Ran基因及其dsRNA在害虫防治中的应用的制作方法

文档序号：17188795发布日期：2019-03-22 21:45阅读：656来源：国知局

本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域。具体涉及飞蝗ran基因及其dsrna在害虫防治中的应用。

背景技术：

飞蝗locustamigratoria，是一种洲际性的农业害虫，主要分布于亚、欧、非、澳四大洲。它具有暴发性、群集性和迁飞性的特点，一旦发生，不仅涉及面广，而且来势凶猛，致灾严重。目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，不仅容易导致昆虫产生抗药性，并且给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，因此研发绿色新型农药对我国防治蝗虫工作具有重要意义。

rna干扰（rnai）是一种由双链rna分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，rnai技术一直跻身于科技前沿。rnai不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过rnai进行害虫防治具有如下特点：1）杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2）rna在自然界极易降解，无残留；3）对环境无毒无害，相对安全。目前国际上已将基于rnai的害虫防治称为第四代杀虫剂。筛选和鉴定对害虫生长发育至关重要的基因是应用rnai技术开发新型杀虫剂的关键环节，因为不是所有的dsrna都能有效的沉默靶基因的表达，也不是所有的dsrna都能杀死害虫

ran是小g蛋白家族成员之一，可以在rangdp和rangtp两种形式之间转换，在调控核质运输、微管形成、有丝分裂的纺锤体形成及细胞分裂后核膜的组装中均起着重要作用。采用rna干扰技术，本课题组首次证实注射飞蝗ran基因dsrna至5龄若虫后出现100%致死现象。因此，ran基因可作为基于rnai的害虫防治技术的高致死靶标基因。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种昆虫ran基因全长cdna序列及其dsrna在致死飞蝗中的应用。

本发明提供一种飞蝗ran基因全长cdna序列，其核苷酸序列为seqidno：1。该基因全长cdna序列是基于飞蝗转录组数据库搜索获得，该核苷酸长度为648bp，其核苷酸序列为seqidno：1。

本发明提供飞蝗ran基因dsrna在害虫防治中的应用，基于飞蝗ran基因cdna序列，通过primerpremier5.0软件设计含有t7启动子的上游引物和下游引物，通过pcr扩增获得两端为t7启动子的模板。试剂盒纯化后按照t7ribomax™expressrnaisystem（promega）试剂盒说明体外转录合成dsrna。通过微量注射器将合成的dsrna注射进入飞蝗体腔内。结果表明：注射dsrna后飞蝗ran基因的mrna表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致100%的死亡。

附图说明

图1：注射ran基因的dsrna进入5龄飞蝗体内24h，48h和72h后对ran基因mrna表达的影响。β-actin为内参基因。其中*p<0.05，****p<0.001。

图2：注射ran基因的dsrna对5龄飞蝗若虫生长发育的影响。注射ran基因的dsrna飞蝗出现生长发育受阻并导致100%的死亡。a：左侧为注射水的对照，右侧为注射seqidno：2合成的dsrna，即dslmran。

具体实施方式

实施例一：飞蝗ran基因全长cdna及基因片段的获得

基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗ran基因进行搜索，获得飞蝗ran基因（lmran）全长cdna序列，采用primerpremier5.0软件设计上下游引物用于验证全长cdna序列，并送往上海英潍捷基生物有限公司合成。选取生长健康，大小一致雌雄各半的5龄飞蝗若虫3头，在体式显微镜下将其体壁快速解剖下来，并冷冻于液氮中。依照takararnaisoplus试剂盒提取rna。采用reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-)说明书将所提rna反转录成第一链cdna，以此做为模板，结合设计的上下游引物，通过pcr扩增lmran基因全长序列。将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，并送往上海英潍捷基生物有限公司进行测序，其序列为seqidno：1。

实施例二：飞蝗ran基因特异性dsrna合成

1）飞蝗ran基因dsrna引物的设计

基于飞蝗ran基因全长cdna序列，采用primerpremier5.0软件设计dsrna引物，其序列分别为seqidno：3和seqidno：4。上下游引物均携带t7启动子序列。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

2）飞蝗ran基因dsrna的合成

以上述序列为seqidno：1的ran基因提取质粒为模板，seqidno：3和seqidno：4做为上下游引物，进行pcr扩增。将扩增的pcr产物，其序列为seqidno：2，经fastpuregeldnaextractionminikit（vazyme）试剂盒纯化后按照t7ribomax™expressrnaisystem（promega）试剂盒说明体外转录合成dsrna。使用nanodrop2000（thermoscientific）进行定量，使其终浓度达到2μg/μl。保存于-80℃超级低温冰箱备用。

实施例三：飞蝗ran基因dsrna致死飞蝗实验

1、飞蝗ran基因dsrna的注射

选取生长健康、大小一致、雌雄各半共60头5龄2天若虫进行实验组dslmran基因的注射。将合成的dslmran使用微量注射器将5µl（10μgdslmran）轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时注射相同体积水至对照组（60头，雌雄各半）。将注射后飞蝗置于30℃恒温生化培养箱中饲养（光照：黑暗时间=14h:10h，温度30±2℃，湿度60％），每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。

2、飞蝗ran基因沉默检测

分别收集注射水和dslmran24h、48h和72h后若虫虫体进行总rna提取，每个时间点对照和注射dslmran组各3个生物学重复，每个生物学重复3头试虫，并反转录成第一链cdna，采用rt-qpcr方法分别检测目的基因（lmran）和管家基因（β-actin）的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dslmran组试虫lmran基因表达显著降低（如图1所示）。

3、注射ran基因dsrna后5龄若虫表型观察

5龄若虫注射dslmran后，对照组虫体在7天全部成功蜕皮至成虫，且蜕皮后成虫发育状态良好。与对照组比较，注射dslmran后飞蝗未出现蜕皮延迟现象，在第7天全部死亡，死亡率达到100%，如图2所示。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>山西大学

<120>ran基因及其dsrna在害虫防治中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>648

<212>dna

<213>飞蝗(locustamigratoria)

<400>1

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