本发明涉及一种促进蛋白酶高效分泌的方法，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。
背景技术：
碱性蛋白酶(alkalineprotease)属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用ph一般为9～11，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。
该酶种最早在猪的胰脏中发现。1913年，rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用；1945年，瑞士的dr.jaag等发现了微生物碱性蛋白酶，使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业；1963年，诺和诺德公司(现诺维信公司)发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶alcalase，酶制剂被广泛地应用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉；随后的20年中，细菌类蛋白酶是唯一被应用于洗涤剂的商品化酶制剂。
目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶中用得最多的一种酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占25％。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。
因此，挖掘可使得碱性蛋白酶活性提高的方法对于进一步推动碱性蛋白酶的大规模工业化应用、降低产业成本具有重大的意义。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种促进蛋白酶高效分泌的方法。此方法通过将氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的第69位天冬氨酸突变为精氨酸或在将氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的第69位天冬氨酸突变为精氨酸的基础上，进一步将第276位赖氨酸突变为谷氨酸，大大提高了碱性蛋白酶的活性，对于进一步推动碱性蛋白酶的大规模工业化应用、降低产业成本具有重大的意义。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种碱性蛋白酶突变体，所述突变体是通过将氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的第69位丙氨酸进行突变得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的第69位丙氨酸以及376位苏氨酸同时进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的第69位丙氨酸突变为精氨酸得到的；
或所述突变体是通过在将氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的第69位丙氨酸突变为精氨酸的基础上，进一步将第376位苏氨酸突变为异亮氨酸得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如seqidno.2或seqidno.3所示。
本发明提供了编码上述突变体的基因。
本发明提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为puc系列、pet系列、或pgex中的任意一种。
本发明提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
本发明提供了上述突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在降解蛋白质、制备饲料添加剂、制备有机化肥以及制备洗涤剂方面的应用。
本发明提供了一种促进蛋白酶高效分泌的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到碱性蛋白酶。
有益效果：
本发明通过对氨基酸序列如seqidno.1所示的碱性蛋白酶进行改造，大大提高了其活性(较野生型提高了9.6倍)，对于进一步推动碱性蛋白酶的大规模工业化应用、降低产业成本具有重大的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
酶活检测方法：
参考中华人民共和国专业标准sb/t10317-1999蛋白酶活力测定方法2007。
碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/l)，三氯乙酸(65.4g/l)，梯度ph值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/l)；
反应过程如下：试管中加入1ml酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1ml，摇匀后40℃温浴10min，加入2ml三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液))，取出静止10min，慢速定性滤纸过滤，取1ml滤液，加碳酸钠溶液5ml，加福林试剂使用溶液1ml，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。
酶活单位的定义：在一定温度和ph值条件下，1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所用的酶量，即为1个酶活力单位(1u)。
实施例1：突变体的构建
(1)根据氨基酸序列分别如seqidno.1所示的碱性蛋白酶，化学合成其基因并克隆至质粒pet24a(+)的ndeⅰ和hindⅲ酶切位点之间，得到重组质粒apr/pet24a(+)，将质粒apr/pet24a(+)转化e.colibl21(de3)宿主菌，涂布含卡那霉素(30mg/l)的lb平板，37℃培养8h，命名为apr/pet24a(+)/e.colibl21(de3)，挑单菌落到含有30mg/l卡那霉素液体lb培养基中，37℃培养过夜，保存甘油管；
(2)根据氨基酸序列分别如seqidno.1所示的碱性蛋白酶的基因序列，设计并合成引入a69r突变的引物，利用快速pcr技术，以表达载体apr/pet24a(+)为模板进行单突变，得到单突变体；
引入a69r突变的定点突变引物为：
正向引物(seqidno.4)：5’-ggcccacgaattaggcaagagagcgt-3’(下划线为突变碱基)
反向引物(seqidno.5)：5’-acgctctcttgcctaattcgtgggcc-3’(下划线为突变碱基)
pcr反应体系均为：5×psbuffer10μl，dntpsmix(2.5mm)4μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna1μl，primerstarhs(5u/μl)0.5μl，加入双蒸水至50μl；
pcr扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min；
pcr产物经dpnⅰ消化，转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基(含30μg/ml卡那霉素)培养过夜后，挑克隆于lb液体培养基(含30μg/ml卡那霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒a69r/pet24a(+)转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，通过测序验证突变质粒携带编码突变体的基因；
(3)以单突变体a69r编码基因为模板，设计并合成引入t376i突变的引物，利用快速pcr技术，以表达载体a69r/pet24a(+)为模板进一步突变，得到双突变体；
引入t376i突变的定点突变引物为：
正向引物(seqidno.6)：5’-tccgtgacggccacgcttgcctcctgtg-3’(下划线为突变碱基)
反向引物(seqidno.7)：5’-cacaggaggcaagcgtggccgtcacgga-3’(下划线为突变碱基)
pcr反应体系、反应条件同步骤(2)；
pcr产物经dpnⅰ消化，转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基(含30μg/ml卡那霉素)培养过夜后，挑克隆于lb液体培养基(含30μg/ml卡那霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒a69r/t376i/pet24a(+)转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，通过测序验证突变质粒携带编码突变体的基因。
实施例2：突变体的验证
分别挑取携带野生酶的大肠杆菌apr/pet24a(+)/e.colibl21(de3)、携带单突变体、双突变体基因的a69r/pet24a(+)/e.colibl21(de3)、a69r/t376i/pet24a(+)/e.colibl21(de3)于lb液体培养基(含30μg/ml卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到tb培养基(含30μg/ml卡那霉素)中，在37℃摇床中培养48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液即为粗酶液。
检测粗酶液中的酶活，检测结果为：大肠杆菌apr/pet24a(+)/e.colibl21(de3)发酵得到的粗酶液中的碱性蛋白酶酶活为89.1u/ml；大肠杆菌a69r/pet24a(+)/e.colibl21(de3)发酵得到的粗酶液中的碱性蛋白酶酶活为294.2u/ml，是大肠杆菌apr/pet24a(+)/e.colibl21(de3)的3.3倍；大肠杆菌a69r/t376i/pet24a(+)/e.colibl21(de3)发酵得到的粗酶液中的碱性蛋白酶酶活为855.4u/ml，是大肠杆菌apr/pet24a(+)/e.colibl21(de3)的9.6倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>湖南汇升生物科技有限公司
<120>一种促进蛋白酶高效分泌的方法
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