禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重RT-PCR检测的引物及试剂盒的制作方法

本发明属于rt-pcr检测试剂盒技术领域，具体涉及到禽流感病毒目前流行的h5、h7、h9三种亚型的三重rt-pcr检测引物组、体系配比以及试剂盒及其应用。

背景技术：

禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)属于正粘病毒科甲型流感病毒属成员，为单股分节段负链rna病毒。根据病毒囊膜表面的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的抗原性差异，禽流感病毒可分为多个血清亚型，目前已发现有18种ha和11种na。病毒基因组为8个独立的rna片段，每一条rna片段都是以不同的核糖核酸蛋白复合体形式存在。其中rna片段4编码血凝素(ha)，它是aiv基因组中变异率最大的一个片段，不同亚型病毒以及同一亚型不同毒株之间均有很大差异。

至今为止，从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，高致病性禽流感可引起鸡群100％死亡。禽流感病毒除了可以感染禽类外，部分亚型也能感染人，如h5、h7、h9三种。鸡是h5、h7、h9亚型禽流感病毒感染的主要宿主，禽流感历来被认为是人流感病毒发生变异的新基因来源，更突出显示了禽流感的公共卫生意义。目前，急需建立一种快速分型检测h5、h7、h9三种亚型禽流感病毒的方法及相应的试剂盒研制。

中国cn200410010805.0号专利公开一种禽流感病毒反转录聚合酶链式反应检测方法及试剂盒，属于生物技术领域，特别是涉及一种禽流感病毒检测的方法。本发明目的在于建立了禽流感病毒通用型rt-pcr检测方法和h5、h7、h9亚型分型检测的三重rt-pcr检测方法，最终组装成禽流感病毒(avianinfluenzavirusaiv)系列rt-pcr检测试剂盒。该试剂盒在检测过程中污染风险较高。

中国cn200410027815.5号专利用于高致病性禽流感h5、h7和h9亚型多重实时荧光rt-pcr检测的核苷酸引物、探针序列和方法；涉及高致病性禽流感h5、h7和h9核苷酸片断的rt-pcr扩增引物和探针及其互补序列，以及同时进行禽流感h5、h7和h9亚型的分型检测方法。该方法成本较高，且检测结果不能直接读出，结果观测不直观。

由于禽流感病毒具有多个亚型且变异快，疫情的发生情况又较复杂，所以迫切需要建立一种特异性好、敏感性高、准确可靠、快速简便的高致病性禽流感“一步法”分型检测方法，用于快速检测国内外主要流行的高致病性禽流感病毒亚型，从而满足进出口检验检疫和疫病监控的需要。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测的引物及试剂盒及其应用，针对当前流行的h5、h7、h9三种亚型的禽流感病毒的ha基因，经序列比对，设计了三对特异性引物，组合成禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒，可以一管检测出h5、h7、h9三种亚型的病原，从而进行禽流感亚型鉴别。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测的引物，包括3对特异性引物，分别为引物对1：h5-f和h5-r，引物对2：h7-f和h7-r，引物对3：h9-f和h9-r，其分别具有序列表seqidno.1至seqidno.6的碱基序列。

本发明针对当前流行的h5、h7、h9三种亚型的禽流感病毒的ha基因，经序列比对，设计了三对特异性引物，引物对之间序列保守，不会发生交叉反应且特异性、灵敏度高。所述的3对引物对的组合为经过大量实验比对后获得，并非简单的针对三个亚型各自的引物放在一起就可以达到本发明所述检测的目的，如果将现有的针对三个亚型各自的引物进行组合很可能会出现交叉反应导致无法获得准确的检测结果。

优选地，所述引物对1、引物对2、引物对3在rt-pcr检测的引物体系中的摩尔数配比为2:1:1。

优选地，所述引物对1：h5-f和h5-r，在所述的rt-pcr检测的引物体系中的终浓度为0.8um，所述引物对2：h7-f和h7-r在所述的rt-pcr检测的引物体系中的终浓度为0.4um，所述引物对3：h9-f和h9-r在所述的rt-pcr检测的引物体系中的终浓度为0.4um。

本发明还提供禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒，所述试剂盒由上述引物、rt-pcr反应液、混合酶液、depc水组成。所述检测试剂盒使用时同时采用反转录和pcr扩增一步法反应，扩增结束后通过琼脂糖凝胶电泳直观地得到检测结果，可以一管中简便快速的检测出h5、h7、h9三种亚型的病原，从而进行禽流感亚型鉴别

优选地，在每25ul的rt-pcr反应体系中，所述rt-pcr反应液包含2×onestepmix12.5ul，10umh5-f和h5-r引物各2ul，10umh7-f和h7-r引物各1ul，10umh9-f和h9-r引物各1ul。

优选地，在每25ul的rt-pcr反应体系中，所述混合酶液包含反转录酶0.5ul、taqdna聚合酶1ul。

所述禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒的应用，rt-pcr反应条件为：50℃反转录10min，94℃预变性3min，进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环，最后再经72℃延伸7min后结束扩增。

禽流感病毒h5、h7、h9三重rt-pcr检测试剂盒在扩增体系上使用特异性引物、逆转录和pcr反应在一管内完成。体系配比包括：3组引物、rt-pcr反应液、混合酶液、depc水；在每25ul的rt-pcr反应体系中，rt-pcr反应液每管20.5ul，包含2×onestepmix12.5ul，10umh5-f和h5-r引物各2ul，10umh7-f和h7-r引物各1ul，10umh9-f和h9-r引物各1ul；混合酶液onestepenzymemix每管1.5ul，包含反转录酶0.5ul，taqdna聚合酶1ul。在实际应用中，rt-pcr反应液中的引物组三对引物在体系中的摩尔数配比为2：1：1，引物对1中的两条引物终浓度均为0.8um，引物对2中的两条引物终浓度均为0.4um，引物对3中的两条引物终浓度均为0.4um。上述用量均可以根据实际需要扩大比例。

对待检样品进行一步法rt-pcr扩增，待检样品可以是rna。扩增程序上反转录温度在50℃，扩增10min，pcr扩增的退火温度控制在55℃为最佳，延伸时间为30s，常规35个循环即可得到很高的扩增产量。

发明人专门针对h5亚型禽流感的ha基因、h7亚型禽流感的ha基因、h9亚型禽流感的ha基因，经序列比对，ncbi-blast验证，设计了三对特异性引物，组合成h5亚型、h7亚型、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒，可以在一管中分型检测出禽流感病毒h5、h7、h9三个亚型，特异性强，敏感性好，同时采用反转录和pcr反应一步法反应，扩增结束后可以通过琼脂糖凝胶电泳简便快速直观地得到检测结果。利用本发明的引物对、试剂盒，可以检测出样品中h5亚型、h7亚型、h9亚型禽流感病毒的感染，对有效防控禽流感和切断传播途径有重要的公共卫生学意义。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)发明人针对当前流行的h5、h7、h9三种亚型的禽流感病毒的ha基因，经序列比对，设计了三对特异性引物，引物对之间序列保守，不会发生交叉反应，组合成禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒，可以一管检测出h5、h7、h9三种亚型的病原，从而进行禽流感亚型鉴别；

(2)本发明通过扩增条件优化，体系配比调试，特异性和敏感性试验，建立了禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒，特异性强，敏感性好，成本低，扩增效率高等优点；

(3)本发明使用基因特异性引物、逆转录和pcr反应在一管内完成，操作方便并降低了污染风险；

(4)本发明在引物设计上利用三种亚型的扩增片段长度的不同，扩增后的结果可以直接通过琼脂糖凝胶电泳检测判定，结果判定简便、直观、实用。

附图说明

图1为本发明建立的禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒的特异性试验结果图；其中，m：1000bpmarker；1：含h5亚型、h7亚型、h9亚型阳性片段的混合质粒；2：含h5亚型阳性片段的质粒；3：含h7亚型阳性片段的质粒；4：含h9亚型阳性片段的质粒；5：阴性对照；6-10：新城疫病毒(ndv)、禽白血病病毒(alv)、禽马立克氏病毒(mdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、传染性支气管炎病毒(ibv)。

图2为本发明建立的禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒的敏感性试验结果图；其中，m：1000bpmarker；1-11：10¹⁰copies/ul-10⁰copies/ul阳性对照；12：阴性对照。

图3为本发明建立的禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒的临床试验结果图；其中，m：1000bpmarker；1：含h5亚型、h7亚型、h9亚型阳性片段的混合质粒；2：禽流感病毒h5亚型re-8株血凝抑制试验抗原；3：禽流感病毒h7亚型血凝抑制试验抗原；4：禽流感病毒h9亚型血凝抑制试验抗原。

图4为本发明建立的禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒引物对体系配比试验结果图；m：1000bpmarker；1-5上样泳道分别是10¹⁰copies/ul-10⁶copies/ul阳性对照；其中体系一，h5：h7：h9亚型摩尔数配比为1：1：1；体系二，h5：h7：h9亚型摩尔数配比为1：1：2；体系三，h5：h7：h9亚型摩尔数配比为1：2：2；体系四，h5：h7：h9亚型摩尔数配比为2：1：1。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所使用的新城疫病毒(ndv)、禽白血病病毒(alv)、禽马立克氏病毒(mdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、传染性支气管炎病毒(ibv)由武汉科前生物分离并保存；禽流感抗原(禽流感病毒h5亚型re-8株血凝抑制试验抗原、禽流感病毒h7亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒h9亚型血凝抑制试验抗原)购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1、禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr的引物设计及检测试剂盒制备

(1)引物设计

根据genbank中现有公开的h5亚型的ha基因、h7亚型的ha基因、h9亚型的ha基因的序列对比分析，通过ncbiblast验证，设计并合成了三对特异性引物(见表1)，用于禽流感病毒h5亚型、h7亚型、h9亚型三重rt-pcr的检测。

表1引物信息

h5-f和h5-r引物对是用来检测含有禽流感病毒h5亚型病原；h7-f和h7-r引物对是用来检测含有禽流感病毒h7亚型病原；h9-f和h9-r引物对是用来检测含有禽流感病毒h9亚型病原。

(2)样本的制备

病毒rna的提取纯化参照“病毒核酸dna/rna提取试剂盒(柱提法)”或者“病毒dna/rna提取试剂盒(磁珠法)”说明书，对上述几个病原进行核酸提取。

(3)禽流感h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒的配制

对rt-pcr反应体系、引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数等进行优化，最终确定了总反应体系在25ul，引物对1h5-f和h5-r的最佳工作终浓度为0.8um，引物对2h7-f和h7-r的最佳工作终浓度为0.4um，引物对3h9-f和h9-r的最佳工作终浓度为0.4um。rt-pcr的最佳扩增程序是50℃反转录10min，94℃预变性3min，进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环，最后再经72℃延伸7min后结束扩增。

所述引物对1、引物对2、引物对3在rt-pcr检测的引物体系中的最优摩尔数配比为2:1:1。为证明上述结论，发明人在三个引物对之间体系配比试验中，针对三个引物对之间的摩尔数配比做了四种体系，如图4所示，体系一中，h5、h7、h9引物对之间摩尔数配比为1：1：1，h5、h7、h9三个亚型引物对浓度较低，都没有得到较好的扩增；体系二中，h5、h7、h9引物对之间摩尔数配比为1：1：2，h5亚型和h9亚型均没有达到较好的扩增效果；体系三中，h5、h7、h9引物对之间摩尔数配比为1：2：2，h5亚型没有得到满意的扩增量；体系四中，h5、h7、h9引物对之间摩尔数配比为2：1：1，三个亚型均有明显的扩增条带，可知体系四可以扩增到理想的效果。

一步法rt-pcr试剂(购自南京诺维赞)包括depc水，2×onestepmix、onestepenzymemix。

在每25ul的rt-pcr反应体系中，所述rt-pcr反应液具体每管20.5ul：包含2×onestepmix12.5ul，10umh5-f和h5-r引物各2ul，10umh7-f和h7-r引物各1ul，10umh9-f和h9-r引物各1ul。

在每25ul的rt-pcr反应体系中，所述混合酶液onestepenzymemix每管1.5ul，包含反转录酶0.5ul、taqdna聚合酶1ul。

在进行rt-pcr反应时，加入1pg-1ug待检核酸模板，depc水补足至25ul。

2、禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr的特异性试验

将新城疫病毒(ndv)、禽白血病病毒(alv)、禽马立克氏病毒(mdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、传染性支气管炎病毒(ibv)的rna/dna分别取3ul作为模板加入到禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒中的体系中，按照最佳扩增程序进行rt-pcr扩增，检测其特异性。

结果如图1所示，其中，m：1000bpmarker；1：含h5亚型、h7亚型、h9亚型阳性片段的混合质粒；2：含h5亚型阳性片段的质粒；3：含h7亚型阳性片段的质粒；4：含h9亚型阳性片段的质粒；5：阴性对照；6-10分别为：新城疫病毒(ndv)、禽白血病病毒(alv)、禽马立克氏病毒(mdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、传染性支气管炎病毒(ibv)。

含有h5亚型阳性片段的质粒能特异性扩增出大小在278bp左右的片段；含有h7亚型阳性片段的质粒能特异性扩增出大小在476bp左右的片段；含有h9亚型阳性片段的质粒能特异性扩增出大小在377bp左右的片段；阴性对照无任何扩增条带；其它常见禽呼吸道病毒无任何扩增条带；表明该三重rt-pcr检测试剂盒在检测h5亚型、h7亚型、h9亚型病原上特异性好。

3、禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr的敏感性试验

以含有h5亚型禽流感病毒的ha基因、h7亚型禽流感病毒的ha基因、h9亚型禽流感病毒的ha基因的混合质粒作为阳性对照，使用分光光度计测定其在280nm和260nm波长时的光吸收值(od)，按公式拷贝数/ul＝(amount(ng/ul×10^-9)×6.022×10²³)/(dnalength×660)计算1ul阳性对照的拷贝数，以10倍为梯度依次倍比稀释，以此为模板，加入到前述的三重rt-pcr反应体系中进行扩增，检测其敏感性。

经敏感性检测，结果如图2，其中，m：1000bpmarker；1-11：10¹⁰copies/ul-10⁰copies/ul阳性对照；12：阴性对照。

建立的rt-pcr方法检测h5亚型的ha基因最低检测限在10⁴copies/ul，检测h7亚型的ha基因最低检测限在10⁰copies/ul，检测h9亚型的ha基因最低检测限在10⁴copies/ul。综上结果表明禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测试剂盒在一管分型检测h5亚型、h7亚型、h9亚型病原上具有较高的灵敏度。

4、禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr的临床样品检测试验

分别提取h5亚型、h7亚型、h9亚型抗原(禽流感病毒h5亚型re-8株血凝抑制试验抗原、禽流感病毒h7亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒h9亚型血凝抑制试验抗原)的核酸，作为模板，按照最佳扩增程序加入到rt-pcr反应体系中，检测临床样本。

经检测，结果如图3，其中，m：2000bpmarker；1：含h5亚型、h7亚型、h9亚型阳性片段的混合质粒；2：禽流感病毒h5亚型re-8株血凝抑制试验抗原；3：禽流感病毒h7亚型血凝抑制试验抗原；4：禽流感病毒h9亚型血凝抑制试验抗原。

建立的三重rt-pcr方法在检测h5亚型、h7亚型、h9亚型病原试验中，检测结果直观，能够很明显的检测到h5亚型re-8株血凝抑制试验抗原的核酸，大小在278bp；h7亚型血凝抑制试验抗原的核酸，大小在476bp；h9亚型血凝抑制试验抗原的核酸，大小在377bp。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>武汉科前生物股份有限公司

<120>禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测的引物及试剂盒

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列h5-f(artificialsequence)

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<210>6

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<400>6

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