通过检测镁离子诊断耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种试剂盒，在判断样品是否感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，能够利用染料化合物通过肉眼确认在环介导的等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)中产生的二价镁离子(mg2+)浓度的变化，以此简单地确定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的感染与否。
背景技术：
：最近，在生物诊断领域，一种能够在没有昂贵设备的情况下进行快速现场测试的诊断系统即当场即时检测(pointofcaretest,poct)市场正在迅速发展，并且现有基因测试和分子诊断试剂盒开发出很多适用于新平台的内容，以具有这种市场竞争力。目前主要使用的诊断方法包括细菌培养鉴定方法、pcr和碱基序列分析方法，以及直接测量细菌的poct。然而，根据检测，有些以诊断实验室为中心需要高级设备和大量人力。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)是主要引起伤口感染、肺炎和败血症等医院获得性感染的细菌。mrsa主要由meca基因产生青霉素结合蛋白的改变(alteredpenicillinbindingprotein,pbp2a,pbp2’),因此对青霉素(penicillin)、头孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯(carbapenem)等所有β-内酰胺类(β-lactam)抗生素具有耐药性,甚至对其他类型的抗生素如大环内酯(macrolide)、克林霉素(clindamycin)、四环素(tetracycline)和氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside)具有抗性，是多种耐药性细菌，为了选择合适的抗菌药物和管理医院获得性感染，需要准确、快速的细菌鉴定和抗生素敏感试验。mrsa的准确鉴定包括使用dna探针(dnaprobe)或聚合酶链反应(pcr：polymerasechainreaction)直接检测meca基因的分子生物学测试方法和使用免疫印迹法(immunoblotting)或免疫放射分析法(irma：immunoradiometricassay)检测meca基因的产物即pbp2a的方法等，但是诸如特殊设备、昂贵的试剂、复杂的测试记录和测试时间等条件使其不适合在普通实验室常规使用，而传统抗生素敏感检测法因为孵育时间单独需要24小时并且根据培养基的类型和培养条件显示抗性表达的差异，因此很难期望快速和准确的结果。在使用直接测量这些细菌的poct方法的情况下，存在的问题是高成本和测试结果的灵敏度和准确性未达到可靠水平。最近，为了克服该问题，已经提出了一种适用于使用环介导的等温扩增(lamp：loop-mediatedisothermalamplification)进行病原体检测的技术。现有技术中的聚合酶链反应(pcr)需要三个温度变化：变性(denaturation)、退火(annealing)和延伸(extension)。然而，在环介导的等温扩增(lamp)中，由于dna扩增反应在一个温度下发生，因此不像聚合酶链反应那样需要单独的特殊机器(pcr机器)。在环介导的等温扩增(lamp)中，由于靶核酸可在60至65℃下在1小时内扩增至109拷贝，因此可仅使用约64至65℃的恒温保持装置就可以进行测量，测试时间短至30至60分钟，可肉眼进行观察，并且不需要购买昂贵设备和掌握操作设备所需的专业知识，因此可简单且容易地扩增dna。该方法基于通过具有强链置换活性(stranddisplacementactivity)的dna聚合酶(dnapolymerase)的自旋环链置换(autocyclingstranddisplacement)dna合成，因为反应在等温条件下发生,实验本身非常简单，因为没有温度变化的时间损失，扩增效率非常高。因此，在使用等温扩增的诊断方法的情况下，即使非常少量的dna，在短时间内其合成效率也比一般pcr更高，因此可用作直接检测dna或在dna扩增后检测副产物的诊断试剂盒。同时，镁离子(mg2+)是细胞中存在最丰富的二价金属离子，已知其参与数百种酶的调节并且作为dna合成的重要因子,在诸如细胞增殖、死亡的许多细胞过程中起关键作用。为了检测这些细胞内的镁离子，已经提出了使用配备有各种可透过细胞的荧光体和单光子或双光子荧光探针的共焦显微镜进行检测的方法。然而，上述方法存在的问题是仅使用昂贵的设备才可以进行检测。因此，需要开发一种可以肉眼观察的高灵敏度镁离子指示剂(magnesiumionindicator)，这样它不仅可以用于诊断试剂盒，而且可以用于与镁有关的细胞实验外的其他研究。本发明提供了在一种感染人类并引起各种疾病的细菌即mrsa(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)的诊断中通过染料化合物的颜色变化检测镁离子浓度变化的方法，该方法提供了一种试剂盒，通过使用环介导的等温扩增(lamp)，即使存在微量的dna，也能够高效地检测mrsa并且可通过肉眼确认。技术实现要素：【技术课题】本发明的目的在于提供用于检测一种感染人类并引起各种疾病的细菌即mrsa(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)的试剂盒。为了能够检测mrsa细菌，本发明开发出通过肉眼可确认镁离子浓度变化的新型染料化合物。本发明要解决的第一个课题是提供能够肉眼确认镁离子存在的用于检测镁离子的染料化合物。本发明要解决的第二个课题是提供利用所述用于检测镁离子的染料化合物的镁离子量化方法。本发明要解决的第三个课题是提供一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒能够在使用环介导的等温扩增(lamp)方法扩增dna时使用所述用于检测镁离子的染料化合物来确认dna扩增。此外，本发明中开发的用于检测mrsa细菌的试剂盒是通过染料化合物的颜色变化检测镁离子浓度变化以此检测细菌感染与否的试剂盒，可以使用所有一般的lamp引物如通过分子生物学方法检测mrsa的试剂盒中所使用的meca基因的引物等。【现行技术文献】韩国注册专利第10-0858560号韩国注册专利第10-1552159号韩国注册专利第10-1329316号yoshikimisawa等。2007年，应用环介导等温扩增技术快速直接检测血培养中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。jinfectchemother，13：134-14(yoshikimisawaetal.2007,applicationofloop-mediatedisothermalamplificationtechniquetorapidanddirectdetectionofmethicillin-resistantstaphylococcusaureusinbloodcultures.jinfectchemother,13:134-14)【技术解决方法】为了解决所述课题，本发明提供由以下[化学式1]表示的用于检测镁离子的染料化合物。[化学式1]在所述化学式1中，r1和r2选自氢、羟基和氨基(-nh2)，r1或r2是羟基，其中若所述r1是羟基，则所述r2是氢或氨基；若所述r2是羟基，则所述r1是氨基；r3是氢；r4选自氢，-nhra和磺酸基，其中所述ra选自氢、c1-6烷基和苯基；r5和r6为氢或磺酸基，若r5和r6中的任何一个是磺酸基，则另一个是氢；ar是苯基或萘基，其中1至3个所述苯基或萘基的氢被选自羟基、硝基、磺酸基和卤素的取代基取代，并且所述苯基或萘基的取代基中至少一个是羟基，所述至少一个羟基取代2位碳；所述磺酸基是磺酸(-so3h)或磺酸钠盐(-so3na)。在根据本发明的用于检测镁离子的染料化合物中，为了与镁离子反应并显示颜色，所述[化学式1]的萘基应包括一个羟基，优选r1和r2中的任何一个应为羟基。所述r1或r2是羟基，这对于在与镁离子反应中产生与原始颜色不同的颜色起到主要作用。在本发明中，r3是h,这对于改善根据本发明的染料化合物的溶解度是重要的。当r3被诸如胺的取代基取代时，水溶性不是很好并且与不容易与镁离子反应。在本发明中，r4选自氢、-nhra和磺酸基，并且可以优选为-nhra或磺酸基，更优选-nhra。当所述r4是-nhra或磺酸基时，对于以互补色显色是有效的。本文中，所述ra可选自氢、c1-c6烷基和苯基，优选氢或苯基。在本发明中，r5和r6中的任何一个可以是磺酸基，另一个可以是氢。优选地，r5是磺酸基并且r6是氢，使其可以有效地与镁离子反应以互补色显色。在本发明中，[化学式1]的母核中的ar是苯基或萘基，所述苯基或萘基可以具有1至3个取代基。这里，优选所述ar(苯基或萘基)的2位碳被羟基取代，更优选地，所述[化学式1]可以由以下[化学式1a]表示。[化学式1a]在[化学式1a]中，r1、r2、r3、r4、r5和r6与所述[化学式1]中所示的相同，并且r7和r8彼此相同或不同并且可以各自独立地选自氢、硝基、羟基、卤素和磺酸基。根据本发明，所述r7和r8可以彼此相同或不同，所述r7和r8中的至少一个可以是选自硝基、羟基和磺酸基中的任何一种，并且优选地，r7和r8中的至少一个是硝基，以此可以通过与镁离子反应以明显可区分的颜色或互补色显色。根据本发明的[化学式1]表示的化合物与镁离子反应，以与镁离子反应之前不同的波长移动，并且根据偏移波长的位置和强度产生颜色差异。另外，根据化合物的取代基而存在波长移动差异，因此产生不同的颜色。此外，由于根据本发明的[化学式1]的化合物在没有镁离子的情况下根据ph的变化而未显色，或者产生与镁离子反应产生的颜色不同的颜色，从而不受ph变化的影响，因此无需调节ph值，使用较为容易，并且可以应用于无法调节ph的样品以检测样品中包含的镁离子，并且可以通过肉眼观察如比色法或吸光光度法进行检测，因此对产业应用是有利的。根据本发明的由所述[化学式1]表示的化合物具体可以是例如由以下[化学式2]至[化学式10]表示的化合物，但不限于此。[化学式2][化学式3][化学式4][化学式5][化学式6][化学式7][化学式8][化学式9][化学式10]化合物dkls根据本发明的所述[化学式1]的化合物可以在1mm至200mm的镁离子存在下显色，并且根据取代基的不同，存在可检测的镁离子的临界浓度差异和显色的差异。例如，所述[化学式4]的化合物即使在浓度为3mm或更低的镁离子存在下也可以显色，而其它化合物在镁离子浓度小于8mm时不会显色。由于显示的颜色和可检测的临界浓度根据化合物的取代基而不同，因此可以通过使用具有不同临界浓度的多种染料化合物以肉眼量化待检测样品中含有的镁离子的量。本发明提供一种镁离子检测试剂盒，其包含所述[化学式1]的染料化合物。所述检测试剂盒若仅用于确认镁离子的浓度，即使仅含有一种染料化合物可也充分进行检测。另一方面，若使用含有多种具有可检测不同的镁离子临界浓度的染料化合物的试剂盒，则可以量化待检测样品中包含的镁离子。根据本发明的通过肉眼量化镁离子的存在的方法，包括将2至9种选自所述化学式2至10表示的化合物的染料化合物投入待检测样品并使其反应的步骤；及确认颜色变化的步骤。本发明还提供了一种诊断试剂盒，其包含由所述[化学式7]表示的染料化合物，可肉眼检测dna扩增。特别地，本发明提供了用于检查利用环介导的等温扩增(lamp)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的dna扩增的试剂盒。在现有技术中，不可能通过肉眼确认dna扩增。通过将mrsadna添加到含有根据本发明的所述[化学式7]的化合物的环介导的等温扩增(lamp)反应溶液中并使其反应，可以在不使用检测机器的情况下通过颜色变化肉眼确认dna扩增。【发明的效果】根据本发明的用于检测镁离子的染料化合物对温度和ph的变化是稳定的并且仅在镁离子存在下显色(变色)，因此可以通过肉眼容易地检测和量化镁离子。特别地，根据本发明的染料化合物响应于在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的利用该环介导的等温扩增(lamp)的dna扩增过程中产生的镁离子浓度的变化而显色。因此，可以将染料化合物用作肉眼检测诊断试剂，以确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的dna扩增。另外，可以通过与在不同临界浓度显色的染料化合物反应并确认显色与否，来用肉眼量化镁离子的含量。附图说明图1显示了对本发明中使用的9种化合物的溶解度和对镁离子的灵敏度的评价结果；图2显示了本发明化合物对通过环介导的等温扩增(lamp)的mrsa的存在显色的评价结果；图中，p表示阳性对照(positivecontrol)，n表示阴性对照(negativecontrol)；图3显示了通过电泳确认mrsadna扩增的结果；图中，p表示阳性对照(positivecontrol)，n表示阴性对照(negativecontrol)；图4显示了本发明化合物对通过环介导的等温扩增(lamp)的mrsadna的灵敏度的评价结果；图中，nc表示阴性对照(negativecontrol)；图5显示了化学式7的化合物对mrsadna的显色的评价结果；图中，nc表示阴性对照(negativecontrol)；图6显示了根据本发明的方法检测mrsa和使用以往相关技术中的pcr反应检测mrsa的灵敏度确认结果。具体实施方式耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)是主要引起伤口感染、肺炎和败血症等医院获得性感染的细菌。mrsa主要由meca基因产生青霉素结合蛋白的改变(alteredpenicillinbindingprotein,pbp2a,pbp2’),因此对青霉素(penicillin)、头孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯(carbapenem)等所有β-内酰胺类(β-lactam)抗生素具有耐药性,甚至对其他类型的抗生素如大环内酯(macrolide)、克林霉素(clindamycin)、四环素(tetracycline)和氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside)也具有抗药性，是多种耐药性细菌，为了选择合适的抗菌药物和管理医院获得性感染，需要准确而快速的细菌鉴定和抗生素敏感试验。mrsa的准确鉴定包括使用dna探针(dnaprobe)或聚合酶链反应(pcr：polymerasechainreaction)直接检测meca基因的分子生物学测试方法和使用免疫印迹法(immunoblotting)或免疫放射分析法(irma：immunoradiometricassay)检测meca基因的产物即pbp2a的方法等，但是诸如特殊设备、昂贵的试剂、复杂的测试记录和测试时间等条件使其不适合在普通实验室常规使用，而传统抗生素敏感检测法因为孵育时间单独需要24小时并且根据培养基的类型和培养条件显示抗性表达的差异，因此很难期望快速和准确的结果。因此，本发明为了检测所述mrsa细菌提供了一种通过染料化合物检测镁离子浓度变化来肉眼辨别mrsa感染与否和扩增过程的方法，与传统技术相比具有所需成本和时间显著降低的重要优点。此外，本发明使用环介导等温扩增(lamp)而不使用pcr方法来扩增mrsa的基因，使得基因的扩增时间非常短。用于检测镁离子的传统染料存在许多问题，如仅在预定的ph条件下才会对镁显色(变色)，并且当温度或ph条件改变时，即使在不存在镁离子的情况下也会显示与镁存在时相同的颜色，因此可靠性降低，并且存在每次检测都需要控制ph的不便等。因此，本发明的发明人开发了同时对温度和ph的变化稳定并能够肉眼确认镁离子存在的一种染料化合物，以及在不同的镁离子浓度范围内显色的染料化合物，从而完成本发明。下面将参考本发明的实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例不应被解释为限制本发明的范围，本文提供这些描述是为了帮助理解本发明。合成实施例1.化学式2的化合物的制备将2-氨基-4-硝基苯酚(2-amino-4-nitrophenol)(0.385g，2.50mmol，1当量)分散在5.8ml蒸馏水中。加入0.75g盐酸(35％)后，加入冰将温度降至0℃。加入0.19g亚硝酸钠(sodiumnitrite)并在5℃或更低的温度下搅拌1小时，然后加入0.019g氨基磺酸(sulfamicacid)并搅拌3分钟。将4-羟基萘-1-磺酸(4-hydroxynaphthalene-1-sulfonicacid)(0.58g，2.59mmol，1.04当量)加入到9ml蒸馏水中后，将混合物调节至ph10并充分溶解，然后加入到反应溶液中，在ph10及10℃或更低的温度下搅拌2小时。通过过滤反应溶液获得的物质通过硅胶柱色谱法纯化，得到纯化合物(128mg，13.2％)。rf＝0.4(rp-c18，乙腈/水1：2v/v)maldi-tof/ms，计算值c16h11n3o7s389.34，测量值388.11。合成实施例2.化学式3的化合物的制备将2-氨基-5-硝基苯酚(2-amino-5-nitrophenol)(0.385g，2.50mmol，1当量)分散在5.8ml蒸馏水中。加入0.75g盐酸(35％)后，加入冰将温度降至0℃。加入0.19g亚硝酸钠(sodiumnitrite)并在5℃或更低的温度下搅拌1小时，然后加入0.019g氨基磺酸(sulfamicacid)并搅拌3分钟。将7-氨基-4-羟基萘-2-磺酸(7-amino-4-hydroxynaphthaloene-2-sulfonicacid)(0.628g，2.62mmol，1.05当量)加入到9.4ml蒸馏水中并充分溶解，然后将该混合物加入到反应溶液中并在10℃或更低温度下搅拌2小时。通过过滤反应溶液获得的物质通过硅胶柱色谱法纯化，得到纯化合物(13mg，1.3％)。rf＝0.3(rp-c18，乙腈/水1：2v/v)lc/ms，计算值c16h12n4o7s404.35，测量值403.0。合成实施例3.化学式4的化合物的制备将2-氨基-4,6-二硝基苯酚(2-amino-4,6-dinitrophenol)(0.498g，2.50mmol，1当量)分散在7.4ml蒸馏水中。加入0.75g盐酸(35％)后，加入冰将温度降至0℃。加入0.19g亚硝酸钠(sodiumnitrite)并在5℃或更低的温度下搅拌1小时，然后向其中加入0.019g氨基磺酸(sulfamicacid)并搅拌3分钟。将4-羟基-7-(苯氨基)萘-2-磺酸(4-hydroxy-7-(phenylamino)naphthalene-2-sulfonicacid)(0.817g，2.62mmol，1.05当量)加入到12.4ml蒸馏水中并充分溶解，然后将该混合物加入到反应溶液中并在10℃或更低温度下搅拌2小时。通过过滤反应溶液获得的物质通过硅胶柱色谱法纯化，得到纯化合物(45mg，3.4％)。rf＝0.4(rp-c18，乙腈/水1：2v/v)lc/ms，计算值c22h15n5o9s525.45，测量值523.9。合成实施例4至8：化学式5至9的化合物的制备采用与合成实施例1至3类似的方法合成。合成实施例4.化学式5的化合物的制备(70mg，0.7％)rf＝0.2(rp-c18，乙腈/水1：2v/v)lc/ms，计算值c16h15n5o7s421.38，测定值419.0。合成实施例5.化学式6的化合物的制备(200mg,22.5％)rf＝0.5(rp-c18,乙腈/水1:2v/v)lc/ms,计算值c12h9n3o8s355.28,测量值350.9。合成实施例6.化学式7的化合物的制备(40mg,2.9％)rf＝0.8(rp-c18,乙腈/水1:2v/v)lc/ms,计算值c22h16n4o10s2560.51.,测量值561.1。合成实施例7.化学式8的化合物的制备(35mg,4.0％)rf＝0.2(rp-c18,乙腈/水1:2v/v)lc/ms,计算值c16h10n4o6354.27,测量值352.9。合成实施例8.化学式9的化合物的制备(110mg,9.4％)rf＝0.7(rp-c18,乙腈/水1:2v/v)lc/ms,计算值c16h10n3nao10s2491.38,测量值489.8。合成实施例9.化学式10的化合物dkls的制备将2-氨基-4-硝基苯酚-6-磺酸(2-amino-4-nitrophenol-6-sulfonicacid)(0.5g，2.14mmol，1当量)分散在7.4ml蒸馏水中。加入0.75g盐酸(35％)后，加入冰将温度降至0℃。加入0.19g亚硝酸钠(sodiumnitrite)并在5℃或更低的温度下搅拌1小时，然后加入0.019g氨基磺酸(sulfamicacid)并搅拌3分钟。将4-(苯甲酰氨基)-5-羟基萘-1,7-二磺酸(4-(benzamido)-5-hydroxynaphthalene-1,7-disulfonicacid)(0.949g，2.24mmol，1.05当量)加入到12.4ml蒸馏水中并充分溶解，然后将该混合物加入到反应溶液中并搅拌在10℃或更低温度下保持2小时。通过过滤反应溶液获得的物质通过硅胶柱色谱法纯化，得到纯化合物(64mg，4.5％)。rf＝0.5(rp-c18,乙腈/水1:2v/v)lc/ms,计算值c24h16n4o14s3668.59,测量值667.0。在下文中，将使用具体实施例描述利用所述染料化合物检查镁离子的存在以监测通过环介导的等温扩增(lamp)的mrsa细菌扩增过程的方法。显然，本发明的适用范围不限于以下实施例。<染料化合物的选择>1)候选物质的合成通过化合物库筛选出对镁离子显色的化合物，根据筛选的化合物合成了70种候选化合物，通过溶解度和光谱分析选择候选物质，并根据所选化合物的结构进一步建模，最终获得如化学式2至9的化合物和dkls等9种类型的化合物。2)溶解度测试测量在水中的溶解度以确认合成的候选化合物的溶解度。具体地，将10mg羟基萘蓝(hnb)(作为对照组，是已知对镁离子显色的化合物)和10mg每种候选化合物溶解在1ml的3次蒸馏水中，然后确认溶解度。确认了70种候选化合物中的所述9种化合物和羟基萘蓝溶解在水中。确认结果，9种化合物在水中显示出优异的溶解性。<显色特性的评价>1)溶液的制备通过将0.9521g氯化镁溶解在50ml的3次蒸馏水中制备200mm氯化镁溶液。将59.99mg磷酸二氢钠和70.98mg磷酸氢二钠溶于50ml的3次蒸馏水中以制备10mm磷酸钠缓冲溶液，然后混合28.85ml磷酸二氢钠溶液和21.15ml磷酸氢二钠溶液以制备ph7的磷酸钠缓冲溶液。以类似的方式，将两种溶液混合以制备分别具有ph4、ph7、ph9和ph11的磷酸钠缓冲溶液。为了确定显色，hnb和候选物质以240μm的浓度制备并用于测试。2)样品的制备通过溶解度试验选择的羟基萘蓝(hnb)和9种水溶性候选物质用蒸馏水稀释，以分别制备浓度为240μm的样品。3)镁离子检测特性和ph稳定性的评价确认了根据本发明的候选物质是否与镁离子反应以显色(变色)。此外，根据候选物质是否通过仅与镁离子反应而不管ph变化而特异性显色来确认ph稳定性。使用96孔板(96wellplate)(12×6孔)，在空白、mgcl2溶液、ph4、ph7、ph9和ph11的条件下确认对照组(hnb)和35种候选物质的显色。具体地，在板的第一行中加入100μl的3次蒸馏水(空白)，在第二行中加入100μl的mgcl2溶液，在第三至第六行中分别加入利用在所述a)中制备的10mm磷酸钠缓冲溶液的ph为ph4、ph7、ph9、ph11的溶液各100μl。在板的列中，将分别以240μm浓度制备的100μl样品加入6行，对总共36个样品进行筛选。每孔中含有的mgcl2溶液的最终浓度为100mm，样品的最终浓度为120μm。每个样品在3次蒸馏水(空白)中显示出固有的颜色，并且确认了在200mmmgcl2存在下显色(变色)的9种化合物。特别是，化学式3和化合物4的化合物在镁离子存在下,显示出与空白区有明显区别的互补色，并且在ph变化时，显示出与在镁离子存在下的显色不同的其他颜色，结果证实ph稳定性优异。化学式3的化合物在没有镁离子的情况下显色为橙色或紫色，但仅在镁存在下显色为深蓝色。化学式4的化合物在不存在镁离子的情况下显色为红色，但仅在镁存在下显色为深紫色，即显示出明显的差异。另一方面，化学式2的化合物在中性至碱性条件下显示出与镁离子存在时明显不同的颜色，因此被评价为具有与对照组hnb相似的特性。另一方面，羟基萘蓝(hnb)是在镁离子存在下显色的代表性彩色显影剂，但在没有镁离子的情况下，在ph7至ph11的酸性范围内也会显色(变色)成与镁离子存在时相似的颜色。因此，已证实羟基萘蓝存在的问题是，为了检测镁离子，要将样品控制为酸性，优选在ph4附近，这是不方便的，并且可靠性降低。通过所述试验，证实化学式3和4的化合物仅在镁离子存在下以特定波长显色而不受ph变化的影响，是对镁离子的检测特别有效的染料化合物。4)评价温度稳定性确认根据本发明的候选物质是否根据温度具有颜色变化。将步骤2)中制备的100μl样品(hnb和35种候选物质)和100μl的3次蒸馏水加入1.5ml管中(最终体积为200μl，最终样品浓度为120μm)。在室温下充分稀释后，拍摄显色状态，将混合物在80℃下温育12小时，然后观察颜色变化。试验结果，根据本发明的样品不受温度的影响，颜色保持不变。5)摩尔吸光系数的评价将hnb和9种候选物质溶解在3次蒸馏水中以制备100μg/ml的储备液，然后用3次蒸馏水稀释以制备50、25和12.5μg/ml的样品。接下来，使用分析仪uv-vis光谱仪(spectrometer，agilent8453)获得吸收光谱，然后测量浓度为10mg/ml的吸收系数值并示于下表1中。表1顺序化合物摩尔吸光系数1hnb13,0002化学式212,0003化学式344,0004化学式431,0005化学式533,5796化学式618,0007化学式725,0008化学式85,1179化学式923,000如表1所示，证实化学式3的化合物具有44,000的最高摩尔吸光系数，具有比hnb高3.38倍的吸收系数，化学式4的化合物具有31,000的吸收系数，比hnb高2.38倍，因此被评价为有产业利用价值。<镁离子灵敏度的评价>1)浓度小于10mm的镁离子灵敏度的评价通过评价，选择化学式2、3和4的化合物作为用于检测镁离子的优异染料化合物。评价了所选择的4种化合物和hnb的镁离子检测灵敏度。将氯化镁溶解在3次蒸馏水中并分别稀释至8、10、12、14和16mm，以制备样品。接下来，作为染料化合物，制备hnb和化学式2的化合物，浓度为240μm，但化学式3和4的化合物稀释50％以120μm的浓度制备，因为所述化合物的摩尔吸光系数是对照组(hnb)的两倍。在96孔板的每一行中，填充1ml染料化合物，并在每个列中填充1ml稀释的氯化镁溶液，然后观察颜色变化并测量吸光度。96孔板中氯化镁的最终浓度分别为0、4、5、6、7和8mm，hnb和化学式2的最终浓度分别为120μmm，化学式3和4的最终浓度分别为60μm。化学式3的化合物检测出稀释至4mm的极低浓度的氯化镁溶液中所含的镁离子，显示出互补色，对镁离子的灵敏度非常优异。因此容易检测出少量镁离子，产业利用价值非常高。观察到根据本发明的化学式3表示的染料化合物，吸收光谱通过镁离子从500nm偏移到640nm。另外，由于相对于镁离子浓度的吸光度变化显着，因此可以通过吸光度评价定量地计算测量样品中所包含的镁。2)浓度为10mm或更高的镁离子灵敏度评价为了评价在镁离子浓度小于10mm时没有变色的hnb、化学式2和4的镁离子灵敏度，在10mm或更高的浓度下以相同的方式进行进一步测试。确认96孔板中的镁浓度为10mm至100mm的情况，染料化合物的最终浓度设定为120μm。hnb在10mm或更高浓度下开始显色，在20至30mm下显色为紫色，并在40mm或更高时显色为深蓝色，化学式2的化合物在浓度为100mm或更高时，紫色显色为显著的鲜红色，化学式4的化合物在浓度为10mm时从红紫色显色为紫色，在20mm左右的浓度下显色为蓝紫色。如所述实验，根据本发明的化合物通过与镁离子反应并使吸收光谱移动而变色(显色)，并且镁离子的最低检测浓度根据化合物的结构而不同。因此，可以利用根据本发明的具有不同的镁离子最低检测浓度的化合物处理待测样品，并且通过确认所述样品的显色与否和显色的颜色，肉眼确认样品中所包含的镁离子浓度。实施例1：筛选用于构成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)检测试剂盒的化合物在本实施例中，选择meca基因作为检测mrsa的靶基因，制备下表2中所示的meca基因的6个引物。表2.mrsa引物序列1)根据溶解度测试和镁灵敏度筛选化合物将由所述化学式1表示的各种显色染料溶解在蒸馏水(d.w)中，测试溶解度以选择具有高溶解度的化合物。将所选化合物在各浓度(100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm和3.13μm)下稀释，并测试各浓度对镁(镁浓度为100mm、10mm)的反应灵敏度。作为试验的结果，筛选出在d.w中具有高溶解度并且与镁敏感反应的9种类型的化合物。图1显示了所选择的9种化合物(化学式2至9和dkls)。2)使用环介导的等温扩增(lamp：loop-mediatedisothermalamplification)检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)针对9种类型的化合物，利用环介导的等温扩增(lamp)进行mrsa检测。环介导的等温扩增(lamp)在63℃反应30分钟后，在80℃下酶促失活循环5分钟，反应总共35分钟。在lamp之后，如图2所示，在4种化合物(化学式3、4、6和8)中，没有观察到变化，并且在5种类型的化合物(化学式2、5、7、9以及dkls)中，观察到显色变化。确认5种化合物(化学式2、5、7、9以及dkls)可使用环介导的等温扩增(lamp)进行mrsa检测。在确认化合物的显色变化后，为了确认准确的mrsa扩增，使用dna电泳法确认mrsa的扩增。如图3所示，证实在阳性对照(positivecontrol)中进行了mrsa扩增，在阴性对照(negativecontrol)中，未进行mrsa扩增。证实没有显色变化的化合物，也进行了mrsa扩增，只是没有显色变化。3)利用环介导的等温扩增(lamp：loop-mediatedisothermalamplification)检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)的灵敏度测试。使用环介导的等温扩增(lamp)进行所选择的5种化合物的灵敏度测试。将mrsadna稀释10倍，以10pg、1pg、100fg和10fg的浓度制备，然后使用环介导的等温扩增(lamp)进行灵敏度测试。此时，5种化合物的浓度彼此相同。如图4所示，所有5种化合物都能检测到1pg为止的dna，并且化学式5的化合物能够检测到100fg为止的dna。4)筛选构成试剂盒的显色染料基于实施例1的试验结果，最终筛选出用于构成mrsa检测试剂盒的化合物。化学式5的化合物能够检测到100fg为止的mrsa，但是确认存在由于颜色变化引起肉眼观察时引发检测误差的问题。因此，选择化学式7的化合物，其具有明显的颜色变化容易肉眼检测并且可以检测到1pg的mrsa。实施例2：检测灵敏度的比较验证1)对利用环介导的等温扩增(lamp：loop-mediatedisothermalamplification)检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：methicillin-resistantstaphylococcusaureus)的灵敏度进行比较验证。通过比较本发明中构成试剂盒的mrsa引物和论文中的引物(yoshikimisawa等。2007年，应用环介导等温扩增技术快速直接检测血培养中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。jinfectchemother.13：134-14)(yoshikimisawaetal.2007.applicationofloop-mediatedisothermalamplificationtechniquetorapidanddirectdetectionofmethicillin-resistantstaphylococcusaureusinbloodcultures.jinfectchemother.13:134-14)来验证构成试剂盒的引物的优异性。使用所选化学式7的化合物，将mrsadna稀释10倍，分别以1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg的浓度制备，利用环介导的等温扩增(lamp)反应完成对比验证。如图5所示，构成试剂盒的mrsa引物能够检测到1pg的mrsadna。相反，在论文中报告的两种类型的mrsa引物，通过引物1检测到1ng为止的mrsadna，通过引物2检测到100pg为止的mrsadna。另外，进行了与现有技术中的pcr方法的比较验证。通过与论文中公开的引物(duartec.oliveira和herminiadelencastre.2002。用于快速鉴定结构类型的多重pcr策略和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的mec元素的变体，antimicrobagentschemother.46(7)：2155-61)(duartec.oliveiraandherminiadelencastre.2002.multiplexpcrstrategyforrapididentificationofstructuraltypesandvariantsofthemecelementinmethicillin-resistantstaphylococcusaureus.antimicrobagentschemother.46(7):2155-61)和pcr方法比较，来验证本发明的优异性。将mrsadna稀释10倍，制成浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg，在pcr方法和环介导的等温扩增(lamp)中加入相同的量进行反应。作为测试结果，在使用本发明的mrsa检测方法中，总共所需时间约为35分钟，并且能够检测到1pg为止的mrsa。相反，当使用以往技术中的pcr方法时，总共所需时间为约2小时，并且能够检测到100pg为止的mrsa，结果证实了本发明的试剂盒能够比现有技术更有效地确认mrsa感染，结果如图6所示。产业应用可能性本发明可应用于产业。当前第1页12