一种顺铂探针体系、其制备方法以及应用与流程

本发明涉及生化分析技术领域，尤其涉及一种顺铂探针体系、其制备方法以及应用。

背景技术：

癌症治疗手段中，化疗是一种常见的有效治疗手段，而其中铂类药物对于特定癌症有较好疗效，如卵巢癌等，得到了广泛的研究。关于其作用机理则存在分歧，主要分为两种类型，一种观点认为顺铂水解活化后可以直达细胞核与dna发生不可逆结合，破坏其空间结构，造成不可修复损伤，导致细胞凋亡；而另外一种观点则认为顺铂产生作用的过程与蛋白质相关，如铜转运蛋白ctr1等。为了研究与顺铂作用过程相关的蛋白，铂结合蛋白组学是必要的手段。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种顺铂探针体系、其制备方法以及应用，能够从细胞中快速富集蛋白用于蛋白组学分析。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种顺铂探针体系，具有式ⅰ所示结构：

其中，m为氨基修饰的磁性纳米粒子，且通过亚氨基与羰基连接。

本发明对所述磁性纳米粒子的种类并无特殊限定，优选为磁性氧化铁纳米粒子。

优选的，所述纳米粒子的粒径为20～30nm。所述氨基修饰的磁性纳米粒子的粒径优选为100～200nm。

r1为c1～c5的亚烷基，更优选为c1～c3的亚烷基，在本发明的一些具体实施例中，r1为亚甲基、亚乙基或亚丙基。

r2为单键或c1～c5的亚烷基，更优选为单键或c1～c3的亚烷基，在本发明的一些具体实施例中，r2为单键、亚甲基、亚乙基或亚丙基。

在本发明的一些具体实施例中，所述顺铂探针体系具有式ⅰ-a所示结构：

或者所述式ⅰ所示结构可以用以下结构式表示：

其中，

表示氨基修饰的磁性纳米粒子。

上述仅为示意图，氨基仅代表磁性纳米粒子表面被氨基修饰，并不代表具体的氨基个数，本发明对于氨基的数量并无特殊限定。

本发明提供了上述顺铂探针体系的制备方法，包括以下步骤：

式ⅱ所示的改性磁性纳米粒子与式ⅲ所示的顺铂化合物进行点击反应，得到式ⅰ所示顺铂探针体系；

其中，m、r1、r2范围同上，在此不再赘述。

优选的，所述式ⅱ所示的改性磁性纳米粒子按照以下方法制备：

a)共沉淀法制备磁性纳米颗粒；

b)采用正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷对磁性纳米颗粒进行修饰，得到氨基修饰的纳米粒子；

c)氨基修饰的纳米粒子与c4～c8炔酸进行反应，得到式ⅱ所示的改性磁性纳米粒子。

优选的，所述式ⅲ所示的顺铂化合物按照以下方法制备：

a)采用二碳酸二叔丁酯对1,3-二氨基-2-丙醇的氨基进行保护，得到化合物1；

b)采用甲磺酰氯对化合物1的醇羟基进行甲磺酰化，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-甲磺酸丙酯，记为化合物2；

c)采用叠氮化钠对化合物2进行叠氮化，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-叠氮基丙烷，记为化合物3；

d)将化合物3的叠氮基氨基化处理，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-氨基丙烷，记为化合物4；

e)将化合物4与c2～c7叠氮羧酸进行酰胺化反应，得到叔丁氧羰基保护氨基的叠氮化合物，记为化合物5；

f)除去化合物5的氨基保护基，得到化合物6；

g)化合物6与pt化合物进行配位反应，得到式ⅲ所示的顺铂化合物。

在本发明的一些具体实施例中，当r1、r2均为亚乙基，即顺铂化合物具有式ⅰ-a结构时，制备方法优选包括以下步骤：

式ⅱ-a所示的改性磁性纳米粒子与式ⅲ-a所示的顺铂化合物进行点击反应，得到式ⅰ-a所示顺铂探针体系；

其中，优选的，所述式ⅱ-a所示的改性磁性纳米粒子按照以下方法制备：

a)共沉淀法制备磁性纳米颗粒；

b)采用正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷对磁性纳米颗粒进行修饰，得到氨基修饰的纳米粒子；

c)氨基修饰的纳米粒子与戊炔酸进行反应，得到式ⅱ-a所示的改性磁性纳米粒子。

优选的，所述式ⅲ-a所示的顺铂化合物按照以下方法制备：

a)采用二碳酸二叔丁酯对1,3-二氨基-2-丙醇的氨基进行保护，得到化合物1；

b)采用甲磺酰氯对化合物1的醇羟基进行甲磺酰化，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-甲磺酸丙酯，记为化合物2；

c)采用叠氮化钠对化合物2进行叠氮化，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-叠氮基丙烷，记为化合物3；

d)将化合物3的叠氮基氨基化处理，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-氨基丙烷，记为化合物4；

e)将化合物4与叠氮丁酸进行酰胺化反应，得到叔丁氧羰基保护氨基的1,3-二氨基-2-(4-叠氮基)丁酰丙胺，记为化合物5；

f)除去化合物5的氨基保护基，得到1,3-二氨基-2-(4-叠氮基)丁酰丙胺，记为化合物6；

g)化合物6与pt化合物进行配位反应，得到式ⅲ-a所示的顺铂化合物。

本发明提供了上述顺铂探针体系或上述制备方法制备的顺铂探针体系在富集蛋白中的应用。

上述顺铂探针体系可进一步应用于蛋白组学分析领域。

在对蛋白进行富集的过程中，本发明可以先将上述式ⅲ所示顺铂化合物与蛋白质溶液混合，pt离子与蛋白结合，然后加入式ⅱ所示的改性磁性纳米粒子，与顺铂化合物的叠氮基进行点击反应，进而对蛋白进行富集。

本发明也可以先将式ⅱ所示的改性磁性纳米粒子与式ⅲ所示的顺铂化合物进行点击反应，得到式ⅰ所示顺铂探针体系，然后与蛋白质溶液混合，对蛋白进行富集。

具体的，本发明提供了一种蛋白富集的方法，包括以下步骤：

式ⅲ所示的顺铂化合物与蛋白质溶液混合进行反应，然后加入式ⅱ所示的改性磁性纳米粒子，与顺铂化合物的叠氮基进行点击反应，进而对蛋白进行富集；

本发明还提供了一种蛋白富集的方法，包括以下步骤：

式ⅰ所示的顺铂探针体系与蛋白质溶液混合进行反应，对蛋白进行富集；

其中，m、r1、r2范围同上，在此不再赘述。

上述蛋白质溶液中，蛋白可以为本领域技术人员熟知的可以与顺铂结合的蛋白，如铜蛋白atox1等，本发明对此并无特殊限定。

与现有技术相比，本发明提供了一种顺铂探针体系，具有式ⅰ所示结构。是一种能够从细胞中快速富集获取分析铂结合蛋白组的金属探针体系，推动了铂结合蛋白组的研究，可进一步理解铂类抗癌药物的作用机理，为药物改良作理论基础。

附图说明

图1为产物iv叔丁氧羰基保护氨基的1，3-二氨基-2-氨基丙烷的核磁共振氢谱图；

图2为4-叠氮基丁酸的红外吸收图谱；

图3为产物vii顺铂化合物的质谱分析图谱；

图4为磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜图；

图5为本发明中蛋白质-顺铂探针-纳米颗粒载体复合物的结构示意图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的顺铂探针体系、其制备方法以及应用进行详细描述。

实施例1顺铂化合物的制备

a)将1，3-二氨基-2-丙醇、二碳酸二叔丁酯、碳酸钾按照质量比1：5：4投入到反应溶剂中，反应溶剂是四氢呋喃、水体积比1：1，反应条件为常温常压搅拌12小时，反应结束后利用等体积的乙酸乙酯萃取三次。本反应为相转移反应，得到的产物i为由叔丁氧碳基保护的1，3-二氨基-2丙醇。

b)将上述产物i与新制备的甲磺酰氯按照物质的量比1：3在二氯甲烷中进行混合(冰水浴)，然后加入适量的三乙胺，然后磁子搅拌反应4小时。反应结束后，将产物用饱和食盐水洗涤2次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗涤三次，保留下层有机溶剂层(二氯甲烷密度较大)，无水硫酸镁干燥，抽滤后保留滤液，移至旋转蒸发仪去除溶剂二氯甲烷，得到产物ii——叔丁氧羰基保护氨基的1，3-二氨基-2-甲磺酸丙酯。

c)将上述产物ii与叠氮化钠按照物质的量1：1.2的比例加入到n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，在80℃条件下，搅拌反应12小时。反应结束后，转移到冷的去离子水中停止反应，再用等体积乙酸乙酯分两次进行萃取，保留上层有机层。将产物用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸镁干燥，干燥后抽滤得滤液，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到黄色固体。将黄色固体用环己烷进行重结晶，得到产物iii叔丁氧羰基保护氨基的1，3-二氨基-2-叠氮基丙烷。

d)将上述产物iii和三苯基磷按照物质的量比1：1.2(staudinger反应)溶解在四氢呋喃中，在80℃条件下搅拌反应6小时。将反应液调为酸性(ph约为4)，产物转化为铵盐，用乙酸乙酯洗涤反应液，除去反应液中的三苯基膦和三苯氧磷；再将反应液调为碱性(ph约为10)，此时产物完全转化为氨基状态，用等体积乙酸乙酯进行萃取2次，将萃取液用饱和食盐水洗涤2次，再用无水硫酸镁进行干燥。干燥后的溶液进行抽滤，保留滤液，用旋转蒸发仪去除溶剂，得到白色的固体，即产物iv叔丁氧羰基保护氨基的1，3-二氨基-2-氨基丙烷。

产物iv叔丁氧羰基保护氨基的1，3-二氨基-2-氨基丙烷的核磁共振氢谱图见图1所示。

e)将上述产物iv与新制备的叠氮丁酸进行酰胺反应。称取1：7质量比的叠氮丁酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)在二氯甲烷(dcm)中混合搅拌2小时。将上述产物(产物与叠氮丁酸物质的量之比约为1：1.2)加入到反应液中，常温下搅拌12小时。反应结束后，将反应液用水洗涤两次，去除edc。将下层有机层用无水硫酸镁进行干燥，干燥后抽滤得滤液，用旋转蒸发仪去除溶剂得到透明油状液体，在冷冻干燥机中得到白色固体，即产物v叔丁氧羰基保护氨基的1，3-二氨基-2-(4-叠氮基)丁酰丙胺。

4-叠氮基丁酸的红外吸收图谱见图2所示。

f)上述产物v在新制备的氯化氢的二噁烷(二氧六环)溶液中去除叔丁氧羰基保护基。反应结束后，用旋转蒸发仪去除二氧六环和叔丁醇，得到白色的油状液体，充分干燥后得到白色固体，即产物vi1，3-二氨基-2-(4-叠氮基)丁酰丙胺。

g)将上述产物vi与pt(dmso)2cl2按照物质的量比1：1反应。反应过程是先将上述产物溶解于无水的dmf中，再加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)，均匀混合，再加入pt(dmso)2cl2，然后在黑暗条件下反应48小时。反应结束后，加入适量的去离子水，冷却静置，24小时后得到黄色固体，洗涤干燥，得到产物vii顺铂化合物，其结构如式ⅲ所示：

上述顺铂化合物的质谱分析图谱见图3所示。

实施例2磁性氧化铁纳米颗粒富集载体的制备

a)共沉淀法制备磁性氧化铁纳米颗粒

称取2.7029gfecl3·6h2o和0.9941gfecl2·4h2o(物质的量之比2：1)，然后在圆底烧瓶中用42ml：8ml的乙醇水混合溶液50ml溶解，将黄色混合溶液升温至40℃(恒温)，用恒压分液漏斗缓慢滴加10ml浓氨水。氨水滴加结束后，继续保持反应15分钟，再升温至75℃，保温熟化1小时。最后得到的分散系静置冷却，用水洗涤备用。(利用磁性洗涤)

b)包裹修饰

将上一步制备的磁性氧化铁纳米颗粒均匀分散到20ml乙醇/水(体积比1：1)的溶液中，用氢氧化钠和醋酸调节ph至10，用氮气吹扫10分钟，排出当中的气体。将分散系升温到85℃，温度恒定后，依次缓慢加入500ul正硅酸乙酯(teos)，200ul3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，保持高速搅拌，继续恒温反应3个小时。反应结束后，用水洗涤三次，再分散到乙醇中备用。

c)表面改性-修饰上炔基

先将戊炔酸与edc·hcl在dcm中按照1：1.2的物质的量之比混合反应2个小时，再将上述经过氨基修饰的纳米颗粒加入至dcm中，并继续搅拌反应24小时。反应结束后，利用磁性将改性后的纳米颗粒分离出来，并用水洗涤两次。

制备的磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜图见图4所示，可以看出，纳米颗粒呈分散状态。

实施例3点击反应制备顺铂探针体系

将实施例1制备的顺铂化合物和实施例2制备的改性纳米粒子进行点击反应，得到式ⅰ所示顺铂探针体系。

实施例4

已知铜蛋白atox1是一种可以与顺铂结合的蛋白。用大肠杆菌进行表达，得到含有atox1蛋白的溶液，用bradford法测量得到其浓度为0.132mg/ml。将实施例1制备的顺铂化合物投入到蛋白质溶液中，37度下反应2小时，再加入实施例2制备的炔基修饰磁性纳米氧化铁颗粒，之后加入一价铜催化反应完成后，用磁铁将纳米载体吸附在pe管壁上，再测量蛋白质溶液，发现蛋白质浓度过低(0.003mg/ml)，属于误差范围内的量级。因此，蛋白质主要富集在顺铂探针体系上，蛋白质的富集效率大于95％。

所形成的蛋白质-顺铂探针-纳米颗粒载体复合物的结构示意图见图5所示。

可见，本申请制备的顺铂探针体系具有较高的蛋白富集率。

由上述实施例可知，本发明制备的顺铂探针体系具有较高的蛋白富集率。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。