一种大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，具体为一种大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养试剂盒。

背景技术：

内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞(Angioblast)，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。1997年，Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞。EPCs是一群具有游走特性，能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，其功能主要为参与了出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。研究显示，EPCs在血管再生和心血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。例如，利用EPCs修复心肌梗死患者的心脏，治疗Ⅰ临床肢体缺血，治疗冠状动脉疾病，改善血管移植物的通畅率，改善糖尿病患者的血管形成能力，定向抑制肿瘤血管生成，作为基因治疗导向载体和靶细胞，等等，并为缺血性疾病的研究治疗提供了新思路，EPCs生物学特性和治疗作用的研究成为这一领域新的热点。

内皮祖细胞主要存在于骨髓、脐血和外周血等组织中，三者内皮祖细胞含量之比约为15:10:1；其中，外周血内皮祖细胞占外周血细胞比例约为0.01%，骨髓来源内皮祖细胞在骨髓中的比例仅为0.1-0.15%，含量极少。众多来源的内皮祖细胞中，骨髓来源内皮祖细胞应用相对广泛，由于骨髓采集方便、易于获取，备受实验研究人员的亲睐。目前，关于EPCs分离、培养的方法过程繁复，研究人员实验前后需要准备的试剂、耗材很多，且最终细胞得率较低；极大地耗损了实验人员的精力，并无形中延长了整个实验研究周期，给相关实验人员带来了不便。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于为了解决骨髓来源内皮祖细胞分离、培养过程中，耗时长、成本高、效率低等技术问题，本实用新型提供了一种大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养试剂盒，该试剂盒中所有试剂均为无菌，可供实验人员方便、快捷使用，大大缩短了细胞分离前期试剂配制及准备工作所消耗的时间。

为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：一种大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养试剂盒，包括盒体、试剂架和盖体，所述盒体的内部固定有试剂架，试剂架上的一侧分别设有一个组织清洗液放置区、一个细胞洗涤液放置区以及两个细胞培养液放置区，试剂架上的另一侧分别设有一个骨髓冲洗液放置区、一个细胞分离液放置区、一个红细胞裂解液放置区、一个接种包被液放置区、一个细胞消化液放置区。

优选的，所述试剂架为泡沫材料制备的支架。

优选的，所述组织清洗液放置区内放置有一个盛放100mL组织清洗液的无菌、密封塑料方瓶，且组织清洗液主要由磷酸盐缓冲液、青-链霉素组成。

优选的，所述骨髓冲洗液放置区内放置有一个盛放50mL骨髓冲洗液的无菌、密封试剂瓶，且骨髓冲洗液主要由DMEM/F12基础培养基、青-链霉素组成。

优选的，所述细胞分离液放置区内放置有一个盛放50mL细胞分离液的无菌、密封试剂瓶，且细胞分离液主要由Percoll组成。

优选的，所述红细胞裂解液放置区内放置有一个盛放50mL红细胞裂解液的无菌、密封试剂瓶，且红细胞裂解液主要由KHCO3、NH4Cl、EDTA-Na2组成。

优选地，所述接种包被液放置区内放置有一个盛放20mL接种包被液的无菌、密封试剂瓶，且接种包被液主要由纤维连接蛋白组成。

优选的，所述细胞洗涤液放置区内放置有一个盛放100mL细胞洗涤液的无菌、密封塑料方瓶，且细胞洗涤液主要由DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、青-链霉素组成。

优选的，所述细胞培养液放置区内放置与两个盛放100mL细胞培养液的无菌、密封塑料方瓶，且细胞培养液主要由无血清培养基、胎牛血清、EGF、bFGF、VEGF、IGF-1、氢化可的松、肝素、抗坏血酸、青-链霉素组成。

优选的，所述细胞消化液放置区内放置有一个盛放50mL细胞消化液的无菌、密封试剂瓶，且细胞消化液主要由胰蛋白酶、EDTA-Na2组成。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：该试剂盒提供了大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养过程中涉及到的所有试剂，并且提供了一套经过反复优化的细胞分离、培养方案，实验人员可参照优化的实验方案、使用试剂盒内的试剂简便、快速地完成大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养实验；既缩短了细胞分离前期试剂配制及准备工作所消耗的时间，又提高了最终的细胞得率、存活率及纯度，操作简便，节省人力、物力及时间，提高了实验效率。

附图说明

图1为本实用新型的内部结构示意图；

图2为本实用新型的盒体仰视示意图；

图3为本实用新型的盒盖结构示意图。

图中：1、组织清洗液放置区；2、骨髓冲洗液放置区；3、细胞分离液放置区；4、红细胞裂解液放置区；5、接种包被液放置区；6、细胞洗涤液放置区；7、细胞培养液放置区；8、细胞消化液放置区；9、盒体；10、试剂架；11、盖体。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

请参阅图1-3，本实用新型提供的一种实施例：一种大鼠骨髓来源内皮祖细胞分离、培养试剂盒，包括盒体9、试剂架10和盖体11，所述盒体9的内部固定有试剂架10，试剂架10为泡沫材料制备的支架，具备更好的弹性及缓冲性，试剂盒在运输途中遇到剧烈的晃动或震动时，可牢牢地将各试剂固定在试剂架10上，并极大地降低震荡程度，试剂架10上的一侧分别设有一个组织清洗液放置区1、一个细胞洗涤液放置区6以及两个细胞培养液放置区7，试剂架10上的另一侧分别设有一个骨髓冲洗液放置区2、一个细胞分离液放置区3、一个红细胞裂解液放置区4、一个接种包被液放置区5、一个细胞消化液放置区8，组织清洗液放置区1内放置有一个盛放100mL组织清洗液的无菌、密封塑料方瓶，且组织清洗液主要由磷酸盐缓冲液、青-链霉素组成，骨髓冲洗液放置区2内放置有一个盛放50mL骨髓冲洗液的无菌、密封试剂瓶，且骨髓冲洗液主要由DMEM/F12基础培养基、青-链霉素组成，细胞分离液3放置区内放置有一个盛放50mL细胞分离液的无菌、密封试剂瓶，且细胞分离液主要由Percoll组成，红细胞裂解液放置区4内放置有一个盛放50mL红细胞裂解液的无菌、密封试剂瓶，且红细胞裂解液主要由KHCO3、NH4Cl、EDTA-Na2组成，接种包被液放置区5内放置有一个盛放20mL接种包被液的无菌、密封试剂瓶，且接种包被液主要由纤维连接蛋白组成，细胞洗涤液放置区6内放置有一个盛放100mL细胞洗涤液的无菌、密封塑料方瓶，且细胞洗涤液主要由DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、青-链霉素组成，细胞培养液放置区7内放置与两个盛放100mL细胞培养液的无菌、密封塑料方瓶，且细胞培养液主要由无血清培养基、胎牛血清、EGF、bFGF、VEGF、IGF-1、氢化可的松、肝素、抗坏血酸、青-链霉素组成，细胞消化液放置8区内放置有一个盛放50mL细胞消化液的无菌、密封试剂瓶，且细胞消化液主要由胰蛋白酶、EDTA-Na2组成。

工作原理：1、将SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，置于75%乙醇中浸泡5min，全身消毒。在无菌条件下，剪开下肢皮肤剔除小腿、大腿、股部肌肉，暴露股骨、胫骨；取另一把无菌剪刀剪开髋关节、膝关节，将股骨及胫骨剪下，放入无菌玻璃培养皿中，倒入10mL组织清洗液。

进一步除去骨头表面的肌肉、骨膜等，用4℃预冷的组织清洗液冲洗骨头表面2-3次；冲洗完成后，用无菌骨剪剪掉骨头两端，用一次性注射器抽取10-15mL骨髓冲洗液将骨髓冲出，用1mL移液器反复吹打，制成单细胞悬液。

加入适量细胞洗涤液，1600rpm离心5min，弃上清，再加入适量细胞洗涤液重悬细胞沉淀，重复上述离心操作2次；将细胞沉淀用5mL细胞洗涤液重悬，备用。

在15mL无菌离心管中，沿管壁依次加入5mL细胞分离液和上述备用细胞悬液，缓慢放入离心机，1600rpm室温离心15min，吸取细胞分离液和细胞悬液界面处的白色环状云雾细胞层(即单个核细胞层)。加入等体积细胞洗涤液，混匀，1600rpm离心5min，弃上清。

用5mL红细胞裂解液(4)重悬细胞沉淀，混匀，置于37℃水浴摇床中温浴5min；随后加入等体积细胞洗涤液，混匀，1600rpm离心5min，弃上清。

将细胞沉淀重悬于5mL细胞培养液（含EGF、bFGF、VEGF、IGF-1、Heparin、Hydrocortisone、FBS等）中，制成单细胞悬液。

用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞最终接种浓度为(1.0-2.0)×10⁶/mL，接种至事先用1-2mL接种包被液处理过的T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置培养。

原代培养过程中，24h换液，收集悬液中未贴壁的细胞，用适量细胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置培养；72h后全量更换培养基，以后每2d半量更换新鲜培养基。待细胞铺满培养瓶底至细胞融合成单层时，用细胞消化液按照1:2的传代比进行消化、传代培养。

对于本领域技术人员而言，显然本实用新型不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本实用新型的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本实用新型。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本实用新型的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本实用新型内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。