三维细胞培养板的制作方法

本实用新型涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种三维细胞培养板。

背景技术：

3D类器官是一种让细胞形成微组织的体外培养技术，其形态和功能与生理状态下更加类似，自2009年由荷兰Hans Clevers实验室首先培养出小肠类器官的绒毛和隐窝结构以来，已广泛应用到各正常组织和肿瘤的体外长期培养。但目前通用的类器官培养方法需要添加支架介质将细胞包埋，如基底膜抽提物，培养成本较高，且来源于小鼠肉瘤，用于再生医学有一定安全风险，因此以滴细胞培养方法为主的3D细胞培养方法快速发展，但目前悬滴的形成多采用手工法，即先将细胞悬液滴在平板(如细胞培养皿的盖，由塑料或玻璃材料制成)上，然后小心反转，使液滴面向下，液滴借重力下垂，这种操作需要经验丰富否则反转过程中液滴会彼此融合。

此外，由于体外培养的细胞需要理想的气体环境，氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时不能生存。CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关，一般要把细胞置于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中，而采用悬滴法使细胞悬液直接悬空附着在孔下方，处于完全裸露状态，在培养或者转移过程中容易被污染，若直接在悬滴下方放置标准的96孔板，悬滴所处的空间几乎接近于密封盖合，使得细胞的生长环境容易出现低氧以及二氧化碳低于细胞生长所需的浓度要求，造成细胞生长速度慢，严重会出现细胞大范围损伤，为实验研究带来严重的损失。另外，由于实验的培养数量要求，目前已有的培养孔通常为96孔，甚至384孔或1536孔，如此挨个孔单独添加细胞悬液非常耗时，降低了实验效率。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种无需反转即可形成悬滴、能为细胞生长提供足够的氧气且能提高细胞悬液添加效率的三维细胞培养板以解决现有技术的不足。

为达此目的，本实用新型采用以下技术方案：

一种三维细胞培养板，包括生长板、储液板以及覆盖在所述生长板顶部的盖板，所述生长板上均匀设有穿透所述生长板且包括上孔和下孔的培养孔，一个所述上孔的底部通过连接管与至少两个下孔连通，所述连接管的孔径为所述上孔入口处孔径的1/4-1/5，所述下孔出口处的孔径小于或等于所述上孔的孔径，所述生长板底部的四个边缘分别设有凸出于所述下孔所在平面的凸板，所述储液板顶部的四个边缘设有与所述凸板相卡合的凹槽,所述生长板底部靠近所述下孔出口的边缘涂有亲水涂层或疏水涂层。

上述技术方案中，生长板上均匀设有穿透生长板且包括上孔和下孔的培养孔，有利于细胞悬液的悬滴生成避免贴壁；生长板底部的凸板与储液板顶部的凹槽相卡合合叠放更加方便快捷同时使摆放平稳有利于细胞的生长；而通过在下孔出口的边缘处涂覆亲水涂层或疏水涂层可以调整悬滴的大小和形状。

进一步地，所述上孔的开口上宽下窄且两侧壁均呈圆弧状，所述下孔上窄下宽且侧壁均呈圆弧状，所述连接管包括至少两根支管，所述下孔的数量与所述支管的数量相等。上孔和下孔的两侧壁均成圆弧状有利于提高表面张力，使悬滴更容易悬挂在下孔的底部而不掉落，而支管将上孔与两个、三个或四个下孔同时连通，由上孔添加一次细胞悬液即可同时在下孔下方形成多个悬滴，大大提高了细胞悬液的添加效率。

进一步地，所述生长板底部的至少两个相对的所述凸板在与所述下孔的出口相对处设有若干贯穿所述凸板的透气孔。由此，通过凸板上的透气孔可以为悬滴提供细胞生长所需要的氧和二氧化碳，同时在相对凸板上设置透气孔可以使空气流动性更好，进一步提高细胞培养的成活率。

进一步地，所述凸板外侧连有侧挡板，所述侧挡板左右侧两侧分别设有悬挂孔，所述生长板侧面设有与所述悬挂孔相配合的悬挂柱。由此，将侧挡板放下能避免在取出培养板或者在培养箱外进行实验时细胞被污染，同时在培养箱中时可以将侧挡板通过悬挂孔悬挂在生长板上的悬挂柱，保证细胞在生长过程中有充足的氧和二氧化碳。

进一步地，所述储液板上均匀开设有与所述下孔相对呈半圆弧槽的储液孔。由此，通过储液孔尺寸的调整可以限制悬滴的大小，同时对细胞培养为多细胞球状体后，用微量加样器可以将悬滴吹落到储液孔中用于后续的实验。

进一步地，所述连接管的长度为0-20mm，所述支管与所述生长板所在水平面的夹角为5-10°，设置为倾斜角度可以加快细胞悬液由上孔流入各个下孔的速度，提高细胞悬液添加效率。

进一步地，所述凸板的高度为所述下孔直径的0.5-1.2倍。由此，使悬滴处于一个完全隔离的空间，下部不与储液孔接触，最大程度地使细胞生长时的环境与体内环境相符。

进一步地，所述生长板上的所述上孔的数量为6孔、24孔、48孔或96孔，所述下孔的数量为6孔、24孔、48孔、96孔384孔或1536孔。

进一步地，所述生长板顶部设有与所述上孔对应的凸台，由此，在取放培养板的过程中凸台可以避免流出的细胞悬液由一个培养孔进入另一个培养孔，使不同培养孔中的细胞悬液交叉污染。

本实用新型提供的三维细胞培养板，具有以下有益效果：

1、培养孔包括侧壁均呈圆弧状的上孔和下孔，增加大了表面张力，使悬滴很容易直接在下孔下方形成，细胞在悬空的悬滴内生成更接近体内环境，无需要使用支架介质且无需经过反转使液滴面向下，降低了培养成本，避免了使用基底膜抽提物潜在的风险，同时提高了实验的重复性和可操作性；

2、培养孔的上孔通过多根支管与多个下孔连接，不管是人工挨个孔单独添加或是使用含12个分配头的加液装置可立刻将48个下孔添加好细胞悬液形成48个悬滴，大大提高了细胞悬液的添加效率；

3、下孔处下孔出口的边缘涂有亲水涂层或疏水涂层，可防止加液坠滴并控制悬滴的形状或大小；

4、生长板底部设有带透气孔的凸板，确保了下孔处形成悬滴的隔离空间可以获得充足的细胞生长所需要的氧和二氧化碳，提高了细胞培养的成活率；同时凸板外设有侧挡板，即能避免在取出培养板或者在培养箱外进行实验时细胞被污染，同时在培养箱中时可以将侧挡板打开保证细胞在生长过程中有充足的氧和二氧化碳。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例的技术方案，下面将对本实用新型实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本实用新型三维细胞培养板一种实施方式的立体结构示意图；

图2为图1中生长板的剖面示意图；

图3为图1的俯视图；

图中：

1、盖板；2、生长板；21、凸板；22、凸台；23、透气孔；24、侧挡板；25、悬挂孔；26、悬挂柱；27、底板；28、顶板；3、储液板；31、凹槽；32、储液孔；4、培养孔；41、上孔；42、下孔；421、第一下孔；422、第二下孔；5、亲水涂层；6、疏水涂层；7、支管；71、第一支管；72、第二支管；8、悬滴。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案。

其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制；为了更好地说明本实用新型的实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

本实用新型实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本实用新型的描述中，需要理解的是，若出现术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

如图1和图2所示，一种三维细胞培养板，包括生长板2、储液板3以及覆盖在生长板1顶部的盖板1，生长板2上均匀设有穿透生长板2且包括上孔41和下孔42的培养孔，上孔41和下孔42的开口分别位于生长板2的顶板28和底板27上，一个上孔41的底部通过连接管与至少两个下孔42连通，连接管的孔径为上孔41入口处孔径的1/4-1/5，下孔42出口处的孔径小于上孔41的孔径，也可以等于上孔41的孔径，生长板2底部的四个边缘分别设有凸出于下孔42凸板21，即凸板21凸出生长板2的底板27，凸板21的高度为下孔42直径的0.5-1.2倍以确保生长板2叠放在储液板3上方时悬滴8不会与储液板3贴壁而处于一个隔离培养区。同时，储液板3顶部的四个边缘设有与凸板21相卡合的凹槽31，生长板2顶部设有与上孔41对应突出顶板28的凸台22；而为了控制下孔42底部形成的悬滴8形状和大小，储液板3上均匀开设有与下孔42相对呈半圆弧槽的储液孔32，并且生长板2底部靠近下孔42出口的边缘涂有亲水涂层5，也可以根据需要涂覆疏水涂层6，而储液孔32中还可以盛装一些细胞悬液使悬滴8所在的三维空间内外渗透压保持平衡，避免因悬滴8蒸发过快而引起细胞生长过程中养分不足。

其中，生长板2底部的四个凸板21在与下孔42的出口相对处设有若干贯穿凸板21的透气孔23，也可以仅在相对的两块凸板21上开设透气孔23，透气孔23正对着悬空在下孔42底部的悬滴8且透气孔23所覆盖的区域大于悬滴8所形成的三维空间体积，且四块凸板21两两相对设置，因此使由透气孔23进来的空气流动性更好，使生长板2下方的每个悬滴8四周都被空气包围可以直接与空气接触，保证了细胞生长过程中对氧气和二氧化碳的需求；同时，凸板21外侧连有侧挡板24，侧挡板24铰接在凸板21外且可以绕轴旋转，侧挡板24左右侧两侧分别设有悬挂孔25，生长板2侧面设有与悬挂孔25相配合的悬挂柱26，当取拿培养板于外界进行实验时将侧挡板24放下以免对细胞悬液造成污染，当需要在培养箱对细胞进行培养时将侧挡板24通过悬挂孔25和悬挂柱26悬挂起来，使空气仍然能通过凸板21上的透气孔23进入悬滴8中为细胞生长提供足够的氧气和二氧化碳。

此外，上孔41的开口上宽下窄且两侧壁均呈圆弧状，下孔42上窄下宽且侧壁均呈圆弧状，连接管包括四根支管7，也可以将支管7设为两根或三根，下孔42的数量与支管7的数量相等。如图3所示，生长板2上的上孔41的数量为12孔、上孔41位于四个邻近下孔42的中间，上孔41通过第一支管71和第二支管72分别与第一排的第一下孔421和第二下孔422连接，同样地，上孔41通过另外两个支管7与下一排中与第一下孔421和第二下孔422相对设置的两个下孔42连接，即每个上孔41通过四根支管7分别与邻近的四个下孔42连通，下孔42为48孔，上孔41的数量也可以设为96孔，下孔42数量为1536孔，上孔41的数量还可以设为6孔、24孔、48孔或384孔，下孔42的数量为12孔、24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔。

此外，连接管的长度为0-20mm，支管7与生长板2所在水平面的夹角为5-10°。

使用本实用新型提供的三维细胞培养板时，先将如48孔的储液板3放在实验平台上，再将生长板2的凸板21沿储液板3上的凹槽31插入使生长板2平稳叠放在储液板3上，然后将由细胞与类器官培养基混合成适宜密度的细胞悬液通过移液枪分别加入生长板2的上孔41中，细胞悬液由上孔41经支管7分别进入各个下孔42中，并在重力和表面张力的作用下于下孔42的底部形成悬滴8，然后将盖板1盖在生长板2上方，并将生长板2四周的侧挡板24放下将整个培养板转移至培箱中，此时将侧挡板24打开悬挂在悬挂柱26上，使悬滴8在生长过程能有足够的氧气和二氧化碳由凸板21上的透气孔23进入；3天后，可观察到细胞长成多细胞球体状，此时用微量加样器将悬滴8吹落到储液板3的储液孔32中以进行后续操作。

需要声明的是，上述具体实施方式仅为本实用新型的较佳实施例及所运用技术原理，在本实用新型所公开的技术范围内，任何熟悉本技术领域的技术人员所容易想到的变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围内。