一种同时检测外泌体膜蛋白和mRNA的方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法。

背景技术：

外泌体（exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30-150nm，具有脂质双层膜结构，能很好地保护其包被的物质。这种微小膜泡中含有宿主细胞来源的特异的蛋白、核酸和脂质，能作为信号分子传递给其他细胞，是细胞之间通讯的重要媒介，可使受体细胞发生多种生物学功能的改变。所有细胞均可产生外泌体，但不同细胞分泌的外泌体组份和含量不同，选择性地将特定的基因产物装入外泌体中，通过在不同细胞之间转移生物活性分子参与受体细胞的生物学功能调节。外泌体最有用的特性之一，其含量丰富，内含物来源特异、稳定，逐渐成为细胞生物学研究的新宠。

外泌体原位捕获孔板和芯片技术是一种全新的外泌体原位捕捉与检测技术，尤以检测外泌体中的mrna和microrna，以及外泌体膜蛋白见长。其以涂附有活化的生物分子膜玻璃为载体，包被有特异识别靶基因的mrna或microrna的分子信标（自行设计）的阳离子脂质纳米颗粒，其与带负电荷的外泌体融合后，分子信标与靶标结合，特异性荧光抗体与融合体上的膜蛋白结合，在激光的激发下而产生荧光信号，被全内反射荧光(tirf，totalinternalreflectionfluorescence)显微镜检测，信号强度与相应靶标含量成正比，从而判断病程或锁定病原体。由于tirf成像具有超微，对荧光信号超敏感的特性，使得外泌体捕获孔板或芯片结合tirf成像技术，可以实现对外泌体这种纳米级囊泡的直接成像及其内含物的半定量检测。由于外泌体在各种生物样品中大量存在，且其中富含特定细胞来源的特异性核酸，因此可以通过分离其中的外泌体，运用高度灵敏的外泌体捕获孔板和芯片检测技术加以鉴定。以肿瘤细胞来源的外泌体膜蛋白pdl1及其mrna检测为例，其检测原理示意如图1所示。

该技术具有以下特征：

1、生物样品中，外泌体自身带负电荷，其包膜具有类似细胞膜的结构；

2、我们自制的包含有特异性分子信标的脂质纳米颗粒，自身带正电荷，其包膜也十分接近生物细胞膜结构；

3、在正负电荷的吸引下，外泌体极易与孔板或芯片上的纳米颗粒接触，二者随后发生膜融合，形成脂膜复合体，并很快达到电荷和体积平衡，不再融合更多的外泌体，实现原位定量捕获外泌体；

4、融合后，外泌体和纳米颗粒的内容物混合，特异性分子信标将与其靶基因mrna或microrna杂交，在激光的激发下而发出绿色荧光；

5、与此同时，外泌体原有的膜蛋白将发生重分布，但不影响其抗原性，当与特异性荧光抗体温浴后，二者将发生特异性结合，并在激光的激发下而发出橙黄色荧光；

6、这样，一个实验流程就实现了一个样品来源的外泌体膜蛋白和靶基因mrna或microrna的同步检测。

根据实验需要，外泌体捕获孔板或芯片可制作成24、48、96、384孔多种规格，每孔可包被单一或多种荧光素标记的分子信标，将多个靶基因检测通道集成在一块孔板或一张芯片上，以利于多样本高通量筛选，快捷、方便、经济，具有显著优势。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种可同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法的技术方案。

所述的一种同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法，其特征在于该方法能够对同一样品分离纯化的外泌体，分别采用荧光抗体标记外泌体膜蛋白和分子信标标记外泌体包含的靶基因mrna进行同时检测，其中分子信标标记外泌体具体采用外泌体原位捕获孔板或芯片进行检测，所述的外泌体原位捕获孔板中每孔或芯片上含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为检测靶基因mrna的特异性dna探针。

所述的一种同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法，其特征在于所述的特异性dna探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。

所述的一种同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法，其特征在于所述的特异性dna探针是根据靶基因序列自行设计并修饰合成；所述荧光抗体标记外泌体膜蛋白为荧光素标记的单克隆抗体。

所述的一种同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法，其特征在于所述的特异性dna探针由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹。

所述的外泌体特定膜蛋白的荧光抗体和外泌体靶基因mrna的特异性dna探针在检测特定样品来源的外泌体且靶标明确的科学试验中的应用。

所述的应用，其特征在于所述的特定样品包括：细胞培养上清，离体的实验动物血浆、血清，离体的人血浆、血清、尿液等体液或排泄物样品。

所述的应用，其特征在于所述的科学试验目的是从活的细胞、动物、人体体液或排泄物样品中，检测其来源的外泌体的膜蛋白和mrna。

所述的应用，其特征在于所述的用于检测外泌体特定膜蛋白的荧光抗体为荧光素标记的单克隆抗体。

所述的应用，其特征在于所述的特异性dna探针的5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰。

所述的应用，其特征在于所述的特异性dna探针是根据靶基因序列自行设计并修饰合成。本发明的技术运用了外泌体原位捕获孔板和芯片技术，同时检测特定样品来源的外泌体膜蛋白和mrna，可用于各种外泌体相关的科学实验。该技术是基于外泌体膜蛋白和mrna的新型检测技术，具有超高灵敏度、快速且特异等优点。

附图说明

图1为外泌体膜蛋白pdl1及其mrna检测为例的检测原理示意图；

图2为实施例2中pdl1膜蛋白和mrna在肺脏细胞系外泌体中的表达；

图3为实施例2中pdl1膜蛋白和mrna在肺部肿瘤外泌体中的表达；

图4为实施例2中gp73膜蛋白和mrna在肝脏细胞系外泌体中的表达；

图5为实施例2中gp73膜蛋白和mrna在肝脏肿瘤外泌体中的表达。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：特异性分子信标设计（以靶标pdl1和gp73为例）

设计检测靶基因的特异性分子信标，对于外泌体捕获孔板或芯片检测特异性核酸至关重要。为此，结合靶基因的特征，申请人设计了特殊茎环结构的分子信标，5’端茎和环与靶基因完全互补，3’端茎与5’端茎部分互补，5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰，环上部分碱基用锁核酸修饰，特异性pdl1分子信标具体序列如表1所示，seqidno.1所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰，所述seqidno.2所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.3所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22和25位碱基lna修饰和第34位碱基bhq1修饰，所述seqidno.4所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.5所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.6所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰。特异性gp73分子信标具体序列如表2所示，seqidno.1所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.2所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25、28和31位碱基lna修饰和第38位碱基bhq1修饰，所述seqidno.3所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22和25位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.4所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25、28和31位碱基lna修饰和第40位碱基bhq1修饰，所述seqidno.5所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25、28和31位碱基lna修饰和第38位碱基bhq1修饰，所述seqidno.6所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第35位碱基bhq1修饰，所述seqidno.7所示序列其碱基修饰方式为：第1位碱基6fam修饰，第10、13、16、19、22、25和28位碱基lna修饰和第36位碱基bhq1修饰。

本发明设计的特异性分子信标最大程度地提高了分子信标与靶基因结合的特异性，同时降低了反应的背景荧光强度。分子信标合成后，为了验证其与相应靶基因结合的特异性和最佳工作温度，我们设计了如下表3，根据最高信噪比选取最佳分子信标及其工作温度。

表1pdl1探针序列

表2gp73探针序列

表3

*采用荧光读板机读取其荧光强度。**采用tirf显微镜检测其荧光强度。

实施例2：检测试验（分别以靶标pdl1和gp73为例）

一、外泌体分离

1、取200ul样品（细胞培养上清，离体的实验动物血浆、血清，离体的人血浆、血清、尿液等体液或排泄物样品），室温12000×g离心30min，去除细胞和碎片；

2、转移上清至一新的ep管中，加入100ul外泌体沉淀试剂；

3、混匀，4℃孵育30min；

4、室温10,000×g离心10min；

5、吸弃上清，取100ul1×pbs重悬富含外泌体的沉淀物，4℃静置备用。

二、外泌体色谱柱纯化

1、平衡色谱柱：加100ul平衡液，9000×g离心1min；

2、上样：将100ul重悬液上柱，9000×g离心1min；

3、洗脱：加50ul洗脱液，9000×g离心3min。

三、外泌体捕获孔板检测

1、取出孔板或芯片（该孔板或芯片中每孔可包被多种荧光素标记的表1或表2所示的分子信标，该分子信标由阳离子脂质复合纳米颗粒包裹），将纯化后的外泌体洗脱液加入样品孔中；

2、将阴、阳性对照品（阴、阳性对照品是用阴离子纳米颗粒分别包裹的线虫基因片段和靶基因片段）加入后续样品孔中；

3、按体积比1:1000加入pdl1或gp73荧光抗体；

4、42℃孵育1小时；

5、用1×pbs洗板3次后，用tirf显微镜采集荧光图片；

6、用dximagev1软件分析图片，自动设置cut-off值，自动判读待测样品结果。

四、检测结果

以常见的人源的正常肝细胞系hl-7702和肝癌细胞系hepg2、正常肺脏细胞系hlf-1和肺癌细胞系a549，及肝脏和肺部良性和恶性肿瘤患者血浆样本各60例，结果如图2、3、4、5所示，外泌体捕获孔板或芯片在tirf显微镜下成像后，肺癌细胞系a549和肺脏恶性肿瘤，外泌体pdl1膜蛋白和mrna，总的荧光强度均高于正常肺脏细胞系hlf-1和肺脏良性肿瘤。而肝癌细胞系hepg2和肝脏恶性肿瘤，外泌体gp73膜蛋白和mrna，总的荧光强度均高于正常肝细胞系hl-7702和肝脏良性肿瘤，说明该技术可同时检测外泌体靶标膜蛋白和mrna。

序列表

<110>杭州迪相实业有限公司

<120>一种同时检测外泌体膜蛋白和mrna的方法

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