本发明属于制药领域，具体涉及一种高生物利用度的硫酸软骨素制备方法。
背景技术：
硫酸软骨素(chondroitinsulfate)大量存在于动物软骨中，商品是从动物组织中提取制备的酸性粘多糖。硫酸软骨素是糖胺聚糖的一种，主要含有硫酸软骨素a、硫酸软骨素c等黏性多糖成分，是由d-葡糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，并在n-乙酰氨基半乳糖的c-4位或c-6位羟基上发生硫酸酯化。主要分为硫酸软骨素钠盐和硫酸软骨素钙盐等，常与葡萄糖胺配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，用于治疗神经痛，偏头痛，关节痛，心脑血管疾病，同时也可以作为关节炎、滴眼液以及高血脂的辅助治疗用品。不仅如此，硫酸软骨素还可以作为食品、保健品的添加剂。在医药、化妆品、食品工业上具有广泛的用途，市场前景广阔。
现有技术提取获得的硫酸软骨素分子量一般在20000～50000道尔顿之间，此分子量的软骨素产品存在口服吸收差、生物利用度低、疗效不稳定等缺点。而中低分子量的硫酸软骨素产品的体内吸收均明显优于普通分子量的产品，分子量越小则吸收率越高。美国专利usp3405120已证明，分子量在2000-6000道尔顿时，硫酸软骨素的药理活性最强，对防治动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合等具有更好的疗效。
技术实现要素：
本发明针对现有技术提纯获取的硫酸软骨素分子量较大的缺陷，提供一种低分子量硫酸软骨素的制备方法，所得到的硫酸软骨素收率大、纯度高、平均分子量可控制在2000至6000道尔顿之间，适合工业化大生产。
本发明的上述一个目的可通过下列技术方案来实现：
一种高生物利用度的硫酸软骨素制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)预处理：将软骨与水混合后，加热至60-90℃煮泡2-5小时，沥去水；
(2)碱化：向步骤(1)得到的软骨加入naoh水溶液，于20-40℃碱化2-5小时；
(3)酶解ⅰ：先将碱化后的溶液调ph至8.0-9.0，再加入胰酶，于20-40℃下酶解7-10小时；酶解完成后升温至70-90℃静置1-3小时，再调ph至3-5，冷却，离心，得酶解过滤液；
(4)絮凝沉降：向酶解过滤液中加入絮凝剂，搅拌5-20min后静置2-5h使其分层，然后离心收集上清液；
(5)酶解ⅱ：向絮凝沉降后的上清液中加入改性二氧化硅，搅拌20-50min后，调ph为5-6，控制温度为30-50℃，然后加入透明质酸酶，振荡反应10-20h；反应结束后，加热至90-100℃静置20-50min，离心，取上层液体；
(6)膜浓缩：通过不同分子量的膜过滤截留相应分子量的产品；
(7)喷雾干燥：将膜过滤液经过陶瓷复合膜进行灭菌，然后在进风温度为190-195℃，出口温度为90-95℃下进行喷雾干燥，得到硫酸软骨素。
硫酸软骨素在软骨组织中多以蛋白多糖形式存在，每条蛋白多糖链之间由氢键、盐键连接成一个聚集体。因此，在制备硫酸软骨素时，首先要破坏聚集体中氢键、盐键，把蛋白多糖解离提取出来，本发明采用碱化处理，破坏聚集体相互作用，提取获得蛋白多糖液。然后加入胰酶，在合适的ph、温度和反应时间下，将蛋白水解成多肽、低肽、氨基酸等小分子化合物，释放出硫酸软骨素。此时的硫酸软骨素溶液比较粘稠，传统通过醇沉的做法是将酒精加入到硫酸软骨素溶液中使硫酸软骨素结晶析出沉淀下来，这样产生的硫酸软骨素沉淀结晶体容易结块而且粘稠，结晶体中包含的有机溶剂在脱水干燥过程中由于颗粒形状较大且坚硬致密，不容易挥发，致使产品的溶剂残留偏高，影响产品质量。因此，本发明舍弃传统的醇沉淀，而是换成絮凝沉淀，硫酸软骨素溶液中的蛋白质、色素、低聚体等杂质，通过絮凝剂的分子吸附和电中和作用，形成絮团并使之沉降，从而对硫酸软骨素进行分离和纯化。
低分子量硫酸软骨素的制备包括酶解和化学降解方法，化学降解法反应条件较难控制，降解后的分子量分布较宽，且产物颜色变深；酶解法与化学降解相比，条件温和，反应过程易于控制。但是专用于降解硫酸软骨素的酶，如硫酸软骨素裂解酶eac、硫酸软骨素裂解酶abc，专一性较强，但是来源有限，获取成本较高；而非专一性酶，如透明质酸酶，容易获取，但是水解程度有限，与专一性酶相比，相同程度的水解需要更多的透明质酸酶。而本发明在透明质酸酶酶解过程中，加入改性二氧化硅，通过改性二氧化硅的吸附和解聚作用，增大透明质酸酶的酶解程度，获得分子量较均一的降解产物。
因为本发明目的在于获得分子量为3000-6000道尔顿的硫酸软骨素，因此在后续膜浓缩过程中，选择截留分子量为3000道尔顿的超滤膜和截留分子量为6000道尔顿的超滤膜，分别进行超滤，得到滤液中的硫酸软骨素基本上为3000-6000道尔顿的硫酸软骨素。
作为优选，所述步骤(2)中的naoh水溶液质量浓度为3-6％。naoh水溶液的加入量为软骨质量的2-4倍。
作为优选，所述胰酶加入量为软骨质量的1.5-2.5wt％。对于胰酶的添加量，如果添加过少则酶解不充分，如果添加过多，则增加生产成本，同时对后期的处理产生影响，增加酶灭活投入成本，本发明在多次试验的基础上，优选的胰酶添加量为软骨质量的1.5-2.5wt％。
作为优选，所述絮凝剂加入量为酶解过滤液的0.3-0.8％(m/v)。
作为优选，所述絮凝剂为壳聚糖、聚合硫酸铁以质量比为4-7:1形成的混合物。壳聚糖为一种有机絮凝剂，聚合硫酸铁为无机絮凝剂，将壳聚糖与聚合硫酸铁混合形成的絮凝剂，综合两种絮凝剂的优点，协同增效，从而有效分离硫酸软骨素，达到纯化目的。
作为优选，所述改性二氧化硅加入量为上清液的5-12％(m/v)。
作为优选，所述改性二氧化硅制备方法包括以下步骤：将二氧化硅加入到8-12％(m/v)的哌嗪基偶联剂的乙醇溶液中，搅拌10-50min，随后置于烘箱内干燥，将干燥后的颗粒置于10-15％(m/v)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(dmc)的乙醇溶液中，再加入过硫酸铵，过硫酸铵质量为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的25-50％，20-40℃下反应3-5小时，离心后清水洗涤沉淀，得改性二氧化硅。
本发明先将二氧化硅经哌嗪基偶联剂表面偶联处理，增加二氧化硅与于聚合物的亲和性，并获得表面含有叔胺基团的二氧化硅，叔胺基团易离子化，在过硫酸铵的作用下会产生自由基，从而引发dmc接枝，dmc具有极强的极性和对阴离子性物质的亲和力，因此改性后的二氧化硅易与硫酸软骨素阴离子结合。
使用透明质酸酶作用于硫酸软骨素，专一性不强，水解程度不够，且硫酸软骨素在水溶液中存在分子内和分子间氢键结合力，硫酸软骨素部分分子链会产生聚集体，影响酶解作用。本发明所采用的的改性二氧化硅能够与硫酸软骨素中的阴离子结合，这种结合力大于硫酸软骨素分子内或分子间氢键作用，硫酸软骨素分子聚集体解聚吸附在二氧化硅表面支链基团上，增加透明质酸酶作用点，从而增大透明质酸酶酶解作用。
所述哌嗪基偶联剂加入量为二氧化硅的1-4％。
所述哌嗪基偶联剂为哌嗪基偶联剂kh-604。
作为优选，所述二氧化硅为纳米二氧化硅，粒径为10-100nm。粒径越小，相同数量的二氧化硅具有更大的表面面积，增加结合的硫酸软骨素量。
作为优选，所述透明质酸酶加入量为上清液的0.2-0.8％(m/v)。
本发明与现有技术相比，有益效果体现在：本发明通过使用复合絮凝剂沉淀分离硫酸软骨素，代替现有技术使用的乙醇沉淀，避免醇沉所带来的溶剂残留高、颗粒易结块等缺陷，并提高分离纯化效果；本发明使用改性二氧化硅结合硫酸软骨素的阴离子基团，增加透明质酸酶作用点，从而增大透明质酸酶酶解作用；所得到的低分子量硫酸软骨素产品收率纯度高、平均分子量可控制在2000至6000道尔顿之间、方法成本低、步骤简单、引入杂质少、适合工业化大生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
以下实施例和对比例中，硫酸软骨素收率＝获得的硫酸软骨素(g)/软骨质量(g)*100％；硫酸软骨素的平均分子量和纯度经高效凝胶渗透色谱法测定。
实施例1
本实施例的硫酸软骨素通过以下制备方法获得：
(1)预处理：将软骨与两倍量的水混合后，加热至80℃煮泡3小时，沥去水；
(2)碱化：向步骤(1)得到的软骨加入2倍量的5％naoh水溶液，于30℃碱化3小时；
(3)酶解ⅰ：先将碱化后的溶液用稀盐酸调ph至8.5，再加入软骨质量2％的胰酶，于30℃下酶解8小时；酶解完成后升温至80℃静置2小时，再调ph至4，冷却，通过碟式离心机进行离心，得酶解过滤液；
(4)絮凝沉降：向酶解过滤液中加入絮凝剂，其中絮凝剂加入量为酶解过滤液的0.5％(m/v)，絮凝剂为壳聚糖、聚合硫酸铁以质量比为5:1形成的混合物，搅拌10min后静置3h使其分层，然后2000r/min离心3min，收集上清液；
(5)酶解ⅱ：向絮凝沉降后的上清液中加入改性二氧化硅，改性二氧化硅加入量为上清液的10％(m/v)，搅拌30min后，调ph为6，控制温度为37℃，然后加入透明质酸酶，透明质酸酶加入量为上清液的0.5％(m/v)，振荡反应15h；反应结束后，加热至95℃静置20min使酶失活，3000r/min离心10min，取上层液体；
(6)膜过滤：先选择截留分子量为3000道尔顿的超滤膜得到浓缩液，浓缩液再过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜，得到滤液；
(7)喷雾干燥：将滤液经过陶瓷复合膜进行灭菌，然后在进风温度为190℃，出口温度为90℃下进行喷雾干燥，得到硫酸软骨素。
其中，步骤(5)所使用的改性二氧化硅的通过以下方法制备而得：
将粒径为50nm的二氧化硅加入到10％(m/v)的哌嗪基偶联剂kh-604的乙醇溶液中，kh-604加入量为二氧化硅的4％，搅拌20min，随后置于烘箱内干燥，将干燥后的颗粒置于12％(m/v)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的乙醇溶液中，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵添加量为干燥颗粒的10％，再加入过硫酸铵，过硫酸铵质量为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的30％，30℃下反应4小时，离心后清水洗涤沉淀，得改性二氧化硅。
实施例1获得的硫酸软骨素平均分子量为4000，得率为42.5％，纯度为98.4％。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于，实施例2的絮凝剂加入量为酶解过滤液的1.0％(m/v)，其它与实施例1相同。
实施例2获得的硫酸软骨素平均分子量为4600，得率为40.8％，纯度为96.5。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于，实施例3的改性二氧化硅加入量为上清液的15％(m/v)，其它与实施例1相同。
实施例3获得的硫酸软骨素平均分子量为4700，得率为41.2％，纯度为97.5％。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于，实施例3的透明质酸酶加入量为上清液的1.0％(m/v)，其它与实施例1相同。
实施例4获得的硫酸软骨素平均分子量为4200，得率为41.0％，纯度为97.7％。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于，实施例5的二氧化硅粒径为150nm，其它与实施例1相同。
实施例5获得的硫酸软骨素平均分子量为5200，得率为39.8％，纯度为97.3％
实施例6
本实施例的硫酸软骨素通过以下制备方法获得：
(1)预处理：将软骨与两倍量的水混合后，加热至70℃煮泡5小时，沥去水；
(2)碱化：向步骤(1)得到的软骨加入2倍量的4％naoh水溶液，于25℃碱化4小时；
(3)酶解ⅰ：先将碱化后的溶液用稀盐酸调ph至8.0，再加入软骨质量21.5％的胰酶，于25℃下酶解9小时；酶解完成后升温至70℃静置3小时，再调ph至3，冷却，通过碟式离心机进行离心，得酶解过滤液；
(4)絮凝沉降：向酶解过滤液中加入絮凝剂，其中絮凝剂加入量为酶解过滤液的0.4％(m/v)，絮凝剂为壳聚糖、聚合硫酸铁以质量比为4:1形成的混合物，搅拌8min后静置4h使其分层，然后2000r/min离心3min，收集上清液；
(5)酶解ⅱ：向絮凝沉降后的上清液中加入改性二氧化硅，改性二氧化硅加入量为上清液的8％(m/v)，搅拌25min后，调ph为5.5，控制温度为30℃，然后加入透明质酸酶，透明质酸酶加入量为上清液的0.3％(m/v)，振荡反应12h；反应结束后，加热至90℃静置30min使酶失活，3000r/min离心10min，取上层液体；
(6)膜过滤：先选择截留分子量为3000道尔顿的超滤膜得到浓缩液，浓缩液再过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜，得到滤液；
(7)喷雾干燥：将滤液经过陶瓷复合膜进行灭菌，然后在进风温度为190℃，出口温度为90℃下进行喷雾干燥，得到硫酸软骨素。
其中，步骤(5)所使用的改性二氧化硅的通过以下方法制备而得：
将粒径为30nm的二氧化硅加入到8％(m/v)的哌嗪基偶联剂kh-604的乙醇溶液中，kh-604加入量为二氧化硅的3％，搅拌20min，随后置于烘箱内干燥，将干燥后的颗粒置于10％(m/v)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的乙醇溶液中，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵添加量为干燥颗粒的8％，再加入过硫酸铵，过硫酸铵质量为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的35％，30℃下反应3小时，离心后清水洗涤沉淀，得改性二氧化硅。
实施例6获得的硫酸软骨素平均分子量为4200，得率为42.0％，纯度为98.1％
实施例7
本实施例的硫酸软骨素通过以下制备方法获得：
(1)预处理：将软骨与两倍量的水混合后，加热至90℃煮泡2小时，沥去水；
(2)碱化：向步骤(1)得到的软骨加入2倍量的5％naoh水溶液，于40℃碱化2小时；
(3)酶解ⅰ：先将碱化后的溶液用稀盐酸调ph至9.0，再加入软骨质量2.5％的胰酶，于40℃下酶解7小时；酶解完成后升温至90℃静置1小时，再调ph至5，冷却，通过碟式离心机进行离心，得酶解过滤液；
(4)絮凝沉降：向酶解过滤液中加入絮凝剂，其中絮凝剂加入量为酶解过滤液的0.8％(m/v)，絮凝剂为壳聚糖、聚合硫酸铁以质量比为7:1形成的混合物，搅拌20min后静置2h使其分层，然后2000r/min离心3min，收集上清液；
(5)酶解ⅱ：向絮凝沉降后的上清液中加入改性二氧化硅，改性二氧化硅加入量为上清液的12％(m/v)，搅拌40min后，调ph为6，控制温度为40℃，然后加入透明质酸酶，透明质酸酶加入量为上清液的0.8％(m/v)，振荡反应18h；反应结束后，加热至100℃静置30min使酶失活，3000r/min离心10min，取上层液体；
(6)膜过滤：先选择截留分子量为3000道尔顿的超滤膜得到浓缩液，浓缩液再过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜，得到滤液；
(7)喷雾干燥：将滤液经过陶瓷复合膜进行灭菌，然后在进风温度为190℃，出口温度为90℃下进行喷雾干燥，得到硫酸软骨素。
其中，步骤(5)所使用的改性二氧化硅的通过以下方法制备而得：
将粒径为80nm的二氧化硅加入到8％(m/v)的哌嗪基偶联剂kh-604的乙醇溶液中，kh-604加入量为二氧化硅的4％，搅拌25min，随后置于烘箱内干燥，将干燥后的颗粒置于15％(m/v)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的乙醇溶液中，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵添加量为干燥颗粒的10％，再加入过硫酸铵，过硫酸铵质量为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的40％，40℃下反应3小时，离心后清水洗涤沉淀，得改性二氧化硅。
实施例7获得的硫酸软骨素平均分子量为4100，得率为41.8％，纯度为98.0％。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1采用常规醇沉淀代替实施例1的絮凝沉淀：向酶解过滤液中加入无水乙醇，最终使乙醇浓度为75％，放置析晶2小时，抽走上清液，收集固体，固体加水溶解后，进行后续膜过滤步骤。其它与实施例1相同。
对比例1获得的硫酸软骨素平均分子量为4700，得率为34.8％，纯度为96.0％
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的絮凝剂为壳聚糖。其它与实施例1相同。
对比例2获得的硫酸软骨素平均分子量为4600，得率为35.2％，纯度为96.6％。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，对比例3的絮凝剂为聚合硫酸铁。其它与实施例1相同。
对比例3获得的硫酸软骨素平均分子量为4600，得率为35.0％，纯度为96.8％。
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于，对比例4的絮凝剂为壳聚糖、聚合硫酸铁以质量比为3:1形成的混合物。其它与实施例1相同。
对比例4获得的硫酸软骨素平均分子量为4500，得率为36.8％，纯度为97.3％。
对比例5
对比例5与实施例1的区别在于，对比例5的絮凝剂为壳聚糖、聚合硫酸铁以质量比为8:1形成的混合物。其它与实施例1相同。
对比例5获得的硫酸软骨素平均分子量为4600，得率为38.0％，纯度为97.5％。
对比例6
对比例6与实施例1的区别在于，对比例6酶解ⅱ过程中没有加入改性二氧化硅。其它与实施例1相同。
对比例6获得的硫酸软骨素平均分子量为5600，得率为34.1％，纯度为96.3％。
对比例7
对比例7与实施例1的区别在于，对比例7酶解ⅱ过程中加入的二氧化硅没有进行改性处理。其它与实施例1相同。
对比例7获得的硫酸软骨素平均分子量为5500，得率为34.5％，纯度为96.5％。
对比例8
对比例8与实施例1的区别在于，对比例8酶解ⅱ过程中加入的改性二氧化硅仅为哌嗪基偶联剂kh-604处理获得，没有后续甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝反应。其它与实施例1相同。
对比例8获得的硫酸软骨素平均分子量为5500，得率为35.0％，纯度为96.7％。
对比例9
对比例9与实施例1的区别在于，对比例9酶解ⅱ过程中加入的改性二氧化硅所使用的偶联剂为钛酸酯偶联剂。其它与实施例1相同。
对比例9获得的硫酸软骨素平均分子量为5300，得率为36.2％，纯度为97.2％。
尽管上述对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。