一种抗多重耐药鲍曼不动杆菌的多肽的制作方法

本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种抗多重耐药鲍曼不动杆菌的多肽。

背景技术：

鲍曼不动杆菌容易耐受传统抗生素，是造成医院内感染和社区获得性感染的重要病原微生物，严重威胁着人类健康。全国细菌耐药监测网的最新统计数据显示，鲍曼不动杆菌占耐药菌总量的10.7％。广泛耐药鲍曼不动杆菌的医院检出率从2008年的10.9％已增至2015年的19.7％。目前，临床防治耐药鲍曼不动杆菌感染的药物极为短缺，部分具有明显毒副作用的抗生素，如多粘菌素，仍在一线使用中。

哺乳动物体内存在着一类低分子量、两亲性(亲水、亲脂)抗菌肽。由于富含碱性氨基酸，抗菌肽大多带较强的正电荷。细菌外膜富含负电荷磷脂，为抗菌肽的静电作用提供了关键靶点。吸附在细菌外膜上的多肽进一步聚合，或诱导菌膜去极化，或以“地毯”、“打孔”等方式破坏细菌脂膜，使细菌死亡(brogden,k.a.,natrevmicrobiol,2005,3:239-250)。真核细胞外膜由电中性的磷脂组成，抗菌肽能够“选择性”地规避与宿主细胞静电吸附，具有较好的安全性。区别于传统抗生素“点对点”的抗菌模式，抗菌肽“点对面”的杀菌机制使细菌很难产生耐药突变。ll37是由人表皮细胞分泌的正电荷线性抗菌肽，抗鲍曼不动杆菌作用强，有望被开发为新型抗生素(lin,m.f.etal,plosone,2015,10:e0141107)。

化学合成法简单直接，更利于药物的大规模工业制备。ll37由37个左旋氨基酸组成(llgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes)，合成成本高，不利于药物开发。此外，既往结构-效应关系研究揭示ll37有一定的细胞毒性，而多肽n端氨基酸去除有利于改善其生物安全性(zivoren.etal,biochem.j,1999,341,501-513)。

综上所述，多重耐药鲍曼不动杆菌感染严重威胁人类健康，临床传统抗生素在使用的过程中存在着毒副作用，ll37虽然具有较强的抗鲍曼不动杆菌作用，但其无论是通过重组表达还是通过化学合成，成本均较高，不利于工业化制备生产，此外，ll37的生物安全性能也较差。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种抗多重耐药鲍曼不动杆菌的多肽，用以解决现有抗生素短缺、治疗效果有限、副作用大的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种多肽，其具有如下(a)或(b)：

a)由氨基酸序列krivkrikiflr组成的多肽；

b)将krivkrikiflr经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失或添加且具有抗菌作用的衍生多肽。

优选的，所述多肽在水溶液中呈无规则卷曲，在脂质环境中呈螺旋结构。

优选的，所述氨基酸为左旋氨基酸。

本发明实施例所表达权利要求1所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。

优选的，所述基因是如下1)或2)或3)的dna分子：

1)序列为aagaggaucgugaagaggaucaagaucuuccugagg的dna分子；

2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有抗菌作用的多肽的dna分子；

3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且编码具有抗菌作用的多肽的dna分子。

所述的多肽在制备抗多重耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用也属于本发明的保护范围。

优选的，所述多重耐药鲍曼不动杆菌为包括头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类的耐药菌种。

本发明实施例具有如下优点：

本发明抗多重耐药鲍曼不动杆菌多肽的设计通过结构-效应关系研究，筛选出天然ll37多肽抗菌的核心区域，加以功能强化，简化了多肽合成，节省了制备成本，改善了生物安全性，研制出高效、安全的抗耐药鲍曼不动杆菌药物，具有重要的社会意义。

附图说明

图1为本发明的q5kd9i-kr12多肽设计图。

图2为本发明的q5kd9i-kr12多肽液相色谱图。

图3为本发明的q5kd9i-kr12多肽质谱鉴定图。

图4为ll37多肽和本发明的q5kd9i-kr12多肽在水溶液和十二烷基磺酸钠(sds)溶液中的圆二色谱扫描曲线图。

图5a和5b为本发明的q5kd9i-kr12多肽生物安全性评估结果柱状图。

图6为本发明的q5kd9i-kr12多肽放射创面感染动物实验的结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下面将更详细地描述本发明的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽的设计

如图1所示，本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽是根据ll37的结构-效应关系研究结果设计，本发明实施例的多肽命名代号为q5kd9i-kr12多肽。ll37多肽由37个氨基酸组成，结构相对复杂，化学合成成本较高。ll37的氨基酸序列可以分成三段(ll17，kr12，nl8)，中间序列kr12是其抗多重耐药鲍曼不动杆菌(陆军军医大学西南医院分离鉴定，见文献wangc.etal,antimicrobagentsch,2018,62(2):e01504-17)的核心区域(表1)。本发明实施例q5kd9i-kr12多肽是通过将kr12的5号位点谷氨酰胺替换为赖氨酸(gln→lys)，9号位点天冬氨酸替换为异亮氨酸(asp→ile)而得。q5kd9i-kr12多肽的氨基酸序列seqidno:1为：krivkrikiflr，抗菌功能较kr12显著增强，并与ll37的抗菌功能相近。由于氨基酸序列组成简单，q5kd9i-kr12多肽容易合成，制备成本低，其为一种潜在的新型抗生素。

表1为抗菌肽及传统抗生素杀灭鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(mic，μg/ml)

实施例2本发明的实施例的q5kd9i-kr12多肽的基因表达

本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽基因是如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列seqidno:2为aagaggaucgugaagaggaucaagaucuuccugagg的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有抗菌作用的多肽的dna分子；3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且编码具有抗菌作用的多肽的dna分子。

上述基因的表达及其多肽的生产，均是按照本领域技术人员常规的基因工程的操作手段完成获得。

实施例3本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽微量肉汤稀释法抗菌实验

(1)按100ml培养基溶解1.5g琼脂粉(上海生工，aj637)制备mhb(oxiod,cm0337)平板，培养基凝固后以封口膜密封，4℃储存备用。

(2)吸取10μl多重耐药鲍曼不动杆菌菌液，三线法接种细菌至mhb平板上。倒置，37℃细菌培养箱，过夜培养。

(3)以无菌枪头挑取单克隆细菌，接种到10ml灭菌mhb培养基中，37℃恒温摇床，200rpm，过夜培养。

(4)按1:100将细菌接种到10ml灭菌mhb培养基中，37℃恒温摇床，200rpm，培养至细菌对数生长期。吸取1ml菌液，4℃低温离心，8000rpm，5min。

(5)弃上清，以1mlmhb培养基重悬细菌，再次4℃低温离心，8000rpm，5min，反复清洗3次。

(6)mhb倍比稀释，将细菌浓度调整至2×10⁵cfu/ml，置于冰面备用。

(7)用0.01％醋酸(含0.2％bsa)溶液溶解多肽和抗生素，调整药物浓度至25、50、100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600μg/ml。

(8)灭菌聚丙烯96孔板(corning，3365)中分别加入100μl菌液(2×10⁵cfu/ml)和10μl不同浓度的抗菌药物，混匀，孔板加盖。37℃恒温孵箱中培养24h。

(9)酶标仪读取孔板600nm吸光度，读数前孔板平行震荡5s。按照hancock实验室改良的适于抗菌肽mic的读取标准(wum，etal.jbiolchem，1999，274:29-35)，杀菌率超过70％对应的多肽浓度为mic。阿米卡星(上海生工，a602234)、头孢克肟(上海生工，a601276)和环丙沙星(上海生工，a600310)的mic判断标准为杀菌率超过99％。

微量肉汤稀释法抗菌实验结果提示，本发明实施例q5kd9i-kr12多肽杀伤多重耐药鲍曼不动杆菌的mic为5.0μg/ml，与ll37多肽的效应相同(表1)。相比于传统抗生素阿米卡星、头孢克肟、环丙沙星(mic分别为160.0、640.0、320.0μg/ml)，q5kd9i-kr12多肽有明显的抗菌优势。

本发明实施例中，多重耐药鲍曼不动杆菌包括头孢菌素类(如头孢他啶或头孢吡肟)、碳青霉烯类(如亚胺培南)、β-内酰胺酶抑制剂(如头孢哌酮/舒巴坦)、氟喹诺酮类(如环丙沙星)和氨基糖苷类(如阿米卡星)。若对以上抗菌药物均耐药，包括头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/三唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星则称之为泛耐药鲍曼不动杆菌(pdr-ab)。

实施例4本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽化学合成及纯化

(1)固相化学合成：称取0.5g2-cl(trt)-cl树脂，加入多肽合成仪反应器中，用4ml二氯甲烷(dcm)浸泡5min，4ml二甲基甲酰胺(dmf)洗涤2次，dcm洗涤一次；加入126.36mgn'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-n-芴甲氧羰基-d-精氨酸(fmoc-arg(pbf)-oh)和6mldcm、0.2mln,n-二异丙基乙胺(diea)，反应90min；补加0.5ml分析甲醇和1mldcm,封闭反应20min后，用dmf洗涤4次，加入哌啶(20％哌啶+80％dmf),脱除9-芴甲氧羰基(fmoc)。dmf洗涤树脂5次，取少量树脂加入检测管中，加入2滴茚三酮(5g/100ml分析乙醇)，2滴吡啶,100℃条件下加热2min显色。

按照以下顺序分别称取氨基酸投料fmoc-leu-oh,fmoc-phe-oh,fmoc-ile-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-ile-oh,fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-val-oh,fmoc-ile-oh,fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-lys(boc)-oh，投料量为3倍摩尔量。将1-羟基苯并三唑(hobt)/n,n，-二异丙基碳二亚胺(dic)/dmf体系加入反应器中，加入5mldmf，反应1h后用dmf洗涤4次，20％哌啶/dmf溶液脱保护20min，直至最后lys脱保护结束，dmf洗涤4次，甲醇洗涤3次抽干。

将树脂倒入50ml离心管，加入切割液(三氟乙酸(tfa)/三异丙基硅烷(tis)/1,2-乙二硫醇(edt)/水＝95/2/2/1)，树脂/切割液为1g/10ml，室温切割1.5h。将液体过滤到50ml平底离心管，加入冰乙醚(滤液/乙醚＝1/8),摇匀后3000rpm离心2min，倒出上清液，再加入乙醚摇匀离心。按此方法洗涤离心三次，得到粗品。

(2)多肽纯化：多肽粗品用北京创新通恒lc3000液相色谱仪，江苏智润科技制备色谱柱(20×250mm,8μmdaisogel色谱填料)纯化，流动相a为0.1％tfa/水，b为0.1％tfa/乙腈，收集目标峰，获得纯品本发明实施例的q5rd9i-kr12多肽。

shimadzu高效液相色谱分析纯品q5rd9i-kr12多肽的纯度，分析柱为inertsilods-sp(4.6×250mm×5μm)，进样体积为30μl，流动相a为0.1％tfa/水，b为0.1％tfa/乙腈，流速1ml/min，检测波长220nm。如图2所示，本发明实施例q5rd9i-kr12多肽在9.295min处出峰，纯度达95.5％。如图3所示，shimadzulc-ms2010液相色谱质谱联用仪分析出峰产物的分子量为1569.3，与理论分子量1570.0差值小于1。

实施例5本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽二级结构分析

(1)用灭菌超纯水分别配制200μg/ml多肽和40mm十二烷基磺酸钠(sds)溶液(模拟脂环境，见文献wangc.etal,scirep,2016,6:22875)。移液器吸取125μl多肽溶液，分别与等体积超纯水和sds溶液混合，获得250μl浓度为100μg/ml的多肽水溶液和sds溶液，室温平衡1h。

(2)取200μl多肽或多肽-sds溶液，转移到1mm光程的石英池内，超声去泡。

(3)设置应用物理(appliedphotophysics)圆二色谱扫描仪的测量温度为27℃，记录样本190-260nm的椭圆度，间隔2nm读数一次，总扫描时间约73s。

(4)独立实验，重复3次，使用pro-datachirascan软件对测量结果进行平均平滑处理。

如图4所示，ll37多肽和本发明实施例q5kd9i-kr12多肽在水溶液和sds脂质环境中的圆二色谱扫描曲线。q5kd9i-kr12多肽在水溶液中成无规则卷曲，sds脂球中则为螺旋样结构。由此可见，结构简化和位点突变并未改变ll37多肽的结构特征，本发明实施例q5kd9i-kr12多肽仍具有较好的结构弹性。

实施例6本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽生物安全性评估

(1)溶血性评估：自陆军军医大学实验动物中心购买8周龄雌性balb/c小鼠，摘眼球取血，快速收集血液至灭菌ep管内；4℃低温12000rpm，离心10min，收集红细胞。以4倍体积的冷却pbs重悬沉淀红细胞，4℃低温12000rpm，离心10min，弃上清。再次低温600rpm离心10min，弃上清，去除血小板。4倍体积的冷却pbs再次重悬沉淀红细胞，制成20％红细胞工作液，置于冰上备用。

灭菌超纯水配制多肽浓度至50和100μg/ml，吸取100μl多肽或超纯水与100μl红细胞工作液至灭菌ep管内，移液器吹打混匀，37℃恒温培养箱15min。吸取100μl上清至96孔板内，用酶标仪测定od570吸光度值。

多肽与红细胞共孵育后的吸光度计为apep，无药物处理阴性对照组吸光度计为ablank,tritonx-100100％溶血吸光度计为atot。多肽溶血性按(apep-ablank)/(atot-ablank)×100计算。该方案已报道于文献wangc.etal,jmedchem,2015,58,3083-3093。

(2)细胞毒性评估：37、℃5％co2条件下用1640细胞培养基(gibco公司)培养人角质细胞株hacat。胰酶消化贴壁细胞，按4×10⁴cfu/ml密度将细胞接种于无菌96孔板中，每孔100μl。细胞再次贴壁后，弃上清，更换100μl新鲜培养基，加入终浓度为50和100μg/ml的多肽溶液，混匀，继续培养24h。弃上清，每孔加入100μl无血清培养基和10μlcck-8试剂(dojindo)。37、℃5％co2条件下培养1h。酶标仪检测悬液od450吸光度值。多肽孵育后细胞吸光度计为apep，对照无处理组吸光度计为atot。细胞存活率按apep/atot×100计算。

如图5a和5b所示，ll37有明显的溶血和细胞毒性，而本发明实施例q5kd9i-kr12多肽的生物安全性显著提高。具体而言，100μg/mlll37多肽的溶血率可达17％，细胞存活率仅为40％；等浓度的q5kd9i-kr12多肽溶血和细胞毒性均不明显。因此，本发明实施例q5kd9i-kr12多肽具有更好的药物开发应用价值。

实施例7本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽放射创面感染动物实验

(1)8周龄balb/c雌性小鼠(18-22g)在x射线辐照仪(radsource，rs2000)中接受5gy一次性辐照，spf动物房中饲养。小鼠随机分成5组，每组20只。

(2)辐照后第4天，在小鼠后背下缘切直径为1cm的圆形全层皮肤损伤创面，腹腔注射200μl生理盐水，室温2h后在创面上涂抹15μl多重耐药鲍曼不动杆菌(4×10⁸cfu/ml)。

(3)细菌涂布感染3h后，涂抹20μl抗菌药物，浓度为100μg/ml，创面干燥后小鼠分笼饲养。连续观察14天，记录小鼠死亡率。

如图6所示，建立放射创面感染模型，受创小鼠在无任何干预措施的条件下，两周存活率为70％；感染耐药鲍曼不动杆菌后，11天死亡率高达100％，传统抗生素环丙沙星无明显疗效。等浓度的ll37多肽和本发明实施例的q5kd9i-kr12多肽涂抹感染创面，小鼠存活率显著增加(约40％)，且与体外抗菌结果一致，两者疗效相近。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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<110>中国人民解放军陆军军医大学

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