一种蜜环菌老化菌种的快速活化方法与流程

本发明属于菌种培养技术领域，具体涉及一种蜜环菌老化菌种的快速活化方法。

背景技术：

天麻隶属兰科天麻属，已有2000多年的入药历史。早在东汉时期的《神农本草经》一书中，就将其列为上品药材；明代李时珍所著《本草纲目》对天麻的种类、分布、药性、应用等也做了比较全面介绍。现代药理学研究表明，天麻具有抗衰老、降血压、镇静催眠等疗效。但是，天麻属于完全异养型植物，其生长必须强烈地依赖与蜜环菌共生来获取营养。因此，蜜环菌在天麻的生产种植中，是一类必不可少的真菌，其质量好坏直接决定了天麻的产量和质量。一般来说，使用生长速度快、菌索分枝多、菌索粗壮、菌丝色白的菌种进行伴播，得到的天麻产量高、品质好。

目前，保藏蜜环菌菌种的常用方法有固体培养基低温保藏法、液体石蜡封藏法、真空冷冻干燥法及液氮超低温保藏法等。固体培养基低温保藏法是最常用的保藏方法，但该方法最大的缺点是菌种在保藏过程中极容易出现老化，故保藏时间短。因此，无论是在天麻种植中，还是发酵生产天麻蜜环菌片、蜜环菌酒等蜜环菌产品，都需要频繁的、定期的从事菌种活化。常规的菌种活化过程中，一般直接将老化的菌种转接到固体培养基上，在适宜温度下培养得到新菌种。但以这种方式活化菌种，由于有活性的年轻菌丝体被外层老化后的菌丝体所包裹，故无法充分接触到新鲜培养基；再加之，固体培养基缺乏液体培养基具备的流动性，致使菌丝体与培养基接触不均匀，年轻菌丝体对培养基中营养的利用率往往较低，甚至与固体培养基过度接触的菌丝体在老化后还会完全阻碍营养物质向年轻菌丝体的输送。因此，现有常规菌种活化方法导致了菌丝体在转接至固体培养基活化培养后，营养利用率差、生长缓慢、成活率低。

技术实现要素：

基于上述现有技术存在的问题，本发明提出了一种新的对老化菌种的物理活化方法，即蜜环菌老化菌种的快速活化方法，该方法能够极大地提高蜜环菌老化菌种活化的效率、缩短活化时间。通过活化已经老化的蜜环菌菌种，进行活化菌种的转接培养，以明确高速分散器活化蜜环菌老化菌种所使用的适宜转速、匀质时间及匀质次数，实现实际生产中对老化蜜环菌菌丝体的活化，提高活化效率、缩短活化时间，克服以往蜜环菌老化菌种活化技术的不足。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：（1）选择老化的蜜环菌菌种；（2）液体培养基制备；（3）将步骤（1）菌种放入液体培养基中作匀质处理后；（4）匀浆液25℃振荡培养2-4天后接种到固体培养基中培养；实现蜜环菌老化菌种的快速活化。

所述液体培养基包括以下成分：马铃薯200-400g/l、葡萄糖10-30g/l、蚕蛹粉20-40g/l、kh2po410-20g/l、mgso41-10g/l，培养基ph为4.5-8.0。

所述匀质处理是采用匀质机对含有菌种的液体培养基在转速为5000-30000r/min下进行5s-5min分散处理；可以采用多次分散处理的方式。

所述匀质机为高速分散器。

所述老化的蜜环菌菌种是指采用固体培养基低温保藏法保藏一年以上的老化菌种，菌种的菌索完全角质化。

本发明的有益效果：

（1）本发明提出的蜜环菌老化菌种活化方法，可以缩短活化时间，使其有望成为一种蜜环菌菌种实际制备过程中，节省时间，提高效率的活化方法；

（2）本发明的活化方式主要依赖物理破碎方法，操作简单、成本低廉、安全，对操作人员不需要进行额外的培训；

（3）对加有老化菌丝体的液体培养基进行匀质处理后，使老化的菌索形成极分散的菌丝段，同时使得内部年轻且有活力的菌丝体摆脱外层老化菌索的束缚，得以充分释放出来；所释放年轻菌丝体充分、均匀地接触液体培养基中营养物质，便进行快速增殖，本发明方法促进年轻且有活力菌丝体与液体培养基的接触，提高了对老化菌丝体的活化效率。

附图说明

图1为低温保藏法保藏一年的蜜环菌2018-31菌株的老化菌种；

图2为本发明所述方活化方法培养5天的蜜环菌2018-31菌株活化菌种；

图3为低温保藏法保藏一年半的蜜环菌2018-65菌株的老化菌种；

图4为本发明所述活化方法培养5天的蜜环菌2018-65菌株活化菌种。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明的限定。

实施例1：蜜环菌2018-31菌株老化菌种的活化

（1）老化的菌种：采用固体培养基低温保藏法保藏一年的蜜环菌2018-31老化菌种（如图1）；

（2）液体培养基制备：每升培养基包含以下成分，马铃薯200g、葡萄糖10g、蚕蛹粉30g、kh2po410g、mgso43g，ph6.0；将马铃薯切成丁字块，加入少量水煮制，后用四层纱布进行过滤，在滤液中加入上述培养基中其它成分，充分搅拌混匀，定容到1升，调节ph；然后，分装于250ml三角瓶中，每个瓶有100ml培养基，并于115℃条件下灭菌20min，4℃保存备用；固体培养基制备：在液体培养基中加入15g/l的琼脂（凝固培养基）；

（3）菌种匀质处理：在超净工作台中，将老化菌种平板，连同老化菌索和其生长的固体培养基约20g，加入100ml灭菌的以上制备的液体培养基中，用高速分散器（xhf-dy，宁波新芝生物科技股份有限公司，刀头进行灭菌处理）进行匀质，条件为10,000r/min、分三次匀浆；首次匀浆30s，第二次15s，第三次10s，每次间隔10s，最终得到匀浆液；

（4）将匀浆液在25℃、120r/min的恒温摇床中培养3天，取培养物1ml于固体平板培养基上，涂布均匀，放入恒温培养箱（dhp-9125，金坛市金南仪器制造有限公司），25℃培养5天（如图2），蜜环菌基本长满固体培养基平板，菌株活化成功。

对照例1

蜜环菌2018-31的活化（常规活化方法）：

选择实施例1所述的固体培养基为活化培养基；选择低温保藏法保藏一年的2018-31老化菌种（如图1），在超净工作台中（vd-650，苏州净化设备公司），取0.5cm³大小的老化菌种转接到固体平板培养基上，放入恒温培养箱（dhp-9125，金坛市金南仪器制造有限公司），于25℃培养10天，未萌发生长，菌株活化不成功。

实施例2：蜜环菌2018-65的活化：

（1）采用固体培养基低温保藏法保藏一年半的蜜环菌2018-65老化菌种（如图3）；

（2）液体培养基制备：每升培养基包含以下成分:马铃薯300g、葡萄糖20g、蚕蛹粉20g、kh2po415g、mgso45g，ph5.0；将马铃薯切成丁字块，加入少量水煮制，后用四层纱布进行过滤，在滤液中加入上述培养基中其它成分，充分搅拌混匀，定容到1升，调节ph。然后，分装于250ml三角瓶中，每个瓶有100ml培养基，并于115℃条件下灭菌20min，4℃保存备用。固体培养基制备：在液体培养基中加入20g/l的琼脂（凝固培养基）；

（3）菌种匀质处理：在超净工作台中，将老化菌种平板，连同老化菌索和其生长的固体培养基约20克，加入100ml灭菌的以上制备的液体培养基中，用高速分散器（xhf-dy，宁波新芝生物科技股份有限公司，刀头进行灭菌处理）进行匀质，条件为20000r/min、分三次匀浆；首次匀浆60s，第二次30s，第三次10s，每次间隔10s，最终得到匀浆液；

（4）将得到的匀浆液在25℃、120r/min的恒温摇床中培养2天，取培养物1ml于固体平板培养基上，涂布均匀，25℃培养5-10天，图4为培养5天的蜜环菌2018-65菌株活化菌种；至第10天，蜜环菌长满固体培养基平板，菌株活化成功。

对照例2

蜜环菌2018-65的活化（常规活化方法）：

选择实施例2所述的固体培养基为活化培养基。选择低温保藏法保藏一年半的2018-65老化菌种（如图3），在超净工作台中（vd-650，苏州净化设备公司），取0.5cm³大小的老化菌种转接到新的固体平板培养基上，放入恒温培养箱（dhp-9125，金坛市金南仪器制造有限公司），于25℃培养10天，未萌发生长，菌株活化不成功。