本发明属于微生物
技术领域：
，涉及一种微生物菌剂及其在防治便秘上的应用，具体是一种由解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensyhsh-58制备而成的微生物菌剂在防治便秘上的应用。
背景技术：
：便秘是临床上最常见的消化系统疾病，其发病情况在不同地区和学者的报道中各有不同，总体而言是西方高于东方，女性高于男性，老年人高于青年人，儿童患病也普遍存在。据调查，西方人群便秘的发病率约在6%-23%，我国地域范围辽阔，各地发病率调查结果不尽相同:北京市常住人口1870岁城乡居民6.07%人群患有便秘，男女比例为l:4.59;天津市15岁以上常住人口的便秘患病率为4.43%，男女比例1:2.75;广州市的调查结果显示，便秘患者随年龄增长而明显增加，60岁以上老人总患病率为7.3%。北京、上海、广州、沈阳、西安、成都6个城市中60岁以上老人便秘的发病率高达15%-20%，并且发病率随年龄增长而增加，乡村(12.3%)>城市(10.9%)，北方(17.5%)>南方(7.0%)，女性(12.2%)>男性(10.5%)。便秘是指各种原因引起的排便困难、排便次数减少、或排便不尽感，可分为功能性便秘和继发便秘两类。便秘的发生可能与饮食中纤维素含量少、液体量摄入不足、遗传易感、胃肠运动、胃肠激素、环境影响、精神心理等多种因素有关。现代先进技术大量运用于便秘这种常见疾病的研究加深了人们对于其发病原因发病机制的认识。西医对于便秘的诊断较为明确，治疗方法主要采用口服药物治疗，常用药物包括容积性泻剂、刺激性泻剂、渗透性泻剂、润滑性泻剂、促动力药物等。这些药物对于缓解便秘近期疗效令人满意，但是远期疗效相对较差。部分药物长期不合理使用容易导致不良反应，如葱酮类药物长期使用可致水、电解质失去和结肠功能障碍，还可造成患者对药物的依赖性;盐类泻药中的镁离子大约20%可被肠道吸收，肾功能障碍病人或中枢抑制的病人可能发生毒性反应。中医治疗功能性便秘具有中医的特色和优势，但是常用的中药（如大黄，番泻叶，芦荟等含有恩醌类的刺激性泻药），这些药物对于缓解便秘近期疗效令人满意，但是远期疗效相对较差。长期使用普遍疗效不佳，而且在治疗上忽视本虚标实这一基本病机，有的单纯祛邪，有的单纯补虚，效果不理想。近年来功能性便秘的治疗有了新的发展，出现了心理疗法、生物反馈治疗等方法，临床上颇有疗效，但这些只可作为药物治疗便秘的辅助手段。近年来，对益生菌的研究和应用越来越广泛，在人类健康中起了非常重要的作用。解淀粉芽孢杆菌是一种产芽孢、需氧的革兰氏阳性菌，具有抗逆性强、抑菌谱广、代谢产物丰富等特点，作为益生菌添加在饲料中，通过抑制病原菌粘附、生物夺氧、拮抗病原菌、分泌多种消化酶等，营造健康肠道环境，促进营养物质吸收利用，提高畜禽健康水平。但其还没有被应用到人用益生菌上，本发明通过大量试验发现一株解淀粉芽孢杆菌，对防治便秘效果非常好的一株动物肠道分离菌。技术实现要素：本发明的目的是提供一种微生物菌剂在防治便秘上的应用，具体是提供一种由解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensyhsh-58制备而成的微生物菌剂在防治便秘上的应用。该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno．13664，保藏日期为2017年2月16日（在专利号cn2017114966711中已经公开）。其中,包括解淀粉芽孢杆菌yhsh-58制备的菌剂单独应用或与其他药物联合应用。其中，所述菌剂包括药品、保健食品、食品、饮品。其中，所述菌剂所指有效剂量是指解淀粉芽孢杆菌yhsh-58总活菌数不能低于5×106cfu/g。其中，本发明的微生物菌剂（也可称解淀粉芽孢杆菌制剂）的制备可以按以下步骤制备（也可以用其它方法制备）：一、取出菌种保藏管，用lb固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升lb培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2llb培养基的5l大三角瓶中，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600l发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：1，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于200亿cfu/ml，即可结束发酵，无菌灌装得到成品解淀粉芽孢杆菌菌剂；或得到发酵液后加上糊精进行喷雾干燥，得到解淀粉芽孢杆菌粉剂，其粉剂芽孢含量不低于100亿cfu/g；其中所述lb培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2，固体培养基中加入琼脂2%；其中所述发酵培养基：大豆分离蛋白粉60g/l，葡萄糖15g/l，可溶性淀粉10g/l，蛋白胨5g/l，硫酸镁0.3g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，ph7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15mpa，121℃灭菌30分钟。本发明的解淀粉芽孢杆菌yhsh-58在专利号cn2017114966711中已经公开了其能够有效预防或治疗孤独症，明显减少孤独症状，且无任何毒副作用，应用依从性好，是预防或治疗孤独症的新方法、新突破。在防治孤独症的过程中，发现服用过解淀粉芽孢杆菌yhsh-58菌剂的人员，其便秘症状能快速转好，而且在长期使用过程中不复发，效果依然显著，因此拓宽了其使用范围。本发明的解淀粉芽孢杆菌制剂能够有效预防或治疗便秘，明显快速减少便秘症状，且无任何毒副作用，应用依从性好，经1-2个疗程，防治便秘总有效可达100%，治愈率达92%，是预防或治疗便秘的新菌株。本发明的解淀粉芽孢杆菌能有效防治便秘可能从下面几个方面起到一定的作用：本发明的解淀粉芽孢杆菌yhsh-58能够抑制洛呱丁胺诱导的便秘造成的小鼠粪便重量、颗粒数和含水量下降，且效果优于整肠生地衣芽孢杆菌。（洛哌丁胺具有抑制肠道蠕动、增加粪便排空时间等特性，因此，其诱导的便秘小鼠具有较少粪便粒数、重量等特点。）本发明利用肠道推进实验来探索解淀粉芽孢杆菌yhsh-58对肠道蠕动的促进作用。结果显示解淀粉芽孢杆菌yhsh-58组小肠墨汁推进长度能够比便秘模型组至少快153%，提示解淀粉芽孢杆菌yhsh-58能够加快小肠蠕动并具有显著通便效果。本发明的解淀粉芽孢杆菌能够有效提高便秘小鼠粪便短链脂肪酸的含量。主要是可能芽孢杆菌进入小鼠肠道后，快速消耗肠道中的空气或者芽孢杆菌的某些代谢产物，从而促进了肠道中的厌氧菌如乳酵杆菌，丁酸菌的繁殖，从而导致肠道ph下降与短链脂肪酸的增加；能够促进结肠短链脂肪酸的产生，并促进结肠上皮细胞与粘膜损伤的修复。本发明的解淀粉芽孢杆菌可改善胃肠道间质细胞(icc)的c-kit基因表达，从而增加结肠的蠕动性能，促进排便。解淀粉芽孢杆菌能够影响结肠蠕动速率、抑制致病菌生长，并且能够促进短链脂肪酸的生成短链脂肪酸和乳酸能调节肠道的酸碱度、降低ph，这些因素可能会对结肠蠕动和缓解便秘产生有效的作用。具体实施方式实施例1本发明微生物菌剂（解淀粉芽孢杆菌菌液或粉剂）的制备一、取出菌种保藏管，用lb固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升lb培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2llb培养基的5l大三角瓶中，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600l发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：1，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于200亿cfu/ml，即可结束发酵，无菌灌装得到成品解淀粉芽孢杆菌菌剂；或得到发酵液后加上糊精进行喷雾干燥，得到解淀粉芽孢杆菌粉剂，其粉剂芽孢含量不低于100亿cfu/g；其中所述lb培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2，固体培养基中加入琼脂2%；其中所述发酵培养基：大豆分离蛋白粉60g/l，葡萄糖15g/l，可溶性淀粉10g/l，蛋白胨5g/l，硫酸镁0.3g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，ph7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15mpa，121℃灭菌30分钟。实施例2本发明微生物菌剂（解淀粉芽孢杆菌）的安全性试验本发明实施例1生产的解淀粉芽孢杆菌液在邵阳学院经大鼠急性毒性试验，结论结果表明解淀粉芽孢杆菌液对大鼠（按0.6ml/10g体重饲喂本发明解淀粉芽孢杆菌液14天）效果：大鼠全部存活,活动自如,毛发光滑,饮食正常,呼吸道、眼及口腔等处无分泌物外，未发现任何中毒症状，体重均有增加。与空白组对照组，比较，饲喂本解淀粉芽孢杆菌液的大鼠体重明显增加（p＜0.001）。14天观察期结束，将大鼠脱臼处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、小肠等脏器均未见明显异常表现。另外，大鼠胸腺系数和脾脏系数结果表明，与空白对照组比较，解淀粉芽孢杆菌液试验组大鼠脾脏系数明显增加（p＜0.01），提示本解淀粉芽孢杆菌液具有免疫增强作用，属实际无毒类物质，安全度大。实施例3解淀粉芽孢杆菌对小鼠便秘防治效果小鼠便秘模型建立小鼠饲养环境下适应1周后，皮下注射5mg/kg盐酸洛哌丁胺（loperamidehydrochloride）生理盐水悬浊液，每天9:00和18:00各一次，连续7天，其中选取20只作为正常组给予同剂量的生理盐水。选取粪便干结、数量减少、重量减轻的小鼠作为便秘小鼠。分组与给药剂量选取造模成功的80只小鼠随机分成模型组(constipation、整肠生地衣芽孢杆菌组（将东北制药集团公司沈阳第一制药有限公司生产整肠生菌株分离纯化后，纯种发酵后离心，发酵培养基与解淀粉芽孢杆菌发酵培养基相同）、凝结芽孢杆菌组（青岛东海药业有限公司生产，将菌株分离纯化后，纯种发酵后离心）和解淀粉芽孢杆菌组（将实施例2生产的解淀粉芽孢杆菌液体菌剂离心），将芽孢杆菌悬浮于生理盐水中调至菌含量为1.0×107cfu/ml，正常组(normal)和模型组灌胃同剂量生理盐水。按照2ml/kg的剂量给药。连续灌胃15天。实验过程中，称量体重，并测定采食量、饮水量。第15天给药后，6h内观察粪便性状，收集粪便，计数并称重。收集的粪便置于真空冷冻干燥机内冻干，计算粪便含水量。解淀粉芽孢杆菌对便秘小鼠饮食、饮水及粪便指标的影响表1数据显示，和正常组相比，洛呱丁胺诱导的便秘小鼠在饮食量、饮水量和粪便指标(粪便粒数、粪便重量、粪便含水率)等方面都有显著降低(p<0.05)。上述粪便指标显示该便秘模型建立成功。便秘小鼠经芽孢杆菌干预后，相关指标均有明显改善(p<0.05)。洛哌丁胺具有抑制肠道蠕动、增加粪便排空时间等特性，因此，其诱导的便秘小鼠具有较少粪便粒数、重量等特点。本发明结果证实，解淀粉芽孢杆菌具有通便和促进肠道蠕动的作用。洛哌丁胺能够减少饮食饮水量的机制还不清楚，但是便秘小鼠(与正常组比较)的粪便排出情况远大于摄食量的差异。解淀粉芽孢杆菌的摄入能够有效增加便秘小鼠摄食饮水状况。表1解淀粉芽孢杆菌干预对便秘小鼠饮食、饮水及粪便指标的影响组别摄食量(g/d)进水量(ml/d)粪便粒数粪便重量(g)粪便含水率(%)正常组5.55±0.127.21±0.1316.10±1.120.42±0.0551.02±1.72模型组4.61±0.195.76±0.269.01±1.480.21±0.0423.54±2.42地衣芽孢杆菌组4.95±0.226.70±0.3412.89±1.450.28±0.0536.88±2.51凝结芽孢杆菌组5.08±0.196.88±0.2413.67±1.420.30±0.0535.01±2.66解淀粉芽孢杆菌组5.46±0.217.14±0.1815.13±1.610.39±0.0646.98±1.49解淀粉芽孢杆菌对小鼠小肠推进实验结果最后一次给药24h后，灌胃墨汁，30min后每组一半小鼠(10只)脱椎处死，取小鼠血浆备用，打开腹腔，分离小肠肠管，将小肠在无张力情况下拉成直线进行测量肠管长度与墨汁推进长度。墨汁推进率计算公式:墨汁推进率(%)=墨汁推进长度(cm)÷小肠总长度(cm)x100每组剩余10只小鼠继续观察其排出首粒黑便的时间。表2数据显示，与正常组相比，便秘模型组墨汁在30min内推进长度与肠道推进率显著降低(p<0.05);便秘模型组肠道长度有所降低，但结果不具有显著性差异。灌胃芽孢杆菌后，墨汁推进长度与肠道推进率显著提高(p<0.05);特别是灌喂解淀粉芽孢杆菌后，其对便秘小鼠肠道推进率有显著提高，另外，解淀粉芽孢杆菌小肠长度较便秘模型组有所增长，但不具有显著性差异。本发明利用肠道推进实验来探索解淀粉芽孢杆菌yhsh-58对肠道蠕动的促进作用。结果显示，解淀粉芽孢杆菌yhsh-58各组小肠墨汁推进长度能够比便秘模型组至少快153%，提示解淀粉芽孢杆菌yhsh-58能够加快小肠蠕动并具有通便效果。便秘造成肠道运动减慢，粪便在肠道中滞留时间增加，使首粒黑便排出时间加长，越短的首粒黑便排出时间意味着肠道运动越正常。由表2可以看出，正常组的首粒黑便排出时间最短(93.3±11.1min)，便秘对照组的首粒黑便排出时间最长(221.4±20.6min)，整肠生地衣芽孢杆菌组的首粒黑便排出时间(184.3±16.9min)与凝结芽孢杆菌组（168.4±16.6min）显著长于解淀粉芽孢杆菌组的首粒排便时间为（120.1±13.6min），说明解淀粉芽孢杆菌组可以减少便秘小鼠的首粒黑便排出时间，具有良好的便秘缓解作用，且效果明显优于整肠生地衣芽孢杆菌组与凝结芽孢杆菌组。表2解淀粉芽孢杆菌对便秘小鼠肠道推进率的影响组别黑汁推进长度小肠长度墨汁推进率首粒排便时间（min）正常组37.12±2.4551.81±0.9871.64±4.4293.3±11.1模型组13.82±1.8749.26±0.8828.06±2.98221.4±20.6地衣芽孢杆菌组19.12±1.7650.98±1.0837.50±3.64184.3±16.9凝结芽孢杆菌组20.28±2.8851.25±1.3439.57±3.88168.4±16.6解淀粉芽孢杆菌组34.99±2.5651.98±1.6467.31±3.12120.1±13.6解淀粉芽孢杆菌对便秘小鼠粪便短链脂肪酸的影响短链脂肪酸是一类肠道(主要是结肠)菌群发酵复杂碳水化合物的末端产物。现在己知乙酸(c2)、丙酸(c3)、丁酸(c4)在人和哺乳动物结肠内大量存在，并具有重要的生理机能。研究显示，短链脂肪酸具有一定的通便与修复结肠粘膜损伤的作用。jeon等利用奶酪发酵的燕麦粉末来研究对洛哌丁胺诱导便秘大鼠大肠短链脂肪酸的影响，结果显示，发酵燕麦摄入的大鼠较便秘模型组大鼠短链脂肪酸提高1.4倍。本发明中，便秘小鼠灌胃芽孢杆菌后，其应该是促进了肠道中的乳酸菌及丁酸梭菌的生长，从而乙酸、丙酸、正丁酸和总短链脂肪酸水平均有明显提高。研究显示，乙酸含量增加有利于肠道结肠蠕动和排便，短链脂肪酸总体含量增加能够降低肠道环境的ph值。现己证实，结肠低水平的ph值具有诸多有益特性。本发明中，便秘小鼠短链脂肪酸含量的升高和ph值降低与芽孢杆菌的摄入密不可分。由表3与表4数据可知，便秘模型组乙酸、丙酸、正丁酸含量较正常组都有明显降低，ph值显著升高，其中乙酸、正丁酸、总短链脂肪酸含量及ph值具有显著性差异(p<0.05)。在三个芽孢杆菌组中，乙酸、丙酸和总短链脂肪酸含量均显著提高，ph值显著降低(p<0.05)，显示芽孢杆菌组能够有效提高粪便短链脂肪酸的含量。但明显的是解淀粉芽孢杆菌组对便秘小鼠的粪便短链脂肪酸有更明显的影响。表3各组小鼠粪便乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸的含量组别乙酸（μmol/g）丙酸（μmol/g）正丁酸（μmol/g）总脂肪酸（μmol/g）正常组61.78±4.677.24±0.5610.53±0.5578.07±6.61便秘组32.56±2.684.96±0.215.79±0.1843.19±3.11地衣芽孢杆菌组42.98±3.765.93±0.737.19±0.7756.10±7.08凝结芽孢杆菌组43.45±4.156.07±0.447.48±0.3457.0±4.23解淀粉芽孢杆菌组54.23±4.867.14±0.429.76±0.5371.13±6.71表4各组小鼠粪便ph水平组别正常组便秘组地衣芽孢杆菌组凝结芽孢杆菌组解淀粉芽孢杆菌组ph7.32±0.087.82±0.057.50±0.047.46±0.047.38±0.03解淀粉芽孢杆菌yhsh-58对小鼠血清mtl,gas,et,ss,ache,sp和vip水平的影响取收集的小鼠血浆，4500rmp离心15min，分离血清，按试剂盒操作说明测定小鼠血清的胃动素（motilin,mtl）,胃泌素（gastrin,gas）,内皮素(endothelin,et),生长抑素(somatostatin,ss),乙酰胆碱酯酶(axetylcholinesterase,ache),p物质(substancep,sp)和血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,vip)水平。mtl可以刺激胃蛋白酶的产生和促进肠道运动;gas能促进胃肠分泌和胃肠运动，促进幽门松弛，起到缓解便秘的作用;et在血管张力稳定性和维持基本心血管系统中起重要作用;ss可以刺激肠道运动;ache可以调节肌肉收缩和粘液分泌，可以使肌肉放松从而推进粪便排出;sp是一种有助于肠道蠕动的物质;保持vip在肠壁中的正常含量也是稳定肠道功能的重要手段。由表5可以看出，正常组小鼠血清的mtl,gas,et,ache,sp和vip水平最高，ss水平最低;便秘对照组小鼠呈现出相反的趋势;芽孢杆菌组都可以使上述物质的血清水平接近正常组水平，但解淀粉芽孢杆菌yhsh-58的作用更显著，说明解淀粉芽孢杆菌yhsh-58可以使便秘小鼠的血清mtl，gas，et，ss，ache，sp和vip水平尽量保持正常，从而缓解便秘。表5解淀粉芽孢杆菌yhsh-58对小鼠血清mtl，gas，et，ss，ache，sp和vip水平的影响解淀粉芽孢杆菌对便秘小鼠肠道c-kit基因表达的影响肠道间质细胞(interstitialcellsofcajal,icc)广泛分布在结肠的各肌层中，它在控制肠道蠕动方面发挥着重要的作用。文献显示，icc是胃肠道平滑肌的起搏细胞，可以产生生理慢波。该慢波通过促进电活动的扩散来控制消化道中平滑肌有节律的蠕动与收缩。icc的减少可能导致慢波活动紊乱、减少平滑肌的收缩，进而导致慢传输便秘的发生。另外，便秘个体内icc的减少可能会破坏正常的结肠蠕动节律。肠道内icc的基因表达可以利用c-kit的阳性表达来衡量。lee等发现c-kit对icc网络具有重要作用，c-kit的缺失能够破坏icc网络，可能导致便秘与巨结肠病的发生。本发明利用c-kit的免疫组织化学方法检测icc的表达，发现icc在便秘小鼠结肠中表达降低，解淀粉芽孢杆菌摄入后，icc表达显著提高，其机理暂时还不清楚。正常的c-kit阳性免疫组化表达为棕色。便秘模型组较正常组结肠c-kit分布明显减少。由表6可知，解淀粉芽孢杆菌灌胃后，c-kit阳性细胞较便秘模型组有所增加。光密度分析表达结果显示，c-kit在便秘模型组中表达较正常组显著降低(p<0.05)，灌胃芽孢杆菌后，各剂量组c-kit表达水平均显著提高(p<0.05)。表6结肠间质细胞(icc)的免疫组织化学表达(a,200x)与光密度值(b)组别正常组便秘组地衣芽孢杆菌组凝结芽孢杆菌组解淀粉芽孢杆菌组c-kit表达光密度值0.120.070.090.090.11实施例4解淀粉芽孢杆菌yhsh-58在人体便秘试验效果服用本发明解淀粉芽孢杆菌菌剂治疗便秘效果如下：对便秘100人，餐后口服33ml一次，一日三次，三天一疗程，经1-2个疗程，总有效可达100%，治愈率达92%，治愈以后，每两天至少喝一次解淀粉芽孢杆菌菌剂，基本不再出现便秘症状。主要病例蒋某，女，52岁，广东省佛山市某高校老师，患习惯性便秘11年，每天饭后服用本发明解淀粉芽孢杆菌菌剂33ml，两天后，便秘改善，三天后便秘症状消失，以后每天喝一次，至今未再出现便秘。陈某，女，59岁，广西南宁市某融资公司高管，患习惯性便秘12年，2018年2月，每天饭后服用本发明解淀粉芽孢杆菌菌剂33ml，两天后，便秘改善，四天后便秘症状消失，以后每天喝一次，至今未再出现便秘。李某，男，28岁，某公司技术人员，经常晚上吃烧烤之后引起的严重便秘，吃完烧烤后服用本发明解淀粉芽孢杆菌菌剂33ml，第二天没有便秘现象，以后每次吃烧烤后都喝一次，至今未再出现便秘。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。当前第1页12