolte/mg、1.58umolte/mg。由上述结果可知，本发明制备的柱状田头菇抗氧化多肽具有很高的抗氧化活性。试验2：氨基酸序列分析将上述分离纯化得到的组分通过液相色谱-质谱联用法(hplc-ms/ms)鉴定抗氧化肽的氨基酸序列，并通过对柱状田头菇蛋白数据库搜索，鉴定肽段的序列。所述柱状田头菇抗氧化肽含有氨基酸序列为paqpppppnr的特征肽段，分子量为1069.5g/mol(质谱结果见图2)。实施例4植物蛋白饮料由以下重量配比的成分组成：核桃果仁，6％，主料；豌豆蛋白，2％，增加蛋白含量，增加稳定性；实施例1中得到的柱状田头菇抗氧化肽，0.5％，抗氧化剂，减缓核桃中不饱和脂肪酸的氧化；蔗糖，6％，甜味料；单硬脂酸甘油酯，0.16％，乳化剂；蔗糖脂肪酸酯，0.012％，乳化剂；大豆磷脂，4％，乳化剂；羧甲基纤维素钠，0.04％，稳定剂；三聚磷酸钠，0.06％，稳定剂；琼脂，0.15％，增稠剂；碳酸氢钠，0.03％，调节ph；纯净水，余量。制备方法：按常规方法制成乳液，灭菌，灌装即得。柱状田头菇蛋白酶解肽，可以增加对植物蛋白饮料中不饱和脂肪酸的抗氧化保护功能，又提高了产品的蛋白含量，增加了乳化性。可作为绿色、安全、健康的多功能食品配料。实施例5化妆水由以下重量配比的成分组成：制备方法：将以上各成分混匀，灭菌，即得。抗氧化肽可被皮肤迅速吸收，主要起清除自由基作用。实施例6宠物食品由以下重量配比的成分组成：制备方法：将以上各成分混匀，灭菌，倒模成形即得。柱状田头菇蛋白酶解肽作为饲料用营养补充剂，既能作为天然抗氧化剂起到清除体内自由基作用，活性肽本身还可迅速补充动物蛋白质营养，促进生长，增强动物免疫力。实施例7沐浴露由以下重量配比的成分组成：制备方法：按照以上比例添加，搅拌均匀即得。抗氧化肽可被皮肤迅速吸收，起到清除自由基作用。当前第1页12