本发明属于有机化学合成与医药化工领域，具体涉及一种结构新颖的单分散聚乙二醇单甲醚修饰的白介素il-12前药的制备与应用。
背景技术：
在广泛的细胞因子中，白介素il-12家族具有独特的结构、功能和免疫学特征，在免疫学研究中具有重要作用。白介素il-12家族成员由il-12、il-23、il-27和il-35组成。il-12细胞因子主要以异二聚体形式存在，在微生物感染、自身免疫性疾病和癌症中发挥作用，本文对il-12家族成员的一般特征、细胞因子与病原微生物之间的相互作用、相关受体及其选择不同信号通路的研究进展作了简短概述。尽管il-12家族因子及其受体和下游信号成分具有许多结构相似性，但是它们的生物活性却不尽相同。il-12家族成员之间有一些相似和不相似之处，使之成为先天免疫系统和适应性免疫系统之间独一无二的桥梁。白介素il-12和il-23在p40亚基中相似，是促炎细胞因子和前列腺细胞因子，分别在辅助t细胞的th1和th17亚型的发育中起关键作用。il-27最初被认为是促炎细胞因子，但现在的共识是il-27是免疫调节细胞因子。il-35是该家族最近确定的成员，由胸腺来源的天然调节性t细胞(ntreg细胞)群体产生，属于有效的抑制性细胞因子。这就使得il-12家族因子分成了两类：il-12和il-23是阳性调节因子，il-27和il-35是负调节因子。il-12家族的生物活性表明它们在不同医学领域的应用具有辉煌的前景。il-12家族的成员是几种治疗方法的候选者，包括基因治疗、癌症治疗、肿瘤治疗和疫苗接种。像il-12这类蛋白质(含多肽)类药物主要包括酶、细胞因子等一些具有特殊功能的蛋白质。其疗效不仅取决于蛋白特定的化学结构，而且还取决于其特定的空间结构，因此可以通过基因工程或化学修饰等手段，部分或全部解决此类药半衰期段的问题。聚乙二醇(peg)是最常用的一种修饰剂，其毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性，且生物相容性已获fda认可。当蛋白类经peg修饰后，修饰剂的许多优良性质也会随之移植到修饰蛋白中去。peg修饰的蛋白类(亦称蛋白的peg化)包括peg与蛋白质与多肽类药物的物理结合物和化学修饰物，可大大改善蛋白类药物的一些性质。此类药物peg化后的改变包括：增加溶解度；免疫原性降低或消除；被水解酶降解的可能性减小；被肾脏清除的速率降低；药物体内分布和动力学参数的改变；稳定性的提高；增加蛋白药物的治疗指数，扩大临床应用等。
现有技术中，较大研究是集中在peg修饰白介素10，即peg-il-10,而对peg修饰白介素12的研究较少。
发明专利申请号为(cn201310480573.4)通过peg分子与细胞因子蛋白上的单个残基共价连接，但是常规peg链有至少2个以上反应位点，产生较多无法选择区分的单聚、双聚甚至多聚混合物，对药物的一致性评价带来很多麻烦，且主产物产率较低。
申请号为(cn02153446.2)的中国专利公开了一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案，其中涉及白介素与peg的混合制备疫苗，单纯的物理混合无法避免il-12自身的毒副作用；
申请号(tw095130565)公开了双重可变区域免疫球蛋白及其用途，其中涉及甲氧基聚乙二醇与il-12的结合；
公开号为(cn1610694a)的中国专利公开了一种淋巴因子制剂和用其局部或局部和系统地控制细胞增生性疾病的方法，涉及peg与白介素物理混合；
申请号为(cn98110665.x)的中国专利公开了构建真核表达载体peg携带il-12基因即peg-il-12，通过peg载体运载il-12,且物理运载没有化学键结合牢固和稳定，除此之外il-12本身是一种含有多种氨基酸链的非单分散性的大分子。在机体内代谢半衰期较短，这个药物的治疗窗口很小，毒副作用很大。
申请号为(cn201710721289.x)的中国专利教导了一种单分散聚乙二醇单甲醚的制备；
申请号(cn201711422744.2)的中国专利教导了一种单分散聚乙二醇单甲醚修饰丙泊芬前药的制备及应用；
现有技术中没有教导聚乙二醇对il-12的修饰的制备和应用。
技术实现要素：
鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种新型的水溶性的白介素il-12前药，降低其在临床应用中的副作用。将il-12与单分散的peg(聚乙二醇)单甲醚通过化学键结合相连，增加il-12的大小以延长其在患者体内的循环时间。通过对il-12进行peg衍生化修饰，尤其使用较高分子量的peg，能够改变il-12的代谢途径，从而最大化增强il-12活化细胞的能力并达到降低毒副作用的目的。
本发明的技术方案可以通过以下技术措施来实现：
—种单分散聚乙二醇单甲醚修饰的白介素il-12前药，其结构如结构通式i所示：
其中cys指的是白介素il-2中的半胱氨酸片段，s为半胱氨酸上的巯元素。
所述通式i中，白介素il-12前药的合成方法包括以下步骤：
(1)使单分散聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯在磷酸缓冲溶液中与赖氨酸反应得到单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。
(2)所得到的单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物与n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应得到单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。
(3)单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯溶于溶液中，加入马来酰亚胺基乙胺和碱，40℃下反应，柱层析纯化得到化合物单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。
(4)往单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯中加入白介素il-12、碱、溶剂，在50℃条件下反应得到式i所示的单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药。
优选地，所述的碱为dbu、n-甲基吗啉、二异丙胺、n，n-二异丙基乙胺、碳酸氢钠、碳酸钾。
优选地，所述的溶剂包括甲苯、乙腈、二氯乙烷、乙酸乙酯、丙酮、二氧六环。
所述通式i中，n为23时的白介素il-12前药的合成方法包括以下步骤：
(1)使单分散二十四乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯在溶剂中与赖氨酸反应得到单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物；
(2)所得到的单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物与n,n'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应得到单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯，
(3)单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯溶于溶液中，加入马来酰亚胺基乙胺和碱，40℃下反应，柱层析纯化得到化合物单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。
(4)往单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺中加入白介素il-12、碱、溶剂，在50℃条件下反应得到式i所示的单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药。
优选地，所述的碱为dbu、n-甲基吗啉、二异丙胺、n，n-二异丙基乙胺、碳酸氢钠、碳酸钾。
优选地，所述的溶剂包括甲苯、乙腈、二氯乙烷、乙酸乙酯、丙酮、二氧六环。
上述白介素il-12前药在作为经静脉或静脉外途径对动物或人产生抗肿瘤作用的药物中的应用。
发明的技术有益效果：
1.将il-112与peg(聚乙二醇)通过化学键结合相连，增加il-12的大小以延长其在患者体内的循环时间，从而最大化增强il-12活化细胞的能力并达到降低毒副作用的目的。
2.单分散聚乙二醇单甲醚可以准确控制反应位点，避免产生多种副产物，提高产率。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1
单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的合成
(1)单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸
十二聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(4mmol)溶于乙酸乙酯(50ml)溶液中，加入赖氨酸(1mmol)和dbu(2mmol)，40℃下反应48h，反应结束后，蒸除乙酸乙酯溶液，柱层析纯化得到化合物单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。1hnmr(400mhz,chloroform)δ4.55(s,1h),4.20(s,4h),3.63(s,4h),3.53(d,j＝15.0hz,96h),3.40(s,6h),3.18(s,2h),1.81(d,j＝12.2hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
(2)单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯
单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物(1mmol)溶于乙腈(50ml)溶液中，加入dsc(2mmol)，60℃下反应48h，反应结束后，蒸除乙腈溶液，柱层析纯化得到单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。1hnmr(400mhz,chloroform)1hnmr(400mhz,chloroform)δ5.58(s,1h),4.50(s,1h),4.19(s,4h),3.62(s,4h),3.53(d,j＝15.0hz,96h),3.39(s,6h),3.17(s,2h),2.83(s,4h),1.81(d,j＝4.2hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
(3)单分散十二聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺的合成
单分散十二聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯(1mmo1)溶于乙酸乙酯(50ml)溶液中，加入马来酰亚胺基乙胺(2mmol)和dbu(1mmol)，40℃下反应12h，反应结束后，蒸除乙酸乙酯溶液，柱层析纯化得到化合物单分散十二聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。1hnmr(400mhz,chloroform)δ:6.72(s,2h),4.81(s,1h),4.55(s,1h),4.23(d,j＝28.8hz,4h),3.61(d,j＝15.0hz,96h),3.57-3.45(m,10h),3.40(s,6h),3.18(s,2h),2.62(s,4h),1.86(d,j＝40.3hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
⑷单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的合成
单分散十二聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺(2mmol)溶于丙酮(50ml)溶液中，加入白介素il-12(1mmol)和dbu(0.5mmol)，60℃下反应24h，反应结束后，蒸除丙酮溶液，透析纯化得到单分散聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药。maldi-tof-ms:177684da.
实施例2
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的合成(1)单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸
二十四聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(4mmol)溶于乙酸乙酯(50ml)溶液中，加入赖氨(1mmol)和n-甲基吗啉(2mmol)，40℃下反应48h，反应结束后，蒸除乙酸乙酯溶液，柱层析纯化得到化合物单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。1hnmr(400mhz,chloroform)δ4.55(s,1h),4.20(s,4h),3.63(s,4h),3.53(d,j＝15.0hz,192h),3.40(s,6h),3.18(s,2h),1.81(d,j＝12.2hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
(2)单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物(1mmol)溶于乙腈(50ml)溶液中，加入dsc(2mmol)，60℃下反应48h，反应结束后，蒸除乙腈溶液，柱层析纯化得到单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。1hnmr(400mhz,chloroform)1hnmr(400mhz,chloroform)δ5.58(s,1h),4.50(s,1h),4.19(s,4h),3.62(s,4h),3.53(d,j＝15.0hz,192h),3.39(s,6h),3.17(s,2h),2.83(s,4h),1.81(d,j＝4.2hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
(3)单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺的合成
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯(1mmo1)溶于乙酸乙酯(50ml)溶液中，加入马来酰亚胺基乙胺(2mmol)和n-甲基吗啉(1mmol)，40℃下反应12h，反应结束后，蒸除乙酸乙酯溶液，柱层析纯化得到化合物单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。1hnmr(400mhz,chloroform)δ:6.72(s,2h),4.81(s,1h),4.55(s,1h),4.23(d,j＝28.8hz,4h),3.61(d,j＝15.0hz,192h),3.57-3.45(m,10h),3.40(s,6h),3.18(s,2h),2.62(s,4h),1.86(d,j＝40.3hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
⑷单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的合成
单分散二十四聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺(2mmol)溶于二氯乙烷(50ml)溶液中，加入白介素il-12(1mmol)和n-甲基吗啉(0.5mmol)，60℃下反应24h，反应结束后，蒸除二氯乙烷溶液，透析纯化得到单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药。maldi-tof-ms:182454da.
实施例3
单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的合成
(1)单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸
四十八聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(4mmol)溶于二氧六环(50ml)溶液中，加入赖氨酸(1mmol)和二异丙胺(2mmol)，40℃下反应48h，反应结束后，蒸除二氧六环溶液，柱层析纯化得到化合物单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物。1hnmr(400mhz,chloroform)δ4.55(s,1h),4.20(s,4h),3.63(s,4h),3.53(d,j＝15.0hz,384h),3.40(s,6h),3.18(s,2h),1.81(d,j＝12.2hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
(2)单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯
单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸衍生物(1mmol)溶于乙腈(50ml)溶液中，加入dsc(2mmol)，60℃下反应48h，反应结束后，蒸除乙腈溶液，柱层析纯化得到单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯。1hnmr(400mhz,chloroform)1hnmr(400mhz,chloroform)δ5.58(s,1h),4.50(s,1h),4.19(s,4h),3.62(s,4h),3.53(d,j＝15.0hz,384h),3.39(s,6h),3.17(s,2h),2.83(s,4h),1.81(d,j＝4.2hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
(3)单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺的合成
单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸活性酯(1mmo1)溶于二氧六环(50ml)溶液中，加入马来酰亚胺基乙胺(2mmol)和二异丙胺(1mmol)，40℃下反应12h，反应结束后，蒸除二氧六环溶液，柱层析纯化得到化合物单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺。1hnmr(400mhz,chloroform)δ:6.72(s,2h),4.81(s,1h),4.55(s,1h),4.23(d,j＝28.8hz,4h),3.61(d,j＝15.0hz,384h),3.57-3.45(m,10h),3.40(s,6h),3.18(s,2h),2.62(s,4h),1.86(d,j＝40.3hz,2h),1.50(s,2h),1.25(s,4h).
⑷单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的合成
单分散四十八聚乙二醇单甲醚马来酰亚胺(2mmol)溶于甲苯(50ml)溶液中，加入白介素il-12(1mmol)和二异丙胺(0.5mmol)，60℃下反应24h，反应结束后，蒸除甲苯溶液，透析纯化得到单分散四十八聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药。maldi-tof-ms:192454da.
实施例4细胞毒性研究
使用b16小鼠黑素瘤细胞进行体外单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的细胞毒性研究
将黑素瘤细胞按2.5x104细胞/ml的浓度种在24孔平板中，并于35℃在含5.5％c02的95％湿度下在50:55delbecco改进的极限最小培养基(dem)和含10％小牛血清的f12培养基中生长24小时。然后用含5x10-9m-75x10-9m浓度的白介素il-12或单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药的培养基代替化培养基.40小时后，经胰蛋白酶消化使细胞，并用coulter计数器进行计数.细胞培养基中的dmso(二甲基亚矾，用于溶解白介素il-12)和0.05mnahc03溶液(用于溶解单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药)的最终浓度小于0.01。对照研究表明这一数量的溶剂对细胞生长不产生任何作用.而且，用于产生5x10-9m至75x10-9m当量白介素il-12浓度的pg浓度范围对细胞增殖不产生作用.
单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药对小鼠的mca-4肿瘤的抗肿瘤作用
为了确定单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药对固体乳腺肿瘤的抗肿瘤能力，将mca-4细胞((5x10-4细胞)注射在雌性c3hf/kam小鼠的右腿肌肉中。当肿瘤长至8mm(约2周)时，给予相当10,20和40mg白介素il-12/kg体重的单剂量白介素il-12或单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药.首先将白介素il-12溶解在与乳浮等体积的无水乙醇中.在15分钟注射时间内，进一步用灭菌生理盆水稀释((1:4体积)这种储备溶液.将单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药溶解在盐水(6mg当量白介素il-12/ml)中，通过无菌过滤器过滤。对照实验中使用盆水、白介素il-12载体、用盐水稀释((1:4)的无水乙醇/乳浮((1:1)和盐水中的peg溶液(600mg吨体重).每天测量肿瘤生长，即测定三个正交肿瘤直径.当肿瘤直径达12mm时，计算肿瘤生长延迟.
剂量为40mg/kg时，单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药和白介素il-12都能有效延迟肿瘤生长.虽然两者没有统计学上差异，但单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药较白介素il-12更有效。单分散二十四聚乙二醇单甲醚赖氨酸白介素il-12前药治疗肿瘤需要12.4天使肿瘤直径达到12mm，而白介素il-12前药需要6.5天。