本公开总体上涉及植物分子生物学领域，包括植物的遗传操作。更具体地，本公开涉及用于产生转化植物的快速、高效方法。相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月12日提交的美国临时专利申请序列号62/641,725和2018年3月12日提交的美国临时专利申请序列号62/641,733的权益，它们各自通过引用以其整体并入本文。经由efs-web以文本文件提交的序列表的引用该序列表的官方副本经由efs-web作为ascii格式的序列表以电子方式提交，文件名为20190309_7486wopct_seqlist.txt，创建于2019年3月9日，且具有803,180字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ascii格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
背景技术：
：：使用标准转化和再生方案既耗时又低效，并且对转基因产品的开发时间表产生负面影响，假定通常存在季节性限制的“优先开发窗口”来基于初步研究期间获得的结果决定哪些基因构建物优先用于大规模田间工作。可用的标准转化和再生方法具有多个缺点，这些缺点限制了生产和筛选转基因植物的速度和效率。例如，许多标准转化和再生方法需要使用高水平的生长素或细胞分裂素，并且需要涉及胚性愈伤组织形成或器官发生的步骤，导致在转化后在植物在温室环境中生长之前需要数周的程序。仍然需要使用多种起始组织类型在多个近交系中产生显著更高的转化频率和显著更高质量事件(包含一个拷贝的性状基因表达盒而没有载体(质粒)骨架的事件)的转化方法，所述近交系包括代表一系列遗传多样性并具有重要商业用途的转化近交系。技术实现要素：本公开包括用于产生包含一个拷贝的性状基因的转基因事件的方法和组合物。在另一方面，本公开提供了通过本文公开的方法产生的植物的种子。一方面，本公开提供了一种产生具有一个拷贝的性状基因表达盒的转基因植物的方法，该方法包括：将植物细胞与含有性状基因表达盒的t-dna和含有形态发生基因表达盒的t-dna接触；选择含有性状基因表达盒且不含形态发生基因表达盒的植物细胞；以及从植物细胞再生转基因植物。在另一方面，接触包括将植物细胞与第一细菌菌株中含有性状基因表达盒的t-dna和第二细菌菌株中含有形态发生基因表达盒的t-dna同时接触。在又另一方面，接触包括使植物细胞与一种含有质粒的细菌菌株接触，所述质粒包含t-dna内的性状基因表达盒和t-dna外的形态发生基因表达盒。在又另一方面，接触包括将植物细胞与一种细菌菌株中含有性状基因表达盒的t-dna和含有形态发生基因表达盒的t-dna接触。在另一方面，形态发生基因表达盒包含：(i)编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列；或(ii)编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9。在另一方面，核苷酸序列编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码babyboom(bbm)多肽的核苷酸序列选自bbm2、bmn2和bmn3，或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽和babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9，并且babyboom(bbm)多肽选自bbm2、bmn2和bmn3或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，性状基因表达盒包含：选自赋予害虫抗性的基因、赋予除草剂抗性的基因、赋予胁迫耐受性的基因、赋予抗旱性的基因、赋予氮利用效率(nue)的基因、赋予抗病性的基因和赋予改变代谢途径能力的基因的组的性状基因。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株是相同的细菌菌株。在另一方面，相同的细菌菌株是选自卸甲农杆菌(disarmedagrobacteria)、苍白杆菌属细菌(ochrobactrumbacteria)和根瘤菌科细菌(rhizobiaceaebacteria)的组的根瘤菌目(rhizobiales)。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在又另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株是不同的细菌菌株。在另一方面，不同的细菌菌株选自：(i)卸甲农杆菌和苍白杆菌属细菌；(ii)卸甲农杆菌和根瘤菌科细菌；和(iii)根瘤菌科细菌和苍白杆菌属细菌。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以50∶50的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以75∶25的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以90∶10的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以95∶5的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以99∶1的比例存在。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自表4或表5的启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的hbstart3启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的泛素启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽lec1基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含病毒或植物增强子序列。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽bbm基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽repa基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与pklamirna融合体可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，提供了包含性状基因表达盒的植物种子。在一方面，本公开提供了一种产生具有一个拷贝的性状基因表达盒和一个拷贝的选择标记表达盒的转基因植物的方法，其包括：使植物细胞与含有质粒的细菌菌株接触，所述质粒包含具有侧接性状基因表达盒和选择标记表达盒的右边界和左边界的t-dna，和在t-dna之外的阻遏基因表达盒，其中所述选择标记表达盒包含被阻遏基因表达的阻遏多肽阻遏的启动子；选择含有性状基因表达盒和选择标记表达盒而不含阻遏基因表达盒的植物细胞；以及从植物细胞再生转基因植物。在另一方面，阻遏基因表达盒包含编码四环素阻遏物(tetr)、胺苯磺隆阻遏物(esr)、氯磺隆阻遏物(csr)和具有靶向t-dna中启动子的指导rna的阻遏物-dcas9融合体的核苷酸序列。在另一方面，核苷酸序列编码阻遏与t-dna中选择标记可操作地连接的启动子的四环素阻遏物(tetr)。在另一方面，核苷酸序列编码阻遏与t-dna中选择标记可操作地连接的启动子的胺苯磺隆阻遏物(esr)。在另一方面，核苷酸序列编码阻遏与t-dna中选择标记可操作地连接的启动子的氯磺隆阻遏物(csr)。在另一方面，核苷酸序列编码具有阻遏与t-dna中选择标记可操作地连接的启动子的指导rna的阻遏物-dcas9融合体。在另一方面，性状基因表达盒包含：选自赋予害虫抗性的基因、赋予除草剂抗性的基因、赋予胁迫耐受性的基因、赋予抗旱性的基因、赋予氮利用效率(nue)的基因、赋予抗病性的基因和赋予改变代谢途径能力的基因的组的性状基因。在另一方面，细菌菌株是选自卸甲农杆菌、苍白杆菌属细菌或根瘤菌科细菌的组的根瘤菌目。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在另一方面，提供了包含性状基因表达盒的植物种子。一方面，本公开提供了一种产生具有一个拷贝的性状基因表达盒的转基因植物的方法，该方法包括：将植物细胞与第一细菌菌株中含有性状基因表达盒的t-dna和第二细菌菌株中含有形态发生基因表达盒的t-dna同时接触；其中形态发生基因表达盒包含：(i)编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列；或(ii)编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；其中性状基因表达盒包含：选自赋予害虫抗性的基因、赋予除草剂抗性的基因、赋予胁迫耐受性的基因、赋予抗旱性的基因、赋予氮利用效率(nue)的基因、赋予抗病性的基因和赋予改变代谢途径能力的基因的组的性状基因；选择含有性状基因表达盒且不含形态发生基因表达盒的植物细胞；以及从植物细胞再生转基因植物。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9。在另一方面，核苷酸序列编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码babyboom(bbm)多肽的核苷酸序列选自bbm2、bmn2和bmn3，或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽和babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9，并且babyboom(bbm)多肽选自bbm2、bmn2和bmn3或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株是相同的细菌菌株。在另一方面，相同的细菌菌株是选自卸甲农杆菌、苍白杆菌属细菌和根瘤菌科细菌的组的根瘤菌目。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株是不同的细菌菌株。在另一方面，不同的细菌菌株选自：(i)卸甲农杆菌和苍白杆菌属细菌；(ii)卸甲农杆菌和根瘤菌科细菌；和(iii)根瘤菌科细菌和苍白杆菌属细菌。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以50∶50的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以75∶25的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以90∶10的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以95∶5的比例存在。在另一方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以99∶1的比例存在。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自表4或表5的启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的hbstart3启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的泛素启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽lec1基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含病毒或植物增强子序列。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽bbm基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽repa基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与pklamirna融合体可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，提供了包含性状基因表达盒的植物种子。一方面，本公开提供了一种产生具有一个拷贝的性状基因表达盒的转基因植物的方法，该方法包括：将植物细胞与一种含有质粒的细菌菌株接触，所述质粒包含t-dna内的性状基因表达盒和t-dna外的形态发生基因表达盒；其中形态发生基因表达盒包含：(i)编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列；或(ii)编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；其中性状基因表达盒包含：选自赋予害虫抗性的基因、赋予除草剂抗性的基因、赋予胁迫耐受性的基因、赋予抗旱性的基因、赋予氮利用效率(nue)的基因、赋予抗病性的基因和赋予改变代谢途径能力的基因的组的性状基因；选择含有性状基因表达盒且不含形态发生基因表达盒的植物细胞；以及从植物细胞再生转基因植物。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9。在另一方面，核苷酸序列编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码babyboom(bbm)多肽的核苷酸序列选自bbm2、bmn2和bmn3，或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽和babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9，并且babyboom(bbm)多肽选自bbm2、bmn2和bmn3或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，细菌菌株是选自卸甲农杆菌、苍白杆菌属细菌和根瘤菌科细菌的组的根瘤菌目。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自表4或表5的启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的hbstart3启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的泛素启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽lec1基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含病毒或植物增强子序列。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽bbm基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽repa基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与pklamirna融合体可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，提供了包含性状基因表达盒的植物种子。一方面，本公开提供了一种产生具有一个拷贝的性状基因表达盒的转基因植物的方法，该方法包括：将植物细胞与一种细菌菌株接触，所述细菌菌株包含含有性状基因表达盒的t-dna和含有形态发生基因表达盒的t-dna；其中形态发生基因表达盒包含：(i)编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列；或(ii)编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；其中性状基因表达盒包含：选自赋予害虫抗性的基因、赋予除草剂抗性的基因、赋予胁迫耐受性的基因、赋予抗旱性的基因、赋予氮利用效率(nue)的基因、赋予抗病性的基因和赋予改变代谢途径能力的基因的组的性状基因；选择含有性状基因表达盒且不含形态发生基因表达盒的植物细胞；以及从植物细胞再生转基因植物。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9。在另一方面，核苷酸序列编码babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码babyboom(bbm)多肽的核苷酸序列选自bbm2、bmn2和bmn3，或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，核苷酸序列编码wus/wox同源盒多肽和babyboom(bbm)多肽或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽。在另一方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列选自wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5和wox9，并且babyboom(bbm)多肽选自bbm2、bmn2和bmn3或胚珠发育蛋白2(odp2)多肽是odp2。在另一方面，一种细菌菌株是选自卸甲农杆菌、苍白杆菌属细菌和根瘤菌科细菌的组的根瘤菌目。在另一方面，卸甲农杆菌选自agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-的组。在另一方面，苍白杆菌属细菌选自表2。在另一方面，根瘤菌科细菌选自表3。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自表4或表5的启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的hbstart3启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的泛素启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与lec1基因可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽lec1基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒进一步包含病毒或植物增强子序列。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽bbm基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子，所述wus基因与t2a病毒肽repa基因融合体融合。在另一方面，形态发生基因表达盒包含与wus基因可操作地连接的pltp启动子和与pklamirna融合体可操作地连接的pltp启动子。在另一方面，提供了包含性状基因表达盒的植物种子。附图说明图1显示了如实例11中进一步描述的质粒php81718(wus处理)和php80728(tag-rfp处理)的体细胞胚形成的效率。具体实施方式将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。所公开的方法所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所公开的许多修改和其他方面具有以下描述和相关附图中呈现的传授的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所公开的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了具体的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。本文所用的术语仅是为了描述具体方面的目的并且不旨在限制。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由……组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求中，将参考本文中所定义的若干术语。本公开包括使用形态发生基因产生转基因植物的方法。如本文所用，术语“形态发生基因”是指基因，所述基因当异位表达时刺激可产生植物的体细胞衍生结构的形成。更精确地，形态发生基因的异位表达刺激了可以产生植物的体细胞胚或器官发生结构(例如芽分生组织)的从头形成。这种刺激的从头形成发生在表达形态发生基因的细胞中或在邻近的细胞中。形态发生基因可以是调节其他基因表达的转录因子，也可以是影响植物组织中激素水平的基因，两者均可刺激形态发生变化。如本文所用，术语“形态发生因子”是指形态发生基因和/或由形态发生基因表达的蛋白质。形态发生基因涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合，如wus/wox基因(wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5或wox9)，参见美国专利7,348,468和7,256,322及美国专利申请公开号2017/0121722和2007/0271628，其全文通过引用并入文中；laux等人(1996)development[发育]122：87-96；以及mayer等人(1998)cell[细胞]95：805-815；vandergraaff等人，2009，genomebiology[基因组生物学]10：248；dolzblasz等人，2016，mol.plant[分子植物学]19：1028-39。预期wus/wox的调节可调节植物和/或植物组织表型，包括植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合。拟南芥wus的表达可以在营养组织中诱导干细胞，其可以分化为体细胞胚(zuo，等人(2002)plantj[植物杂志]30：349-359)。在这方面也有意义的是myb118基因(参见美国专利7,148,402)、myb115基因(参见wang等人(2008)cellresearch[细胞研究]224-235)、babyboom基因(bbm；参见boutilier等人(2002)plantcell[植物细胞]14：1737-1749)或clavata基因(例如，参见美国专利7,179,963)。wus/wox同源盒多肽的形态发生多核苷酸序列和氨基酸序列可用于所公开的方法。wuschel蛋白(以下称为wus)在含有多能干细胞池的顶端分生组织的起始和维持中起关键作用(endrizzi等人，(1996)plantjournal[植物杂志]10：967-979；laux等人，(1996)development[发育]122：87-96；以及mayer等人，(1998)cell[细胞]95：805-815)。wus基因的拟南芥植物突变体含有被错误指定并且似乎经历分化的干细胞。wus编码一种可能作为转录调节剂的新型同源结构域蛋白(mayer等人，(1998)cell[细胞]95：805-815)。拟南芥芽分生组织的干细胞群体被认为通过促进器官起始的clavata(clv)基因与干细胞特性所需的wus基因之间的调节环来维持，其中clv基因在转录水平上阻遏wus，并且wus表达足以诱导分生组织细胞特性和干细胞标记clv3的表达(brand等人，(2000)science[科学]289：617-619；schoof等人，(2000)cell[细胞]100：635-644)。wus在拟南芥中的组成型表达已显示可导致叶片的不定芽增殖(植物内)(laux，t.，talkpresentedatthexviinternationalbotanicalcongressmeeting[在第十六届国际植物大会上发表的演讲]，1999年8月1-7日，密苏里州圣路易斯(st.louis，mo.))。在一方面，可用于本公开的方法的wus/wox同源盒多肽是wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5、wox5a或wox9多肽(参见，美国专利7,348,468和7,256,322以及美国专利申请公开号2017/0121722和2007/0271628，其全文通过引用并入文中以及vandergraaff等人，2009，genomebiology[基因组生物学]10：248)。可用于本公开的方法的wus/wox同源盒多肽可获自或衍生自本文所述的任何植物。下表1中列出了可用于本公开的方法的其他wus/wox基因。表1.可用于本公开的其他形态发生基因包括但不限于lec1(其全文通过引用并入文中的美国专利6,825,397，lotan等人，1998，cell[细胞]93：1195-1205)、lec2(stone等人，2008，pnas105：3151-3156；belide等人，2013，plantcelltiss.organcult[植物细胞组织器官培养]113：543-553)、kn1/stm(sinha等人，1993.genesdev7：787-795)、来自农杆菌的ipt基因(ebinumaandkomamine，2001，invitrocell.devbiol-plant[体外细胞发育生物学-植物]37：103-113)、monopteros-delta(ckurshumova等人，2014，newphytol.[新植物学家]204：556-566)、农杆菌av-6b基因(wabiko和minemura1996，plantphysiol.[植物生理学]112：939-951)、农杆菌iaa--h和iaa-m基因的组合(endo等人，2002，plantcellrep.[植物细胞报告]，20：923-928)、拟南芥serk基因(hecht等人，2001，plantphysiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥agl15基因(harding等人，2003，plantphysiol.[植物生理学]133：653-663)、fusca基因(castle和meinke，plantcell[植物细胞]6：25-41)和pickle基因(ogas等人，1999，pnas96：13839-13844)。如本文所用，术语“表达盒”是指由编码和非编码序列组成的载体dna的独特组分，所述编码和非编码序列包括在转化/转染细胞中控制表达的5′和3′调节序列。如本文所用，术语“编码序列”是指由编码蛋白质的氨基酸的起始密码子和终止密码子界定的dna序列部分。如本文所用，术语“非编码序列”是指进行转录以产生信使rna但不编码蛋白质的氨基酸的dna序列部分，例如5’非翻译区，内含子和3’非翻译区。非编码序列也可以指rna分子，例如微rna、干扰rna或rna发夹，其当表达时可以下调内源基因或其他转基因的表达。如本文所用，术语“调控序列”是指能够增加或减少基因表达的核酸分子区段。调控序列包括启动子、终止子、增强子元件、沉默元件、5’utr和3’utr(非翻译区)。如本文所用，术语“agro1”是指携带质粒的农杆菌，所述质粒具有含有“性状基因”表达盒的t-dna。如本文所用，术语“agro2”是指携带质粒的农杆菌，所述质粒具有含有“形态发生基因”表达盒的t-dna，表达基因例如但不限于bbm和/或wus2。如本文所用，术语“转移盒”是指t-dna，其包含侧翼为右边界和左边界的一个或多个表达盒。如本文所用，t-dna是指插入宿主植物细胞的基因组中的ti质粒的一部分。如本文所用，术语“选择标记”是指当在转化/转染细胞中表达时赋予对选择剂如抗生素、除草剂和对未转化/未转染细胞有毒的其他化合物的抗性的转基因。如本文所用，术语“ear”是指乙烯应答元件结合因子相关的两亲性抑制基序，其具有作为转录因子内转录抑制信号的llxlxl、dnlxxp、lxlxpp、r/klfgv或tlllfr的一般共有序列。在dna结合蛋白(例如转录因子、dcas9或lexa(作为实例))上添加ear型阻遏元件，赋予融合蛋白转录阻遏功能(kagale，s.，和rozwadowski，k.2010.plantsignalingandbehavior[植物信号与行为]5：691-694)。如本文所用，术语“转录因子”意指通过与启动子的dna序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(也是形态发生基因)的实例包括ap2/erebp家族的成员(包括bbm(odp2)、多血(plethora)和aintegumenta亚家族、caat-盒结合蛋白(如lec1和hap3)以及myb的成员、bhlh、nac、mads、bzip和wrky家族。胚珠发育蛋白2(odp2)多肽以及相关多肽如babyboom(bbm)蛋白家族蛋白的形态发生多核苷酸序列和氨基酸序列可用于本公开的方法。在一方面，包含两个ap2-dna结合结构域的多肽是odp2、bbm2、bmn2或bmn3多肽，参见美国专利申请公开号2017/0121722，其通过引用整体并入本文。可用于本公开的方法的odp2多肽包含两个预测的apetala2(ap2)结构域，并且是ap2蛋白家族(pfam登录号pf00847)的成员。推定转录因子的ap2家族已显示出调节广泛的发育过程，并且家族成员的特征是存在ap2dna结合结构域。预测该保守核心形成结合dna的两亲性α螺旋。ap2结构域首先在apetala2中鉴定出，apetala2是一种调节分生组织身份、花器官规格、种皮发育和花同源异型基因表达的拟南芥蛋白。现在已经在多种蛋白质中发现了ap2结构域。可用于本公开的方法的odp2多肽与ap2家族内的几种多肽具有同源性，例如参见通过引用整体并入本文的us8420893的图1，提供了玉蜀黍和水稻odp2多肽与具有两个ap2结构域的其他八个蛋白质的比对。在图1中还提供了在us8420893的比对中出现的所有蛋白质的共有序列。可用于本公开方法的包含两个ap2-dna结合结构域的多肽可获自或衍生自本文所述的任何植物。在一方面，可用于本公开方法的包含两个ap2-dna结合结构域的多肽是odp2多肽。在一方面，可用于本公开方法的包含两个ap2-dna结合结构域的多肽是bbm2多肽。可用于本公开方法的odp2多肽和bbm2多肽可获自或衍生自本文所述的任何植物。可以将形态发生基因稳定地掺入植物的基因组中或可以瞬时表达。在一方面，控制形态发生基因的表达。受控表达可以是特定时期内形态发生基因的脉冲表达。替代地，形态发生基因可以仅在某些转化细胞中表达而在其他细胞中不表达。可以通过下文公开的多种方法来控制形态发生基因的表达。可用于本公开方法的形态发生基因可获自或衍生自本文所述的任何植物物种。术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、未成熟的子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生愈伤组织、分生组织、体细胞分生组织、器官发生性愈伤组织、原生质体、衍生自成熟的穗衍生种子的胚、叶基、成熟植物的叶、叶尖、未成熟花序、穗、未成熟穗、长须、子叶、未成熟子叶、胚轴、分生组织区域、愈伤组织、叶细胞、茎细胞、根细胞、芽细胞、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的培养中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。籽粒意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，其条件是这些子代、变体和突变体包含引入的多核苷酸。本公开可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。单子叶植物包括但不限于大麦，玉蜀黍(玉米)、粟(例如，珍珠粟(蜡烛稗)、猪粟(黍稷(panicummiliaceum))、狐尾粟(粟米(setariaitalica))、龙山粟(龙爪稷(eleusinecoracana))、画眉草(埃塞俄比亚画眉草(eragrostistef))、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种，高粱，黑小麦属或小麦，或叶和茎作物，包括但不限于竹子、滨草、草地早熟禾、芦苇、黑麦草、甘蔗；草坪草(lawngrass)，观赏草以及其他草如柳枝稷和草皮草。可替代地，本公开中使用的双子叶植物包括但不限于羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、花生、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥或棉花。目的植物物种的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)，芸苔属物种(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(medicagosativa))，稻(rice，oryzasativa)，黑麦(rye，secalecereale)，高粱(甜高粱(sorghumbicolor)，高粱(sorghumvulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(pennisetumglaucum))，黍(粟米(panicummiliaceum))，粟(谷子(setariaitalica))，穇子(龙爪稷(eleusinecoracana)))，向日葵(sunflower，helianthusannuus)，红花(safflower，carthamustinctorius)，小麦(wheat，triticumaestivum)，大豆(soybean，glycinemax)，烟草(tobacco，nicotianatabacum)，马铃薯(potato，solanumtuberosum)，花生(peanut，arachishypogaea)，棉花(海岛棉(gossypiumbarbadense)、陆地棉(gossypiumhirsutum))，甘薯(番薯(ipomoeabatatas))，木薯(cassava，manihotesculenta)，咖啡(咖啡属物种(coffeaspp.))，椰子(coconut，cocosnucifera)，菠萝(pineapple，ananascomosus)，柑橘树(柑橘属物种(citrusspp.))，可可(cocoa，theobromacacao)，茶树(tea，camelliasinensis)，香蕉(芭蔗属物种(musaspp.))，鳄梨(avocado，perseaamericana)，无花果(fig或(ficuscasica))，番石榴(guava，psidiumguajava)，芒果(mango，mangiferaindica)，橄榄(olive，oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(caricapapaya))，腰果(cashew，anacardiumoccidentale)，澳洲坚果(macadamia，macadamiaintegrifolia)，巴旦杏(almond，prunusamygdalus)，甜菜(sugarbeets，betavulgaris)，甘蔗(甘蔗属物种(saccharumspp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。本公开可以使用高等植物，例如被子植物和裸子植物的纲。适用于本公开的合适物种的植物可以来自爵床科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、棕榈科、菊科、小檗科、胭脂树科、十字花科、凤梨科、大麻科、石竹科、三尖杉科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、古柯科、大戟科、豆科、唇形科、亚麻科、石松科、锦葵科、黑药花科、芭蕉科、桃金娘科、蓝果树科、罂粟科、松科、车前科、禾本科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、无患子科、茄科、紫杉科、山茶科和葡萄科。可以在本公开的方法中使用来自以下属的成员的植物：秋葵属、冷杉属、槭属、剪股颖属、葱属、六出花属、凤梨属、穿心莲属、须芒草属、蒿属、芦竹属、颠茄属、小檗属、甜菜属、红木属、芸苔属、金盏花属、山茶属、喜树属、大麻属、辣椒属、红花属、长春花属、三尖杉属、菊属、金鸡纳属、西瓜属、咖啡属、秋水仙属、锦紫苏属、黄瓜属、南瓜属、狗牙根属、曼陀罗属、石竹属、洋地黄属、薯蓣属、油棕属、麻黄属、蔗茅属、古柯属、桉属、羊茅属、草莓属、雪花莲属、大豆属、棉属、向日葵属、橡胶树属、大麦属、莨菪属、麻风树属、莴苣属、亚麻属、毒麦属、羽扇豆属、番茄属、石松属、木薯属、苜蓿属、薄荷属、芒属、芭蕉属、烟草属、稻属、黍属、罂粟属、银胶菊属、狼尾草属、矮牵牛属、虉草属、梯牧草属、松属、早熟禾属、一品红属、杨属、萝芙木属、蓖麻属、蔷薇属、甘蔗属、柳属、血根草属、赛茛菪属、黑麦属、茄属、高粱属、米草属、菠菜属、菊蒿属、红豆杉属、可可属、小黑麦属、小麦属、北美穗草属、藜芦属、蔓长春花属、葡萄属和玉蜀黍属。对于农业、园艺、生物质生产(用于生产液体燃料分子和其他化学物质)和/或林业重要或有意义的植物可以用于本公开的方法中。非限制性实例包括例如柳枝稷(panicumvirgatum)(风倾草(switchgrass))、巨芒(miscanthusgiganteus)(芒草(miscanthus))、甘蔗属物种(saccharumspp.)(唐甘蔗(sugarcane)、能源甘蔗(energycane))、香脂杨(populusbalsamifera)(杨树(poplar))、棉花(海岛棉(gossypiumbarbadense)、陆地棉(gossypiumhirsutum))、向日葵(helianthusannuus(太阳花(sunflower))、紫花苜蓿(medicagosativa)(苜蓿(alfalfa))、甜菜(betavulgaris)(糖甜菜(sugarbeet))、高粱(两色高粱(sorghumbicolor)、普通高粱(sorghumvulgare))、蔗茅属物种(erianthusspp.)、桔草(andropogongerardii)(大须芒草(bigbluestem))、矮象草(pennisetumpurpureum)(象草(elephantgrass)、虉草(phalarisarundinacea)(利甘草(reedcanarygrass)、百慕大草(cynodondactylon)(狗牙根(bermudagrass)、高羊茅(festucaarundinacea)(牛尾草(tallfescue))、果胶草(spartinapectinata)(草原绳草(prairiecord-grass)、芦竹(arundodonax)(巨芦苇(giantreed))、冬黑麦(secalecereale)(黑麦(rye))、柳属物种(salixspp.)(柳树(willow))、桉属物种(eucalyptusspp.)((桉属，包括巨桉(e.grandis)(及其杂种，被称为“尾巨怪(urograndis)”)、蓝桉(e.globulus)、赤桉(e.camaldulensis)、细叶桉(e.tereticornis)、多枝桉(e.viminalis)、亮果桉(e.nitens)、柳叶桉(e.saligna)和尾叶桉(e.urophylla))、小黑麦属物种(triticosecalespp.)((小麦属-小麦x黑麦)、画眉草(埃塞俄比亚画眉草(eragrostistef))、竹子、红花(carthamustinctorius)(红花(safflower))、小油桐(jatrophacurcas)(麻风树(jatropha))、蓖麻(ricinuscommunis)(蓖麻(castor))、非洲油棕(elaeisguineensis)(棕榈树(palm))、亚麻(linumusitatissimum)(亚麻(flax))、木薯(manihotesculenta)(木薯(cassava))、番茄(lycopersiconesculentum)(西红柿(tomato))、莴苣(lactucasativa)(生菜(lettuce))、菜豆(phaseolusvulgaris)(青豆(greenbeans))、大棉豆(phaseoluslimensis)(利马豆(limabeans))、山黧豆属物种(lathyrusspp.)(豌豆(peas))、天宝蕉(musaparadisiaca)(香蕉(banana))、马铃薯(solanumtuberosum)(土豆(potato))、芸苔属物种(brassicaspp.)(甘蓝型油菜(b.napus)(低芥酸菜籽(canola))、芜菁(b.rapa)、芥菜(b.juncea))、甘蓝(brassicaoleracea)(西兰花(broccoli)、花椰菜(cauliflower)、球茎甘蓝(brusselsprouts))、茶树(camelliasinensis)(茶(tea))、草莓(fragariaananassa)(草莓(strawberry))、可可树(theobromacacao)(可可(cocoa))、咖啡树(coffeaarabica)(咖啡(coffee))、欧洲葡萄(vitisvinifera)(葡萄(grape))、凤梨(ananascomosus)(菠萝(pineapple))、指尖椒(capsicumannum)(甜辣椒(hot&sweetpepper))、落花生(arachishypogaea)(花生(peanuts))、甘薯(ipomoeabatatus)(地瓜(sweetpotato))、椰子(cocosnucifera)(椰子(coconut))、柑橘属物种(citrusspp.)(柑橘树(citrustrees))、鳄梨(perseaamericana)(鳄梨树(avocado))、无花果树(无花果(ficuscasica))、番石榴(番石榴(psidiumguajava))、芒果(杧果(mangiferaindica))、橄榄(油橄榄(oleaeuropaea))、番木瓜(caricapapaya)(番木瓜(papaya))、腰果(anacardiumoccidentale)(腰果树(cashew))、澳洲坚果(macadamiaintegrifolia)(麦加多利树(macadamiatree))、巴旦杏(prunusamygdalus)(扁桃(almond))、玉葱(alliumcepa)(洋葱(onion))、香瓜(cucumismelo)(喷鼻瓜(muskmelon))、黄瓜(cucumissativus)(黄瓜(cucumber))、罗马甜瓜(cucumiscantalupensis)(美国甜瓜(cantaloupe))、番南瓜(cucurbitamaxima)(西葫芦(squash))、裸仁南瓜(cucurbitamoschata)(西葫芦(squash))、菠菜(spinaceaoleracea)(菠菜(spinach))、西瓜(citrulluslanatus)(西瓜(watermelon))、黄秋葵(abelmoschusesculentus)(秋葵(okra))、栽培茄(solanummelongena)(茄子(eggplant))、簇生豆(cyamopsistetragonoloba)(瓜尔豆(guarbean))、长角豆(ceratoniasiliqua)(槐豆(locustbean))、胡芦巴(trigonellafoenum-graecum)(苦豆(fenugreek))、绿豆(vignaradiata)(绿夹豆(mungbean))、豇豆(vignaunguiculata)(豇豆(cowpea))、蚕豆(viciafaba)(favabean(favabean))、鹰嘴豆(cicerarietinum)(鸡豆(chickpea))、兵豆(lensculinaris)(小扁豆(lentil))、罂粟(papaversomniferum)(罂粟(opiumpoppy))、东方罂粟(papaverorientale)、红豆杉(taxusbaccata)、短叶红豆杉(taxusbrevifolia)、黄花蒿(artemisiaannua)、大麻(cannabissativa)、喜树(camptothecaacuminate)、长春花(catharanthusroseus)、日日春(vincarosea)、金鸡纳树(cinchonaofficinalis)、秋水仙(colchicumautumnale)、加州藜芦(veratrumcalifomica.)、毛花洋地黄(digitalislanata)、紫花洋地黄(digitalispurpurea)、薯蓣属物种(dioscoreaspp.)、穿心莲(andrographispaniculata)、颠茄(atropabelladonna)、曼陀罗(daturastomonium)、小檗属物种(berberisspp.)、三尖杉属物种(cephalotaxusspp.)、草麻黄(ephedrasinica)、麻黄属物种(ephedraspp.)、古柯(erythroxylumcoca)、沃诺里雪花莲(galanthuswornorii)、莨菪属物种(scopoliaspp.)、千层塔(lycopodiumserratum)(蛇足石杉(huperziaserrata)、石松属物种(lycopodiumspp.)、蛇根木(rauwolfiaserpentina)、萝芙木属物种(rauwolfiaspp.)、加拿大血根(sanguinariacanadensis)、天仙子属物种(hyoscyamusspp.)、金盏花(calendulaofficinalis)、小白菊(chrysanthemumparthenium)、毛喉鞘蕊花(coleusforskohlii)、解热菊(tanacetumparthenium)、灰白银胶菊(partheniumargentatum)(银胶菊(guayule))、橡胶树属物种(heveaspp.)(橡胶(rubber))、留兰香(menthaspicata)(薄荷(mint))、欧薄荷(menthapiperita)(薄荷(mint))、红木(bixaorellana)(胭脂树(achiote))、六出花属物种(alstroemeriaspp.)、蔷薇属物种(rosaspp.)(玫瑰(rose))、杜鹃属物种(rhododendronspp.)(杜鹃(azalea))、绣球花(macrophyllahydrangea)(八仙花(hydrangea))、玫瑰木槿(hibiscusrosasanensis)(芙蓉(hibiscus))、郁金香属物种(tulipaspp.)(郁金香(tulips))、水仙属物种(narcissusspp.)(洋水仙(daffodils))、矮牵牛(petuniahybrida)(喇叭花(petunias))、康乃馨(dianthuscaryophyllus)(麝香石竹(carnation))、一品红(euphorbiapulcherrima)(猩猩木(poinsettia))、菊属(chrysanthemum)、烟草(nicotianatabacum)(烟草(tobacco))、白羽扇豆(lupinusalbus)(羽扇豆(lupin))、圆锥北美穗草(uniolapaniculata)(燕麦(oats))、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(agrostisspp.))、颤杨(populustremuloides)(山杨(aspen))、松属物种(pinusspp.)(松树(pine))、冷杉属物种(abiesspp.)(冷杉(fir))、槭属物种(acerspp.)(槭树(maple))、大麦(hordeumvulgare)(大麦(barley))、早熟禾(poapratensis)(蓝草(bluegrass))、毒麦属物种(loliumspp.)(黑麦草(ryegrass))、梯牧草(phleumpratense)(梯牧草(timothy))、和针叶树(conifers)。针叶树可以在本公开中使用，并且包括例如松树如火炬松(loblollypine，pinustaeda)、湿地松(slashpine，pinuselliotii)、杰克松(西黄松(pinusponderosa))、黑松(小干松(pinuscontorta))以及蒙特利松树(辐射松(pinusradiata))；花旗松(douglas-fir，pseudotsugamenziesii)；东方或加拿大铁杉(加拿大铁杉)；西部铁杉(异叶铁杉)；高山铁杉(mountainhemlock)(大果铁杉(tsugamertensiana))；美洲落叶松或落叶松(美国西部落叶松)；美国西加云杉(白云杉(piceaglauca))；红杉(北美红杉(sequoiasempervirens))；冷杉如银杉(温哥华冷杉(abiesamabilis))和香脂冷杉(加拿大胶杉(abiesbalsamea))；以及雪松，如美国西部侧柏(北美香柏(thujaplicata))以及阿拉斯加黄杉(alaskayellow-cedar)(黄扁柏(chamaecyparisnootkatensis))。草皮草可用于本公开中，并且包括但不限于：一年生早熟禾(早熟禾)、一年生黑麦草(多花黑麦草)、加拿大早熟禾(扁早熟禾)、细弱剪股颖(colonialbentgrass、agrostistenuis)、匍匐剪股颖(creepingbentgrass、agrostispalustris)、麦穗草(沙生冰草)、扁穗冰草(冰草)、硬羊茅(苇草(festucalongifolia))、肯塔基蓝草(草地早熟禾)、鸭茅(猫尾草)、多年生黑麦草(黑麦草)、红狐茅(紫羊茅)、小糠草(白翦股颖)、粗茎早熟禾(普通早熟禾)、羊茅(sheepfescue)(酥油草)、无芒雀麦(无芒雀麦草)、梯牧草(timothy、phleumpratense)、绒毛剪股颖(velvetbentgrass、agrostiscanina)、碱茅(weepingalkaligrass、puccinelliadistans)、西部麦草(蓝茎冰草)、圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、结缕草(结缕草属物种)、百喜草(bahiagrass、paspalumnotatum)、冰结草地(类地毯草)、百足草(假俭草)、隐花狼尾草(铺地狼尾草)、海滨雀稗(海雀稗)、蓝奶奶草(bluegramma)(格兰马草)、野牛草(buffalograss、buchloedactyloids)、边燕麦奶草(sideoatsgramma)(垂穗草)。在特定方面中，通过本公开的方法转化的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、稻、高粱、小麦、粟、烟草等)。特别的目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括但不限于豆类和豌豆。豆类包括但不限于瓜耳豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆和鹰嘴豆。本公开还包括通过本文所公开的任何方法获得的植物。本公开还包括来自通过本文所公开的任何方法获得的植物的种子。转基因植物定义为含有转基因的成熟可育植物。在公开的方法中，可以使用各种植物来源的外植体，包括未成熟胚、1-5mm合子胚、3-5mm胚、以及衍生自成熟穗来源的种子、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟花朵、雄穗、未成熟穗和花丝的胚。在一方面，用于所公开方法中的外植体可以衍生自成熟穗来源的种子、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟花朵、雄穗、未成熟穗和花丝。用于所公开方法中的外植体可以衍生自本文描述的任何植物。本公开涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物活性部分基本上不含如在其天然存在的环境中发现的通常与核酸分子或蛋白伴随或相互作用的其他细胞物质或组分，或当通过重组技术产生时基本上不含培养基或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。“分离的”核酸基本上不含在衍生出该核酸的生物体的基因组dna中天然地位于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(包括蛋白质编码序列)。例如，在多个方面中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列在衍生该核酸的细胞的基因组dna中天然地位于该核酸分子的侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％、5％、或1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组产生用于本公开的方法中的蛋白质或其生物活性部分时，最佳地，培养基表示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白质化学品。用于本公开的方法中的序列可从处于它们各自的转录起始位点旁侧的5′非翻译区分离。本公开包括可用于本公开的方法的分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。如本文所使用的，术语“片段”是指核酸序列的一部分。用于本公开的方法中的序列的片段保留了核酸序列的生物活性。可替代地，可用作杂交探针的核苷酸序列的片段可以不必保留生物活性。本文公开的核苷酸序列的片段可以是至少约20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2000、2025、2050、2075、2100、2125、2150、2175、2200、2225、2250、2275、2300、2325、2350、2375、2400、2425、2450、2475、2500、2525、2550、2575、2600、2625、2650、2675、2700、2725、2750、2775、2800、2825、2850、2875、2900、2925、2950、2975、3000、3025、3050、3075、3100、3125、3150、3175、3200、3225、3250、3275、3300、3325、3350、3375、3400、3425、3450、3475、3500、3525、3550、3575、3600、3625、3650、3675、3700、3725、3750、3775、3800、3825、3850、3875、3900、3925、3950、3975、4000、4025、4050、4075、4100、4125、4150、4175、4200、4225、4250、4275、4300、4325、4350、4375、4400、4425、4450、4475、4500、4525、4550、4575、4600、4625、4650、4675、4700、4725、4750、4775、4800、4825、4850、4875、4900、4925、4950、4975、5000、5025、5050、5075、5100、5125、5150、5175、5200、5225、5250、5275、5300、5325、5350、5375、5400、5425、5450、5475、5500、5525、5550、5575、5600、5625、5650、5675、5700、5725、5750、5775、5800、5825、5850、5875、5900、5925、5950、5975、6000、6025、6050、6075、6100、6125、6150、6175、6200或6225个核苷酸，以及高至主题序列的全长。核苷酸序列的生物活性部分可通过分离序列的一部分并评估该部分的活性来制备。还涵盖了用于本公开方法的核苷酸序列的片段和变体以及由此编码的蛋白质。如本文所用，术语“片段”是指核苷酸序列的一部分，由此编码的蛋白质或氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白质片段。可替代地，作为杂交探针的核苷酸序列的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段范围可以是从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、至高至编码用于本公开方法的蛋白质的全长核苷酸序列。如本文所用，术语“变体”是指与本文所公开的序列具有实质相似性的序列。变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸或肽的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸或多肽中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸或肽的取代。如本文所使用的，“天然”核苷酸或肽序列分别包括天然存在的核苷酸或肽序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，诸如像用本文概述的聚合酶链反应(pcr)和杂交技术来鉴定。用于本公开方法的蛋白质的生物活性变体可以与天然蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个、例如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，诸如通过例如采用定点诱变技术产生的那些核苷酸序列。通常，文中公开的核苷酸序列的变体将与该核苷酸序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、至95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数所确定的。还涵盖本文公开的核苷酸序列的生物活性变体。生物活性可以通过使用技术来测量，所述技术是例如rna印迹分析、从转录融合体获得的报道基因活性测量，等。参见，例如，sambrook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册](第2版，coldspringharborlaboratorypress[冷泉港实验室出版社])，coldspringharbor[冷泉港]，n.y.[纽约])，下文称为“sambrook”，通过引用整体并入本文。可替代地，可以测量在可操作地连接到核苷酸片段或变体的启动子的控制下产生的报告基因例如绿色荧光蛋白(gfp)或黄色荧光蛋白(yfp)等的水平。参见，例如，matz等人(1999)naturebiotechnology[自然生物技术]17：969-973；美国专利号6,072,050，其通过引用整体并入本文；nagai等人，(2002)naturebiotechnology[自然生物技术]20(1)：87-90。核苷酸序列变体还涵盖由诱变和重组发生程序(如dna改组)产生的序列。通过这种程序，可以操纵一个或多个不同的核苷酸序列以产生新的核苷酸序列。以此方式，由相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。这种dna改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如，stemmer，(1994)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]91：10747-10751；stemmer，(1994)nature[自然]370：389391；crameri等人(1997)naturebiotech.[自然生物技术]15：436-438；moore等人(1997)j.mol.biol.[分子生物学杂志]272：336-347；zhang等人(1997)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]94：4504-4509；crameri等人(1998)nature[自然]391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458，其通过引用整体并入本文。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，kunkel，(1985)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]82：488-492；kunkel等人，(1987)methodsinenzymol.[酶学方法]154：367-382；美国专利号4,873,192；walker和gaastra编辑.(1983)techniquesinmolecularbiology[分子生物学技术](麦克米伦出版公司，纽约)及其中引用的参考文献，所述文献通过引用整体并入文中。关于不影响目的蛋白的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于dayhoff等人，(1978)atlasofproteinsequenceandstructure[蛋白序列和结构图谱](natl.biomed.res.found.[国家生物医学研究基金会]，washington，d.c.[华盛顿特区])的模型中。保守取代，如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，会是最佳的。本公开的核苷酸序列可用于分离来自其他生物(特别是其他植物，更特别是其他单子叶植物或双子叶植物)的相应序列。以这种方式，可以使用如pcr、杂交等方法来鉴定此类序列(基于其与本文所示序列的序列同源性)。本公开涵盖了基于与本文所示的完整序列或者与完整序列的片段的序列同一性而分离的序列。在pcr方法中，可以设计寡核苷酸引物用于pcr反应，以从由任何目的植物提取的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物与pcr克隆的方法是本领域普遍已知的并公开于sambrook(同上)中。还参见，innis等人编辑(1990)pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(academicpress，newyork)[pcr方案：方法和应用指南(纽约学院出版社)]；innis和gelfand编辑(1995)pcrstrategies(academicpress，newyork)[pcr策略(纽约学院出版社)]；以及innis和gelfand编辑(1999)pcrmethodsmanual(academicpress，newyork)[pcr方法手册(纽约学院出版社)]，其通过引用整体并入本文。已知的pcr方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。在杂交技术中，利用已知核苷酸序列的全部或部分作为探针，该探针选择性杂交来自所选生物体的一群克隆基因组dna片段或cdna片段(即基因组或cdna文库)中存在的其他相应核苷酸序列。这些杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32p或任何其他可检测标记物进行标记。因此，例如，可通过基于本公开的序列标记合成的寡核苷酸来制得用于杂交的探针。用于制备杂交用探针和用于构建基因组文库的方法是本领域普遍已知的并且公开于sambrook(同上)中。例如，本文公开的完整序列、或其一个或多个部分可以用作探针，所述探针能够与相应的序列和信使rna特异性杂交。要在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包含的序列是序列中独特的，并且通常其长度为至少约10个核苷酸或者其长度为至少约20个核苷酸。可以使用此类探针通过pcr由选择的植物扩增相应的序列。可以使用这种技术从所需的生物体中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断测定。杂交技术包括杂交筛选铺板的dna文库(斑块或集落，参见例如sambrook，同上)。此类序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶序列杂交的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。探针长度通常小于约1000个核苷酸，最佳地，其长度小于500个核苷酸。典型地，严格条件是以下条件，在这些条件下该盐浓度在ph7.0至8.3时是小于约1.5m钠离子、典型为约0.01至1.0m钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)的温度为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)的温度为至少约60℃。添加去稳定剂如甲酰胺也可以实现严格条件。示例性低严格性条件包括在37℃使用30％至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃在1倍至2倍ssc(20倍ssc＝3.0mnacl/0.3m柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中严格条件包括在37℃在40％至45％甲酰胺、1.0mnacl、1％sds中进行杂交，并且在55℃至60℃在0.5倍至1倍ssc中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，并且在60℃至65℃在0.1倍ssc中最后洗涤至少30分钟的持续时间。杂交持续时间通常小于约24小时，通常为约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于dna-dna杂交体，热熔点(tm)可以从meinkoth和wahl(1984)anal.biochem.[分析生物化学]138：267284的方程大约估计：tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m为单价阳离子的摩尔浓度，％gc为dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且l为杂合体的碱基对长度。tm是温度(在定义的离子强度以及ph下)，在该温度下50％的互补靶序列杂交到完全配对的探针上。对于每1％的错配，tm减少大约1℃；因此，可以调整tm、杂交、和/或洗涤条件，以便与具有所希望的同一性的序列进行杂交。例如，如果查找具有90％同一性的序列，该tm可以降低10℃。通常情况下，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和ph下的tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比tm低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。使用方程式、杂交和洗涤组合物以及所希望的tm，本领域普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加ssc浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交]，第i部分，第2章(elsevier[爱思唯尔]，纽约)；以及ausubel等人编辑，(1995)currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学当前方案]，第2章(greenepublishingandwiley-interscience[格林出版与威利交叉科学出版社]，纽约)，其通过引用整体并入文中。另见，sambrook同上。因此，本公开涵盖具有活性的分离序列，这种分离序列在严格条件下与本文所公开的序列或其片段杂交。一般而言，具有活性并且与本文所公开的序列杂交的序列将与所公开的序列有至少40％至50％的同源性，约60％、70％、80％、85％、90％、95％至98％或更高的同源性。即，序列的序列相似性可以在一定范围内，共享至少约40％至50％、约60％至70％以及约80％、85％、90％、95％至98％的序列相似性。以下术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质同一性”。如本文使用的，“参比序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参比序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cdna或基因序列的区段、或完整的cdna或基因序列。如本文使用的，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续并指定的区段，其中与用于两个序列的最佳对齐的参比序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可能包含添加或缺失(即空位)。通常，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应当理解，由于多核苷酸序列中含有缺口，为了避免与参比序列的高相似性，典型地引入缺口罚分，并且将其从匹配数中减去。用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。因此，任意两个序列之间的百分序列同一性的测定能够用一种数学算法进行。这种数学算法的非限制性实例是myers和miller的算法，(1988)cabios4：11-17；smith等人的算法，(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2：482；needleman和wunsch的算法，(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志]48：443-453；pearson和lipman的算法，(1988)proc.natl.acad.sci.[美国科学院院报]85：2444-2448；karlin和altschul的算法，(1990)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]872：264，修改版karlin和altschul，(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]90：5873-5877，这些通过引用整体并入文中。这些数学算法的计算机实现可以用于序列比较，来确定序列同一性。这些实现方法包括，但不限于：pc/基因(pc/gene)程序中的clustal(获自易达利遗传学公司(intelligenetics)，加利福尼亚州山景城(mountainview，calif))；align程序(版本2.0)以及gcg威斯康星遗传学软件包(gcgwisconsingeneticssoftware)版本10中的gap、bestfit、blast、fasta、和tfasta(获自accelrys公司，美国加利福尼亚州圣迭戈斯克兰顿大道9685号(9685scrantonroad，sandiego，calif.，usa))。使用这些程序的对齐可以使用默认参数进行。以下充分描述了clustal程序：higgins等人(1988)gene[基因]73：237-244；higgins等人(1989)cabios5：151-153；corpet等人(1988)nucleicacidsres.[核酸研究]16：10881-90；huang等人(1992)cabios8：155-65；以及pearson等人(1994)meth.mol.biol.[分子生物学方法]24：307-331；所述文献通过引用整体并入文中。align程序基于myers与miller(1988)同上的算法。当比较氨基酸序列时，align程序可以使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12、空位罚分为4。altschul等人，(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215：403(通过引用整体并入文中)的blast程序是基于karlin和altschul(1990)(同上)的算法。blast核苷酸搜索可用blastn程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本公开的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可用blastx程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本公开的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用如altschul等人，(1997)nucleicacidsres.[核酸研究]25：3389(通过引用整体并入文中)中所述的缺口blast(在blast2.0中)。可替代地，psi-blast(在blast2.0中)可以用于进行检测分子之间远缘关系的迭代搜索。参见altschul等人(1997)，同上。当使用blast、缺口blast、psi-blast时，可以使用各自程序的默认参数(例如，用于核苷酸序列的blastn、用于蛋白质的blastx)。参见美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)网址www.ncbi.nlmnih.gov。还可依靠手动检查，来进行比对。除非另有说明，本文中提供的序列同一性/相似性值是指使用gap版本10使用以下参数获得的值：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用gap权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性和％相似性，使用gap权重8和长度权重2以及blosum62评分矩阵；或其任何等效程序。如本文所用，“等效程序”是任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生一个比对，当与gap版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对以及相同的百分比序列同一性。gap程序使用needleman和wunsch(同上)的算法来找到使匹配数目最大化并且使空位数目最小化的两个完整序列的比对。gap考虑所有可能的对齐和空位位置，并且产生具有最大匹配碱基数量和最少空位的对齐。它允许以匹配碱基单位提供空位产生罚分和空位延伸罚分。gap必须为它插入的每个空位获取空位产生罚分匹配数目的收益。如果选择大于零的空位延伸罚分，gap必须另外地为每个所插入空位获取空位长度乘以空位延伸罚分的收益。在gcg威斯康辛遗传软件包的版本10中，蛋白质序列默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生和空位延伸罚分可以表示为选自下组的整数，该组由0至200组成。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。gap代表最佳对齐家族的一个成员。可以存在这个家族的许多成员，但是其他成员没有更好的品质。gap展示出用于对齐的四个性能因数：质量、比率、同一性和相似性。为了对齐序列，质量是最大化的度量。比率是质量除以更短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。空位对面的符号被忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，相似性得分。gcg威斯康星遗传软件包版本10中所用的评分矩阵是blosum62(参见henikoff和henikoff，(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：10915，通过引用整体并入文中)。如本文使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，当在指定比较窗口上对齐最大对应性时，两个序列中的相同残基。当使用关于蛋白质的序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常相差保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调节序列同一性百分比，以校正该取代的保守性质。相差这些保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的方法是本领域技术人员所熟知的。典型地，这涉及作为部分而不是完全错配对保守取代打分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1，并且非保守取代的得分为零时，保守取代的得分在零和1之间。计算保守取代的评分，例如，如在程序pc/gene(易达利遗传学公司(intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州)中实现的。如本文使用的，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)相比，该比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即空位)，以进行这两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指，使用比对程序使用标准参数与参比序列比较时，多核苷酸包含具有至少70％序列同一性、优选至少80％、更优选至少90％、和最优选至少95％序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，可以适当地调整这些值以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指至少60％、70％、80％、90％和至少95％的序列同一性。核苷酸序列实质相同的另一个指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，严格条件被选择为在定义的离子强度和ph下比指定序列的tm低约5℃。然而，严格条件涵盖比tm低约1℃至约20℃范围的温度，这取决于如本文其他部分确定的所需的严格程度。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽实质上相同的，则这些核酸仍然是实质上相同的。例如，当使用遗传编码允许的最大密码子简并性产生一个拷贝的核酸时，这可能发生。两个核酸序列实质上相同的一个指征是，第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性。“变体”意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码本文所公开的目的形态发生基因和/或基因/多核苷酸中一种的氨基酸序列的序列。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，例如那些例如通过使用定点诱变而产生但是仍编码本文公开的目的形态发生基因和/或基因/多核苷酸的蛋白质的多核苷酸。一般而言，本文所公开的特定目的形态发生基因和/或基因/多核苷酸的变体将具有与该特定目的形态发生基因和/或基因/多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过文中其他地方所述的序列比对程序和参数来确定。“变体”蛋白质意指通过在天然蛋白中的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加，和/或在天然蛋白质中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代衍生自天然蛋白质的蛋白质。本公开涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白的期望的生物活性，即，该多肽具有目的活性的形态发生基因和/或基因/多核苷酸。此类变体可以由例如遗传多态性或人为操作产生。本文所公开的蛋白的目的天然形态发生基因和/或基因/多核苷酸的生物活性变体将与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性，如通过文中其他地方所述的序列比对程序和参数来确定。本公开的蛋白质的生物活性变体可以与所述蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个、例如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。本文所公开的序列和基因及其变体和片段可用于植物的基因工程，例如，用于产生转化的或转基因的植物，来表达目的表型。如本文使用的，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。应当理解的是，如本文所用，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的异源dna构建体转化植物细胞，所述核酸表达盒包含目的基因；再生由所转移的基因插入所述植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个植物之间有性杂交所产生的后代，其中所述后代包含异源dna。转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法包括：显微注射(crossway等人(1986)biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(riggs等人(1986)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(townsend等人，美国专利号5,563,055；zhao等人，美国专利号5,981,840)、直接基因转移(paszkowski等人(1984)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)、和弹道粒子加速法(参见例如sanford等人，美国专利号4,945,050；tomes等人，美国专利号5,879,918；tomes等人，美国专利号5,886,244；bidney等人，美国专利号5,932,782；tomes等人(1995)“directdnatransferintointactplantcellsviamicroprojectilebombardment[通过微粒轰击将dna直接转移到完整植物细胞中]”在plantcell，tissue，andorgancuhure：fundamentalmethods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，gamborg和phillips编辑(施普林格出版公司(springer-verlag)，柏林)(玉米)；mccabe等人(1988)biotechnology[生物技术]6：923-926)；和lecl转化法(wo00/28058)。还参见，weissinger等人，(1988)ann.rev.genet.[遗传学年度评论]22：421-477；sanford，等人，(1987)particulatescienceandtechnology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；christou等人(1988)plantphysiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；mccabe等人(1988)bio/technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)invitrocelldev.biol.[体外细胞发育生物学]27p：175-182(大豆)；singh等人(1998)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；datta等人(1990)biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；klein等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85：4305-4309(玉米)；klein等人(1988)biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；tomes，美国专利号5,240,855；buising等人，美国专利号5,322,783和5,324,646；klein等人(1988)plantphysiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；fromm等人(1990)biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；hooykaas-vanslogteren等人(1984)nature[自然](伦敦)311：763-764；bowen等人，美国专利号5,736,369(谷物)；bytebier等人(1987)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；dewet等人(1985)在theexperimentalmanipulationofovuletissues[胚珠组织的实验操作]中，chapman等人编著(纽约朗文)，第197-209页(花粉)；kaeppler等人(1990)plantcellreports[植物细胞报告]9：415-418以及kaeppler等人(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]84∶560-566(晶须介导的转化)；d′halluin等人，(1992)plantcell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔法)；li等人，(1993)plantcellreports[植物细胞报道]12：250-255以及christou和ford，(1995)annalsofbotany[植物学年报]75：407-413(稻)；osjoda等人，(1996)naturebiotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌的玉米)；以及美国专利申请公开号2017/0121722(快速植物转化)，以上所有文献都通过引用整体并入文中。本文提供的方法依赖于使用细菌介导的和/或生物射弹介导的基因转移来产生具有掺入的目标核苷酸序列的可再生植物细胞。可用在本公开的方法中的细菌菌株包括但不限于卸甲(disarmed)农杆菌、苍白杆菌属(ochrobactrum)细菌或根瘤菌科(rhizobiaceae)细菌。在本发明方法中有用的解毒的农杆菌包括但不限于agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-。可用于本发明方法的苍白杆菌属细菌菌株包括但不限于表2中列出的那些。表2.可用于本发明方法的根瘤菌科细菌菌株包括但不限于表3中列出的那些(也参见us9,365,859，其通过引用整体并入文中)。表3.可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，来将本公开的多核苷酸引入植物。通常，这类方法涉及将本公开的核苷酸构建体掺入病毒dna或rna分子内。涉及病毒dna或rna分子、用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和porta，等人，(1996)molecularbiotechnology[分子生物技术]5：209-221，所述文献通过引用整体并入文中。本公开的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。如本文使用，“引入”意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于植物中以致于所述序列得以进入所述植物的细胞内部。本公开的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。“稳定转化”是其中引入到植物中的核苷酸构建体或表达盒整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸或表达盒引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。报道基因或选择性标记基因也可以包括在本文公开并用于本公开方法的表达盒中。本领域已知的合适的报告物的实例可以在以下中找到：例如，jefferson，等人，(1991)plantmolecularbiologymanual[植物分子生物学年刊]，编辑gelvin，等人，(kluweracademicpublishers[鲁维尔学术出版社])，第1-33页；dewet等人，(1987)mol.cell.biol.[分子与细胞生物学]7：725-737；goff等人，(1990)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；kain，等人，(1995)biotechniques[生物技术]19：650-655和chiu，等人，(1996)currentbiology[当前生物学]6：325-330，通过引用以其整体并入本文。选择标记物包含允许人们通常在特定条件下鉴定或选择包含它的分子或细胞或对其进行选择的dna区段。这些标记物可以编码活性，例如但不限于rna、肽或蛋白质的产生，或可以提供rna、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等的结合位点。选择标记的实例包括但不限于包含限制性内切酶位点的dna区段；编码对其他毒性化合物具有抗性的产物的dna区段(例如抗生素，如大观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、巴斯塔(basta)、新霉素磷酸转移酶ii(neo)和潮霉素磷酸转移酶(hpt))；编码另外在受体细胞中缺少的产物的dna区段(例如，trna基因、营养缺陷型标记物)；编码可以容易地鉴定的产物的dna区段(例如，表型标记物例如β-半乳糖苷酶、gus；荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)、青色荧光蛋白(cfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)和细胞表面蛋白)；产生用于pcr的新引物位点(例如，以前未并列的两个dna序列的并列)，包含通过限制性内切核酸酶或其他dna修饰酶、化学品等不起作用或起作用的dna序列；并且包含允许其鉴定的特异性修饰(例如，甲基化)所需的dna序列。用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因的实例包括但不限于编码对以下具有抗性的基因：氯霉素(herreraestrella等人，(1983)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；甲氨蝶呤(herreraestrella等人，(1983)nature[自然]303：209-213；meijer等人，(1991)plantmol.biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(waldron等人，(1985)plantmol.biol.[植物分子生物学]5：103-108和zhijian等人，(1995)plantscience[植物科学]108：219-227)；链霉素(jones等人，(1987)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；大观霉素(bretagne-sagnard等人，(1996)transgenicres.[转基因研究]5：131-137)；博来霉素(hille等人，(1990)plantmol.biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺(guerineau等人，(1990)plantmol.biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴苯腈(stalker等人，(1988)science[科学]242：419-423)；草甘膦(shaw等人，(1986)science[科学]233：478-481和美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；膦丝菌素(deblock等人，(1987)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)，其通过引用整体并入文中。赋予对除草化合物抗性的选择标记包括编码对除草化合物抗性和/或耐受性的基因，例如草甘膦、磺酰脲、草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-d)。一般参见yarranton(1992)curr.opin.biotech.[生物技术新观点]3：506-511；christopherson等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]89：6314-6318；yao等人(1992)cell[细胞]71：63-72；reznikoff(1992)mol.microbiol.[分子微生物学]6：2419-2422；barkley等人(1980)theoperon[操纵子]，第177-220页；hu等人(1987)cell[细胞]48：555-566；brown等人(1987)cell[细胞]49：603-612；figge等人(1988)cell[细胞]52：713-722；deuschle等人(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]86：5400-5404；fuerst等人(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]86：2549-2553；deuschle等人(1990)science[科学]248：480-483；gossen(1993)博士论文，海德堡大学；reines等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]90：1917-1921；labow等人(1990)mol.cell.biol.[分子和细胞生物学]10：3343-3356；zambretti等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]89：3952-3956；baim等人(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]88：5072-5076；wyborski等人(1991)nucleicacidsres.[核酸研究]19：4647-4653；hillen和wissman(1989)topicsmol.struc.biol.[分子和结构生物学的主题]10：143-162；degenkolb等人(1991)antimicrob.agentschemother.[抗菌剂与化疗]35：1591-1595；kleinschnidt等人(1988)biochemistry[生物化学]27：1094-1104；bonin(1993)博士论文，海德堡大学；gossen等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]89：5547-5551；oliva等人(1992)antimicrob.agentschemother.[抗菌剂与化疗]36：913-919；hlavka等人(1985)handbookofexperimentalpharmacology[实验药理学手册]，第78卷(springer-verlag，berlin[施普林格出版社柏林])；gill等人(1988)nature[自然]334：721-724。此类公开内容通过引用并入本文。可用于本发明方法的某些选择标记包括但不限于赋予对磺酰脲和咪唑啉酮抗性的玉米hra基因(lee等人，1988，emboj[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241-1248)、赋予对草甘膦抗性的gat基因(castle等人，2004，science[科学]304：1151-1154)、赋予对大观霉素抗性的基因，例如aada基因(svab等人，1990，plantmolbiol.[植物分子生物学]14：197-205)和赋予对草铵膦抗性的bar基因(white等人，1990，nucl.acidsres.[核酸研究]25：1062)，以及pat(或玉米的mopat，参见rasco-gaunt等人，2003，plantcellrep.[植物细胞报告]21：569-76)和允许在含甘露糖的培养基上生长的pmi基因(negrotto等人，2000，plantcellrep.[植物细胞报告]22：684-690)对于在该方法的体细胞胚胎发生和胚成熟所涵盖的短暂经过时间期间的快速选择是非常有用的。但是，根据所用的选择标记和正在转化的作物、近交系或变种，野生型逃逸的百分比可能会有所不同。在玉米和高粱中，hra基因可有效降低野生型逃逸的频率。可用于恢复转基因事件的其他基因将包括但不限于以下实例，如：gus(β-葡糖醛酸糖苷酶；jefferson，(1987)plantmol.biol.rep.[植物分子生物学报告]5：387)、gfp(绿色荧光蛋白；chalfie等人，(1994)science[科学]263：802)、荧光素酶(riggs等人，(1987)nucleicacidsres.[核酸研究]15(19)：8115和luehrsen等人，(1992)methodsenzymol.[酶学方法]216：397-414)、具有跨越远红、红、橙、黄、绿、青和蓝的交替发射最佳光谱的各种荧光蛋白(shaner等人，2005，naturemethods[自然方法]2：905-909)和编码花色素苷产生的玉米基因(ludwig等人，(1990)science[自然]247：449)等实例，这些文献通过引用整体并入文中。以上选择标记的列表并不意在是限制性的。在本公开的方法中可以使用任何选择标记。在一方面，本公开方法提供了允许正生长选择的转化方法。本领域技术人员可以理解，常规的植物转化方法主要依靠如上所述的负选择方案，其中使用抗生素或除草剂(负选择剂)抑制或杀死未转化的细胞或组织，并且转基因细胞或组织由于抗性基因的表达而继续生长。相反，本公开的方法可以在不施用负选择剂的情况下使用。因此，尽管野生型细胞可以不受阻碍地生长，但是通过比较，可以容易地鉴定受形态发生基因的受控表达影响的细胞，因为他们相对于周围野生型组织的生长速率加速。除了简单地观察到更快的生长之外，本公开的方法还提供了相对于非转化细胞表现出更快的形态发生的转基因细胞。因此，这种差异生长和形态发生发育可用于容易地将转基因植物结构与周围的非转化组织区分开，该过程在本文中称为“正生长选择”。本公开提供了使用多种起始组织类型在多个近交系中以增加的效率和速度产生转基因植物并且提供显著更高的转化频率和显著更高质量事件(包含一个拷贝的性状基因表达盒而没有载体(质粒)骨架的事件)的方法，所述近交系包括代表一系列遗传多样性并具有重要商业用途的转化近交系。所公开的方法可以进一步包括提供改良的性状和特征的多核苷酸。所公开的方法可以进一步包含提供改善的性状和特征的多核苷酸。如本文所用，“性状”是指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在一些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小；或者可以通过生化技术测量，例如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量；或通过观察代谢或生理过程，例如通过测量二氧化碳的摄取；或通过观察一个或多个基因的表达水平，例如通过采用northern分析、rt-pcr、微阵列基因表达测定或报告基因表达系统；或通过农学观察如胁迫耐受性、产量或病原体耐受性。除了使用传统的育种方法之外，还可通过遗传方式改变农学上重要的性状(例如油、淀粉、和蛋白质含量)。修饰包括增加油酸、饱和及不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、以及还有对淀粉的修饰。在美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802、和5,990,389中描述了hordothionin蛋白质修饰，将这些专利通过引用结合在此。另一个实例是由美国专利号5,850,016中描述的大豆2s白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白质，以及williamson等人(1987)eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]165：99-106描述的来自大麦的糜蛋白酶抑制剂，这些文献的公开通过引用结合在此。编码序列的衍生物可以通过定点诱变制造，以增加编码的多肽中预先选择的氨基酸的水平。例如，可以使用如来自向日葵种子(lilley等人(1989)proceedingsoftheworldcongressonvegetableproteinutilizationinhumanfoodsandanimalfeedstuffs[关于植物蛋白在人类食物和动物饲料中的应用的世界大会进展]，applewhite编辑(americanoilchemistssociety，champaign，ill.[美国油化学协会，平原市，伊利诺伊州])，第497-502页；通过引用结合在此)；玉米(pedersen等人(1986)j.biol.chem.[生物化学杂志]261：6279；kirihara等人(1988)gene[基因]71：359；将这两者通过引用结合在此)；和稻(musumura等人(1989)plantmol.biol.[植物分子生物学]12：123，通过引用结合在此)的富含甲硫氨酸的植物蛋白。其他农业重要的基因编码乳胶、floury2、生长因子、种子储存因子、和转录因子。许多农艺性状可以影响“产率”，这些农艺性状包括但不限于植物高度、豆英数目、植物上的豆英位置、节间数目、豆英粉碎的发生率、颗粒尺寸、生节和固氮作用的效率、养分同化的效率、对生物和非生物应力的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌芽百分比、秧苗活力以及幼体性状。可以影响产率的其他性状包括：萌发效率(包括在胁迫条件下的萌发)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、穗数目、每个穗的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子填充的特征。还感兴趣的是转基因植物的产生，所述转基因植物表现出可能或可能不赋予植物总产量增加的理想表型特性。这样的特性包括增强的植物形态学、植物生理学或从转基因植物收获的成熟种子的改良成分。本公开的转基因植物的“增加的产量”可用许多方法证明并测量，包括容重、每株植物的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(即每英亩的种子、或种子重量)、蒲式耳/英亩、吨/英亩、公斤/公顷。例如，玉蜀黍产量可测量为通常基于水分调整(例如15.5％的水分)来报告的每单位生产面积的去壳玉米粒的产量，例如以蒲式耳/英亩或公吨/公顷为单位。增加的产量可以是由于提高了关键生化化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用，或者是由于提高了对环境胁迫(如寒冷、炎热、干旱、盐、以及害虫或病原体攻击)的耐受性所致。作为植物生长调节剂改变表达或者细胞周期或光合作用途径改变的结果，性状增强重组dna还可用于提供具有改善的生长和发育以及最终增加的产量的转基因植物。如用于描述本公开的各方面的“增强的性状”包括改善或增强的水分利用效率或耐旱性、渗透胁迫耐受性、高盐度胁迫耐受性、热胁迫耐受性、增强的耐寒性(包括萌发耐寒性)、增加的产量、改良的种子质量、提高的氮利用效率、植物生长发育较早、植物生长发育迟缓、增强的种子蛋白质以及增强的种子油生产。可以在本公开的方法中使用任何目的多核苷酸或性状基因。由目的基因或性状基因所赋予的表型的各种变化包括用于改变植物中的脂肪酸组成，改变植物的氨基酸含量、淀粉含量或碳水化合物含量，改变植物的病原体防御机制，改变籽粒大小，改变蔗糖载量等的那些改变。目的基因或性状基因还可以参与调节营养素的流入，并且参与调节植酸盐基因的表达，特别是降低种子中的植酸水平。这些结果可以通过提供异源产物的表达或增加植物中内源产物的表达来实现。可替代地，可以通过提供一种或多种内源产物，特别是植物中的酶或辅酶因子的表达降低来实现所述结果。这些改变导致转化的植物的表型的变化。如本文所用，“性状基因”是指整合到植物基因组中以产生可育转基因t0植物的目的基因。通过实例的方式本文使用了例如高抗性乙酰乳酸合酶(hra)的选择标记和例如荧光蛋白基因的视觉标记。性状基因可以是赋予增值的农艺学、生理学、生化或物理表型的任何基因(或基因组合)。目的基因/性状基因反映了参与作物发育的那些基因的商业市场和利益。目的作物和市场发生变化，以及随着发展中国家打开国际市场，新作物和技术也将出现。此外，随着对农艺学性状和特征(例如产量和杂种优势)的了解增加，用于转化的基因和性状的选择也会相应变化。用于本公开方法的目的核苷酸序列或基因或性状基因的一般类别包括，例如涉及信息的那些基因(例如锌指)，涉及通讯的那些基因(例如激酶)，以及涉及管家的那些基因(例如热休克蛋白)。转基因的更具体的类别例如包括编码农艺学、昆虫抗性、抗病性、除草剂抗性、不育性、环境胁迫抗性(对寒冷、盐、干旱等的耐受性改变)、谷物特征和商业产品的重要性状的基因。通过本文公开的方法转化的启动子序列表达的异源编码序列，异源多核苷酸和目的多核苷酸可用于改变植物的表型。表型的各种变化是所关注的，包括修饰基因在植物中的表达，改变植物对病原体或昆虫的防御机制，提高植物对除草剂的耐受性，改变植物发育以响应环境胁迫，调控植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱等的响应。这些结果可通过表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来获得。在特定方面中，目的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提升的植物内源序列。可以通过提供改变的一个或多个内源基因产物(特别是激素、受体、信号分子、酶、转运蛋白或辅因子)的表达或通过影响植物中的营养摄取来获得结果。这些改变导致转化的植物的表型的变化。仍另外的转基因种类包括从植物和其他真核生物以及原核生物诱导外源性产物(如酶、辅因子及激素)的表达的基因。认识到任何目的基因，目的多核苷酸，目的性状基因或多个基因/多核苷酸/性状可以可操作地连接到一个或多个启动子并在通过本文公开的方法转化的植物中表达，例如可以与一种或多种其他输入性状基因(例如除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、疾病抗性、雄性不育性、茎秆强度等)或输出性状基因(例如产量增加、变性淀粉、油谱改善、氨基酸平衡、高赖氨酸或甲硫氨酸、消化率提高、纤维质量改善、干旱抗性等)堆叠的昆虫抗性性状基因。启动子可以可操作地连接到农学上重要的性状基因，用以在通过本文公开的方法转化的植物中表达，该性状基因影响谷物的质量，例如饱和与不饱和的油的水平(增加油酸含量)和类型、必需氨基酸的质量和数量、增加赖氨酸和硫的水平、纤维素的水平以及淀粉和蛋白质含量。启动子可以可操作地连接到提供hordothionin蛋白修饰的性状基因，用以在通过本文公开的方法转化的植物中表达，所述方法在美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,049中描述；这些专利通过引用整体并入文中。可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的性状基因的另一个实例是美国专利号5,850,016中所述的大豆2s白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，以及来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，williamson等人，(1987)eur.j.biochem[欧洲生物化学杂志]165：99-106，其公开内容通过引用整体并入本文。启动子可以可操作地连接到昆虫抗性性状基因，以在通过本文公开的方法转化的植物中表达，所述昆虫抗性性状基因编码对影响产量的有害生物的抗性，这些有害生物例如根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。这样的基因包括，例如苏云金芽孢杆菌有毒蛋白基因，美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881和geiser等人，(1986)gene[基因]48：109，他们的公开内容通过引用整体并入文中。可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的编码抗病性状的基因包括，例如，解毒基因，例如将伏马菌素解毒的那些基因(美国专利号5,792,931)；无毒(avr)和抗病性(r)基因(jones等人，(1994)science[科学]266：789；martin等人，(1993)science[科学]262：1432；以及mindrinos等人，(1994)cell[细胞]78：1089)，所述文献通过引用整体并入文中。可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的除草剂抗性性状基因包括编码对具有抑制乙酰乳酸合酶(als)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂(例如含有导致这种抗性突变(特别是s4和/或hra突变)的乙酰乳酸合酶(als)基因))具有抗性的基因、编码对具有抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂(例如草丁瞵或basta(例如bar基因))具有抗性的基因、编码对草甘膦具有抗性的基因(例如，epsps基因和gat基因；例如，参见美国专利申请公开号2004/0082770、wo03/092360和wo05/012515，所述文献通过引用整体并入文中)或其他本领域已知的此类基因。bar基因编码对除草剂basast的抗性，nptii基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且als基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性，它们中的任一个和全部都可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达。草甘膦抗性由突变型5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸酯合酶(epsps)和aroa基因赋予，所述aroa基因可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达。参见，例如shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了epsps形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。barry等人的美国专利5,627,061也描述了编码epsps酶的基因，所述基因可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达。还参见，美国专利号6,248,876b1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114b1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e和5,491,288以及国际公开wo97/04103；wo97/04114；wo00/66746；wo01/66704；wo00/66747和wo00/66748，其通过引用整体并入文中。草甘膦抗性也赋予表达可与启动子可操作地连接以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的基因的植物，所述基因编码如美国专利号5776760和5463175(其通过引用整体并入文中)中更全面地描述的草甘膦氧化还原酶。草甘膦抗性也可以通过与启动子可操作地连接以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的编码草甘膦n-乙酰基转移酶的基因的过表达而赋予植物。参见，例如美国专利申请公开号2004/0082770，wo03/092360和wo05/012515，所述专利通过引用整体并入文中。可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的不育基因也可以在dna构建体中编码，并提供物理去雄的替代方法。以这种方式使用的基因的实例包括美国专利号5,583,210(通过引用整体并入文中)中所描述的雄性组织优选基因和具有雄性不育表型的基因(如qm)。可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的其他基因包括激酶和编码对雄或雌配子体发育有毒的化合物的那些。商业性状也可以由可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的一个或多个基因编码，所述基因可以增加例如用于乙醇生产的淀粉或提供蛋白质的表达。转化植物的另一个重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，例如在美国专利号5,602,321(通过引用整体并入文中)中所述。促进聚羟基链烷酸酯(pha)的表达的基因(例如β酮硫解酶、phb酶(聚羟基丁酸酯合酶)、及乙酰乙酰辅酶a还原酶)可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达(参见schubert等人.，(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847，其通过引用整体并入文中)。可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的其他适用性状基因及其相关表型的实例包括编码病毒外壳蛋白和/或rna的基因或赋予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量提高的基因；以及提供针对胁迫的抗性的基因，所述胁迫诸如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的脱水、有毒金属或者痕量元素等。通过说明的方式，而无意于限制，以下是可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的性状基因类型的其他实例的列表。1.性状基因，其赋予对昆虫或疾病的抗性并编码：(a)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(r)的产物与病原体中相应的无毒性(avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物变种，以工程改造对具体病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如，jones等人，(1994)science[科学]266：789(克隆番茄cf-9基因以抵抗黄枝孢霉(cradosporiumfulvum))；martin等人，(1993)science[科学]262：1432(对编码蛋白激酶的丁香假单孢菌番茄致病变种的抗性的番茄pto基因)；mindrinos等人，(1994)cell[细胞]78：1089(对丁香假单孢菌的抗性的拟南芥属rsp2基因)；mcdowell和woffenden，(2003)trendsbiotechnol.[生物技术趋势]21(4)：178-83以及toyoda等人，(2002)transgenicres.[转基因研究]11(6)：567-82，其通过引用整体并入文中。与野生型植物相比，对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。(b)苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或其上建模的合成多肽。参见，例如，geiser等人，(1986)gene[基因]48：109，其公开了btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的dna分子可购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(美国马里兰州罗克韦尔市(rockville，md.))，例如atcc登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他实例在以下专利和专利申请中给出，并为此目的通过引用并入本文：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；wo91/14778；wo99/31248；wo01/12731；wo99/24581；wo97/40162和美国申请序列号10/032,717；10/414,637和10/606,320，所述文献通过引用整体并入文中。(c)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素、其变体、基于其的模拟物、或其桔抗剂或激动剂。参见例如，hammock等人，(1990)nature[自然]344：458公开了经克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)的杆状病毒表达，将该文献通过引用整体并入文中。(d)昆虫特异性肽，其表达时破坏受影响害虫的生理学。例如，参见以下公开：regan，(1994)j.biol.chem.[生物化学杂志]269：9(expressioncloningyieldsdnacodingforinsectdiuretichormonereceptor[表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的dna])；pratt等人，(1989)biochem.biophys.res.comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]163：1243(anallostatinisidentifiedindiplopterapuntata[在紫斑折翅类中鉴定一种同分异构他汀])；chattopadhyay等人，(2004)criticalreviewsinmicrobiology[微生物学重要评论]30(1)：33-54；zjawiony，(2004)jnatprod[天然产物杂志]67(2)：300-310；carlini和grossi-de-sa，(2002)toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；ussuf等人，(2001)currsci.[当代科学]80(7)：847-853；以及vasconcelos和oliveira，(2004)toxicon[毒素]44(4)：385-403；将这些文献通过引用整体并入文中。还参见tomalski等人的美国专利号5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因，将该文献通过引用整体并入文中。(e)引起单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯基丙烷衍生物或具有杀昆虫活性的另一种非蛋白质分子超积累的酶。(f)参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，scott等人的pct申请号wo93/02197，其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列，将该文献通过引用整体并入文中。含有几丁质酶编码序列的dna分子可以例如从atcc登录号39637和67152下获得。还参见kramer等人，(1993)insectbiochem.molec.biol.[昆虫生物化学与分子生物学]23：691，其教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cdna的核苷酸序列，和kawalleck等人，(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：673，其提供了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列，美国专利申请序列号10/389,432、10/692,367和美国专利号6,563,020，它们通过引用整体并入本文。(g)刺激信号转导的分子。例如，参见botella等人，(1994)plantmolec.biol.[植物分子生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cdna克隆的核苷酸序列；以及griess等人，(1994)plantphysiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉米钙调素cdna克隆的核苷酸序列；所述文献通过引用整体并入文中。(h)疏水性瞬时肽。参见，pct申请号wo95/16776和美国专利号5,580,852(公开了速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物)以及pct申请号wo95/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽)；所述文献通过引用整体并入文中。(i)膜透性酶，一种通道形成剂或通道阻断剂。例如，参见jaynes等人，(1993)plantsci.[植物科学]89：43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearum)具有抗性的转基因烟草植物；将该文献通过引用整体并入文中。(j)病毒侵入性蛋白或其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。参见，beachy等人，(1990)ann.rev.phytopathol.[植物病理学年评]28：451，其通过引用整体并入文中。外壳蛋白介导的抗性已赋予经转化的植物抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。(k)昆虫特异性抗体或其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。参看taylor等人，摘要#497，关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会(seventhint′lsymposiumonmolecularplant-microbeinteractions)(苏格兰爱丁堡(edinburgh，scotland)，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中的酶失活)；将该文献通过引用整体并入文中。(l)病毒特异性抗体。参见，例如tavladoraki等人，(1993)nature[自然]366：469，他们示出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭，将该文献通过引用整体并入文中。(m)在自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。因此，真菌内α-1，4-d-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-1，4-d-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见，lamb等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：1436，将该文献通过引用整体并入文中。toubar等人，(1992)plantj.[植物杂志]2：367描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征，将该文献通过引用整体并入文中。(n)在自然界中由植物产生的发育阻滞蛋白。例如，logemann等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：305已经表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌病的抗性，将该文献通过引用整体并入文中。(o)参与系统获得抗性(sar)应答的基因和/或发病机制相关基因。briggs，(1995)currentbiology[当前生物学]5(2)：128-131，pieterse和vanloon，(2004)curr.opin.plantbio.[当代植物生物学观点]7(4)：456-64以及somssich，(2003)cell113(7)：815-6，它们通过引用整体并入文中。(p)抗真菌基因(cornelissen和melchers，(1993)pl.physiol.[植物生理学]101：709-712以及parijs等人，(1991)planta[植物学]183：258-264以及bushnell等人，(1998)can.j.ofplantpath.[加拿大植物科学杂志]20(2)：137-149。还参见美国专利申请号09/950,933，所述文献通过引用整体并入文中。(q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如参见美国专利号5,792,931，将该文献通过引用整体并入文中。(r)胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。参见美国申请序列号10/947,979，将该文献通过引用整体并入文中。(s)防御素基因。参见wo03/000863和美国申请序列号10/178,213，所述文献通过引用整体并入文中。(t)赋予对线虫的抗性的基因。参见wo03/033651，以及urwin等人，(1998)planta[植物]204：472-479，和williamson，(1999)curropinplantbio.[植物生物学当代观点]2(4)：327-31；它们通过引用整体并入文中。(u)赋予对炭疽茎腐病(由真菌禾生炭疽菌引起)的抗性的基因，如rcg1。参见jung等人，generation-meansanalysisandquantitativetraitlocusmappingofanthracnosestalkrotgenesinmaize[玉米炭疽病茎腐病基因的世代平均值分析和数量性状基因座作图]，theor.appl.genet.[理论与应用遗传学](1994)89：413-418，以及美国临时专利申请号60/675,664，它们通过引用整体并入文中。2.赋予对除草剂的抗性的性状基因，例如：(a)抑制生长点或分生组织的除草剂，如咪唑啉酮或磺酰脲。这个类别的示例性基因编码突变体als和ahas酶，例如分别如以下文献中所述：lee等人，(1988)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241和miki等人，(1990)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]80：449。还参见，美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824以及国际公开wo96/33270，其通过引用整体并入文中。(b)草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(epsp)和aroa基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(pat)和吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶(bar)基因)、以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(acc酶抑制剂编码基因)。参见，例如shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了epsps形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码epsps酶的基因。还参见，美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876b1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114b1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e和5,491,288以及国际公开ep1173580；wo01/66704；ep1173581和ep1173582，其通过引用整体并入文中。还对表达编码草甘磷氧化还原酶的基因的植物赋予草甘磷抗性，这在美国专利号5,776,760和5,463,175(其通过引用整体并入文中)中进行了更全面地描述。另外，可通过过量表达编码草甘磷n-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利申请公开号2004/0082770，wo03/092360和wo05/012515，所述专利通过引用整体并入文中。编码突变aroa基因的dna分子可以在atcc登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开于comai的美国专利号4,769,061中，将该文献通过引用整体并入文中。kumada等人的欧洲专利申请号0333033和goodman等人的美国专利号4,975,374公开了赋予除草剂(如l-草丁膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，所述文献通过引用整体并入文中。leemans等人的欧洲专利号0242246和0242236、以及degreef等人，(1989)bio/technology[生物/技术]7：61(其描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生)提供了草丁膦-乙酰基-转移酶基因的核苷酸序列，所述文献通过引用整体并入文中。还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616b1和5,879,903，所述专利通过引用整体并入文中。赋予苯氧基丙酸和环己酮(例如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是acc1-s1、acc1-s2和acc1-s3基因，其描述于以下文献中：marshall等人，(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]83：435，其通过引用整体并入文中。(c)抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psba基因和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。przibilla等人，(1991)plantcell[植物细胞]3：169描述了用编码突变体psba基因的质粒对衣藻进行的转化，将该文献通过引用以其全文结合在此。stalker的美国专利号4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的dna分子可在atcc登录号53435、67441和67442下获得，将该文献通过引用以其全文并入本文。编码谷胱甘肽s-转移酶的dna的克隆和表达描述于hayes等人，(1992)biochem.j.[生物化学杂志]285：173中，将该文献通过引用以其全文结合在此。(d)乙酰羟酸合酶，已经发现其使表达该酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性，已经被引入到各种植物中(参见，例如，hattori等人，(1995)molgengenet.[分子和普通遗传学]246：419，将该文献通过引用以其全文结合在此)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素p4507a1和酵母nadph-细胞色素p450氧化还原酶嵌合蛋白的基因(shiota等人，(1994)plantphysiol.[植物生理学]106(1)：17-23)、谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(aono等人，(1995)plantcellphysiol[植物与细胞生理学]36：1687)、和各种磷酸转移酶的基因(datta等人，(1992)plantmolbiol[植物分子生物学]20：619)，它们通过引用整体并入文中。(e)原卟啉原氧化酶(protox)是叶绿素的生成所必需的，而叶绿素是所有植物存活所必需的。原卟啉原氧化酶用作多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。对这些除草剂具有抗性的、含有经改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的开发描述于以下文献中：美国专利号6,288,306b1；6,282,837b1和5,767,373；以及国际公开号wo01/12825，所述文献通过引用整体并入文中。3.赋予或贡献于改变的谷物特征的性状基因，例如：(a)改变的脂肪酸，例如，通过以下方式：(1)下调硬脂酰-acp去饱和酶以提高植物的硬脂酸含量。参见，knultzon等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：2624和wo99/64579(genesfordesaturasestoalterlipidprofilesincorn[改变玉米中脂质谱的去饱和酶的基因])，所述文献通过引用以其全文结合在此，(2)通过fad-2基因修饰升高油酸和/或通过fad-3基因修饰降低亚麻酸(参见，美国专利号6,063,947、6,323,392、6,372,965和wo93/11245，所述文献通过引用整体并入文中)；(3)改变共轭的亚麻酸或亚油酸含量，如wo01/12800中，将该文献通过引用整体并入文中；(4)改变lec1、agp、dek1、superal1、milps、各种ipa基因(如lpa1、lpa3、hpt或hggt)。例如，参见，wo02/42424、wo98/22604、wo03/011015，美国专利号6,423,886、美国专利号6,197,561、美国专利号6,825,397，美国专利申请公开号2003/0079247、2003/0204870，wo02/057439、wo03/011015以及rivera-madrid等人，(1995)proc.natl.acad.sci.[美国科学院院报]92：5620-5624，其通过引用整体并入文中。(b)改变的磷含量，例如，通过(1)引入植酸酶编码基因将促进植酸盐的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸根。例如，参见vanhartingsveldt等人，(1993)gene[基因]127：87，该文献公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列，其通过引用整体并入文中。(2)上调降低植酸盐含量的基因。在玉米中，这例如可通过以下方式来实现：将与一种或多种等位基因如lpa等位基因(在以低水平植酸为特征的玉米突变株中鉴定到)相关的dna进行克隆并再引入，如raboy等人，(1990)maydica[美迪卡杂志]35：383中所述，和/或通过改变肌醇激酶活性，如wo02/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、wo03/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、wo99/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、wo2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、wo98/45448、wo99/55882、wo01/04147中所述，所述文献通过引用整体并入文中。(c)例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因，或改变硫氧还蛋白如ntr和/或trx(参见，美国专利号6,531,648，将该文献通过引用整体并入文中)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体如cs27或tusc27或en27的基因(参见，美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488和2005/0204418，将这些文献通过引用整体并入文中)来产生改变的碳水化合物。参见，shiroza等人，(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]170：810(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，steinmetz等人，(1985)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，pen等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：292(表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物的产生)，elliot等人，(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，等人，(1993)j.biol.chem.[生物化学杂志]268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)以及fisher等人，(1993)plantphysiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶ii)，wo99/10498(通过修饰udp-d-木糖4-差向异构酶、fragile1和2、ref1、hchl、c4h改进消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平生产高油种子的方法(agp))，其通过引用整体并入文中。以上提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。(d)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见涉及通过改变植基异戊烯基转移酶(ppt)来操纵抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和wo00/68393，涉及通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)来操纵抗氧化剂水平的wo03/082899，所述文献通过引用整体并入文中。(e)改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸的积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸的积累的二元方法)、美国专利号5,990,389(高赖氨酸)、wo99/40209(改变种子中氨基酸组成)、wo99/29882(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(改变种子中氨基酸组成)、wo98/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物色氨酸合酶β亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、wo98/56935(植物氨基酸生物合成酶)、wo98/45458(具有较高百分比的必需氨基酸的工程化的种子蛋白)、wo98/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有含可编程水平的必需氨基酸的限定的结构的合成储存蛋白，用于改进植物的营养价值)、wo96/01905(苏氨酸增加)、wo95/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、wo01/79516和wo00/09706(cesa：纤维素合酶)、美国专利号6,194,638(半纤维素)、美国专利号6,399,859和美国专利申请公开号2004/0025203(udpgdh)、美国专利号6,194,638(rgp)，所述文献通过引用整体并入文中。在可用于本文公开的方法的表达盒中可包括另外的基因。非限制性实例包括：a.创建用于位点特异性dna整合的位点的基因这包括引入可以在flp/frt系统中使用的frt位点和/或可以在cre/loxp系统中使用的lox位点。例如，参见lyznik等人，(2003)plantcellrep[植物细胞报告]21：925-932和wo99/25821，将这些文献通过引用整体并入文中。可以使用的其他系统包括噬菌体mu的gin重组酶(maeser等人，1991；vickichandler，themaizehandbook[玉米手册]第118章(施普林格出版社，1994))、大肠杆菌的pin重组酶(enomoto等人，1983)和psr1质粒的r/rs系统(araki等人，1992)，所述文献通过引用整体并入文中。b.影响非生物胁迫抗性(包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮响应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性)和胁迫下产量提高的基因。例如，参见，wo00/73475，其中通过改变苹果酸来改变水分利用效率；美国专利号5,892,009、美国专利号5,965,705、美国专利号5,929,305、美国专利号5,891,859、美国专利号6,417,428、美国专利号6,664,446、美国专利号6,706,866、美国专利号6,717,034、wo2000060089、wo2001026459、wo2001035725、wo2001034726、wo2001035727、wo2001036444、wo2001036597、wo2001036598、wo2002015675、wo2002017430、wo2002077185、wo2002079403、wo2003013227、wo2003013228、wo2003014327、wo2004031349、wo2004076638、wo9809521和wo9938977，其描述了基因，包括有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响，以及赋予对植物表型的其他积极影响的cbf基因和转录因子；美国专利申请公开号2004/0148654和wo01/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改善的植物表型，如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性；wo2000/006341、wo04/090143、美国专利申请序列号10/817483和美国专利号6，992，237，其中细胞分裂素表达被修饰，导致植物具有增加的胁迫耐受性，例如干旱耐受性和/或增加的产量，其通过引用整体并入文中。还参见wo0202776、wo2003052063、jp2002281975、美国专利号6,084,153、wo0164898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(氮利用率的提高和氮响应性的改变)，所述文献通过引用整体并入文中。关于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和wo200032761，所述文献通过引用整体并入文中。关于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见例如美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852，所述文献通过引用整体并入文中。c.影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的其他基因和转录因子可被引入或渗入到植物中，参见例如wo97/49811(lhy)、wo98/56918(esd4)、wo97/10339和美国专利号6，573，430(tfl)、美国专利号6，713，663(ft)、wo96/14414(con)、wo96/38560、wo01/21822(vrn1)、wo00/44918(vrn2)、wo99/49064(gi)、wo00/46358(fri)、wo97/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(gai)、wo99/09174(d8和rht)以及wo2004076638和wo2004031349(转录因子)，所述文献通过引用整体并入文中。如本文所用，“反义方向”包括以反义链转录的方向与启动子可操作地连接的多核苷酸序列。反义链与内源转录产物充分互补，这样使得内源转录产物的翻译经常被抑制。“可操作地连接”是指两个或更多个核酸片段在单个核酸片段上的缔合，这样使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接到调控序列上。可操作地连接到用于本文所公开的方法的启动子及其相关生物活性片段或变体的异源核苷酸序列可以是靶基因的反义序列。术语“反义dna核苷酸序列”是指与该核苷酸序列的5′至3′正常方向相反的方向的序列。当反义dna序列被递送到植物细胞中时，其阻止了靶向的基因的dna核苷酸序列的正常表达。反义核苷酸序列编码rna转录物，所述rna转录物与通过靶向的基因的dna核苷酸序列的转录产生的内源信使rna(mrna)互补并能够杂交。在这种情况下，抑制了由靶向的基因编码的天然蛋白的产生，以实现所需的表型应答。可以对该反义序列作出修饰，只要该序列与相应的mrna杂交并干扰相应的mrna的表达。在该方式中，可以使用与相应的反义序列具有70％、80％、85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可以用来破坏该靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或更多个核苷酸的序列。因此，启动子可以可操作地连接到反义dna序列，以降低或抑制天然蛋白在通过本文公开的方法转化的植物中的表达。“rnai”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利号6,506,559，通过引用整体并入文中)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些名称包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义rna转录物，以及“共抑制”或“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义rna转录物(美国专利号5,231,020，将其通过引用整体并入文中)。此类技术依赖于使用能导致积累这样的双链rna的构建体，该双链rna中的一条链与待沉默的靶基因互补。如本文所用，术语“启动子”或“转录起始区”意为dna调节区，其通常包含tata盒或能够指导rna聚合酶ii在特定编码序列的适当的转录起始位点起始rna合成的dna序列。启动子可以另外地包含通常位于tata盒上游或5′的其他识别序列或能够指导rna聚合酶ii起始rna合成的dna序列，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。转录起始区即启动子可以对于宿主是天然的、或同源的、或外源的、或异源的，或者可以是天然序列或合成序列。外源意指转录起始区未见于该转录起始区引入到其中的野生型宿主中。就目的编码序列而言，可以使用天然或异源启动子。转录(表达)盒将在转录的5′-3′方向上包含转录和翻译起始区、目的dna序列/性状基因以及在植物中起作用的转录和翻译终止区。终止区可以与转录起始区一起是天然的，可以与目的dna序列一起是天然的，或者可以衍生自另一个来源。方便的终止区可从马铃薯蛋白酶抑制剂(pinii)基因或来自根瘤农杆菌的ti-质粒的序列获得，例如胭脂碱合酶、章鱼碱合酶和蛋白石(opaline)合酶终止区。还参见guerineau等人(1991)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；proudfoot(1991)cell64：671-674；sanfacon等人(1991)genesdev.5：141-149；mogen等人(1990)plantcell2：1261-1272；munroe等人(1990)gene91：151-158；ballas等人(1989)nucleicacidsres.17：7891-7903；joshi等人(1987)nucleicacidres.15：9627-9639。表达盒可另外在表达盒构建体中包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域是已知的，并且包括：微小rna病毒前导序列，例如emcv前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(elroy-stein，o.，fuerst，t.r.，和moss，b.(1989)pnasusa[美国国家科学院院刊]，86：6126-6130)；马铃薯y病毒组前导序列，例如tev前导序列(烟草蚀刻病毒)(allison等人(1986)；mdmv前导序列(玉米矮花叶病毒)；virology[病毒学]，154：9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)(macejak，d.g.，和p.sarnow(1991)nature[自然]，353：90-94)；苜蓿花叶病毒外壳蛋白marna(amvrna4)的未翻译前导序列(jobling，s.a.，和gehrke，l.，(1987)nature[自然]，325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(tmv)(gallie等人(1989)molecularbiologyofrna[rna的分子生物学]，第237-256页，gallie等人(1987)nucl.acidsres.[核酸研究]15：3257-3273)；玉米褪绿斑驳病病毒前导序列(mcmv)(lornmel，s.a.等人(1991)virology[病毒学]，81：382-385)。还参见，della-cioppa等人(1987)plantphysiology[植物生理学]，84：965-968；以及内源性玉蜀黍5′未翻译序列。也可以使用已知增强翻译和增强mrna稳定性的其他方法，例如内含子，如玉米泛素内含子(christensen和quail，(1996)transgenicres.[转基因研究]5：213-218；christensen等人，(1992)plantmolecularbiology[植物分子生物学]18：675-689)或者玉米adhi内含子(kyozuka等人，(1991)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]228：40-48；kyozuka等人，(1990)maydica[美迪卡杂志]35：353-357)等，所述文献通过引用整体并入本文。表达盒可以含有一个或多于一个基因或核酸序列，以在转化植物中转移和表达。因此，每个核酸序列将被可操作地连接到5′和3′调控序列。可替代地，可以提供多个表达盒。在制备用于本公开方法的表达盒时，可以操作各种dna片段，以提供处于适当取向以及合适时，处于适当阅读框中的dna序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接dna片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的dna、去除限制性位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。通过所公开的方法引入外植体中的目的形态发生基因和/或性状基因/多核苷酸可以可操作地连接到合适的启动子。“植物启动子”是能够启动植物细胞内的转录的启动子(无论其起源是否是植物细胞)。示例性植物启动子包括但不局限于从植物、植物病毒以及包含在植物细胞中表达的基因的细菌(如来自农杆菌属或根瘤菌属)获得的那些启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织(如叶、根或种子)中启动转录的启动子。这样的启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中启动转录的启动子被称为“具有组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。组织特异性启动子、组织优选启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成了“非组成型”启动子的类别。“诱导型”或“阻抑型”启动子可以是在环境或外源控制下的启动子。可影响由诱导型启动子进行的转录的环境条件实例包括厌氧条件、或某些化学品、或光的存在。可替代地，可以通过提供合适的化学品或其他试剂来影响诱导型或阻抑型启动子的外源控制，所述化学品或其他试剂经由与靶多肽相互作用导致对启动子的诱导或抑制。诱导型启动子包括热诱导型启动子、雌二醇应答性启动子、化学诱导型启动子等。病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(pr蛋白)的那些启动子，其在被病原体感染后被诱导；例如，pr蛋白、sar蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如redolfi等人(1983)neth.j.plantpathol.[植物病理学杂志]89：245-254；uknes等人，(1992)plantcell[植物细胞]4：645-656和vanloon，(1985)plantmol.virol.[植物分子病毒学]4：111-116。可用于本发明方法的诱导型启动子包括glb1、ole、ltp2、hsp17.7、hsp26、hsp18a和xve启动子。化学诱导型启动子可以被四环素阻遏物(tetr)、乙苯磺隆阻遏物(esr)或氯磺隆阻遏物(csr)阻遏，并且在添加四环素相关配体或磺酰脲配体后会发生去阻遏作用。阻遏物可以是tetr，四环素相关的配体是强力霉素或脱水四环素。(gatz，c.，frohberg，c.和wendenburg，r.(1992)在完整转基因烟草植物中，四环素对修饰的camv35s启动子的严格抑制和均质去阻遏，plantj.[植物杂志]2，397-404)。可替代地，阻遏物可以是esr，并且磺酰脲配体是乙磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘甲磺隆，氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲基二磺隆或氯吡嘧磺隆(us20110287936通过引用整体并入本文)。如果阻遏物是csr，则csr配体是氯磺隆。参见美国专利号8,580,556，其通过引用整体并入本文。“组成型”启动子是在大多数条件下有活性的启动子。用于本公开的启动子包括在wo2017/112006中公开的那些和在美国临时申请62/562,663中公开的那些。用于在植物中表达基因的组成型启动子是本领域已知的。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒的35s启动子(depicker等人(1982)mol.appl.genet.[分子与应用遗传学]1：561-573；odell等人(1985)nature[自然]313：810-812)、泛素启动子(christensen等人(1992)plantmol.biol.[植物分子生物学]18：675-689)、来自诸如二磷酸核酮糖羧化酶的基因的启动子(dealmeida等人(1989)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]218：78-98)、肌动蛋白(mcelroy等人(1990)plantj.[植物杂志]2：163-171)、组蛋白、dnaj(baszczynski等人(1997)maydica[美迪卡杂志]42：189-201)等。在各个方面，可用于本公开方法的组成型启动子包括ubi、lldav、evcv、dmmv、bsv(ay)pro、cymvprofl、ubizmpro、si-ub3pro、sb-ubipro(alt1)、usb1zmpro、zm-gos2pro、zm-h1bpro(1.2kb)、in2-2、nos、-135版本的35s和zm-adfpro(alt2)启动子。在下表4中列出的可用于本公开的启动子包括在美国专利申请公开号2017/0121722和美国专利号8,710,206中公开的那些，其通过引用整体并入本文。表4.名称描述zm-pltp玉蜀黍pltp启动子sb-pltp1两色高粱pltp1启动子zm-fbp1果糖-1，6-二磷酸酶的玉蜀黍启动子zm-rfpnad(p)-结合rossmann-折叠蛋白的玉蜀黍启动子zm-apmp脂肪细胞质膜相关蛋白样蛋白的玉蜀黍启动子zm-rfesprieske[2fe-2s]铁硫结构域蛋白的玉蜀黍启动子zm-crr6氯呼吸减少6基因的玉蜀黍启动子zm-glykd-甘油酸3-激酶，叶绿体样蛋白基因的玉蜀黍启动子zm-cab7叶绿素a-b结合蛋白7，叶绿体样蛋白的玉蜀黍启动子zm-ubr紫外线b阻遏蛋白基因的玉蜀黍启动子zm-hbpsoul血红素结合家族蛋白的玉蜀黍启动子zm-psan光系统i反应中心亚基psi-n的玉蜀黍启动子zm-sdr短链脱氢酶/还原酶的玉蜀黍启动子axig1axig1启动子dr5dr5启动子zm-pltp1玉蜀黍pltp1启动子zm-pltp2玉蜀黍pltp2启动子sb-pltp2两色高粱pltp2启动子sb-pltp3两色高粱pltp3启动子si-pltp1小米pltp启动子os-pltp1稻pltp启动子eos-pltp2稻pltp2启动子zm-lglpro乳酰谷胱甘肽裂解酶基因的玉蜀黍启动子zm-lea14-apro编码晚胚性丰富蛋白lea-14-a的基因的玉蜀黍启动子zm-lea34-dpro编码晚胚性丰富蛋白lea34-d的基因的玉蜀黍启动子zm-sdrpro(长)短链脱氢酶/还原酶的玉蜀黍启动子(长)os-sdrpro短链脱氢酶/还原酶的稻启动子sb-sdrpro短链脱氢酶/还原酶的两色高粱启动子gm-ef1apro大豆ef1a启动子下表5中列出了可用于本公开方法的其他启动子。表5.如本文所用，术语“调控元件”也指dna序列，所述dna序列通常但不总是在结构基因的编码序列上游(5’)，所述dna序列包括通过以下方式控制编码区表达的序列：提供对从特定位点开始转录所需的rna聚合酶和/或其他因子的识别。提供对rna聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点起始的调节元件的实例是启动子元件。启动子元件包括负责转录起始的核心启动子元件，以及修饰基因表达的其他调节元件。应理解，位于编码区序列的内含子内或编码区序列3′的核苷酸序列也可有助于调节目的编码区的表达。合适的内含子的实例包括但不限于玉米ivs6内含子或玉米肌动蛋白内含子。调节元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)、或转录的区域内、或两者处的元件。在本公开方法的上下文中，转录后调节元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子以及mrna稳定性决定子。在本公开全文中使用的“异源核苷酸序列”、“目的异源多核苷酸”、“异源多核苷酸”或“异源性状基因”是与本发明的启动子序列不是天然地一起存在的或是与启动子可操作地连接的序列。虽然这种核苷酸序列或性状基因对启动子序列来说是异源的，但相对植物宿主，可以是同源的或天然的、或者异源的、或者外来的。同样，启动子序列对于植物宿主和/或目的多核苷酸可以是同源的或天然的或异源的或外来的。用于本公开方法的dna构建体/表达盒还可根据需要包含其他增强子(翻译或转录增强子)。这些增强子区域是本领域技术人员众所周知的，并且可以包括atg起始密码子和相邻序列。起始密码子必须与编码序列的阅读框同相，以确保翻译整个序列。翻译控制信号和起始密码子可以来自天然和合成的多种来源。可以从转录起始区的来源或从结构基因提供翻译起始区。所述序列也可以衍生自被选择以表达所述基因的调控元件，并且可以被特异性修饰以增加mrna的翻译。应认识到，为提高转录水平，可将增强子与启动子区域结合使用。应认识到，为提高转录水平，可将增强子与启动子区域结合使用。增强子是发挥作用以增加启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括sv40增强子区、35s增强子元件等。还知道一些增强子还可以改变正常的启动子表达模式，例如通过引起启动子组成型表达，当不具有增强子时同一启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中表达。下表6中列出了可用于本公开方法的增强子。表6.通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达旨在是指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反地，强启动子以高水平或以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。公认的是，用于本公开方法的序列可以与其天然编码序列一起使用，从而导致转化的植物的表型改变。本文公开的形态发生基因和目的基因以及其变体和片段可用于本公开的用于任何植物的遗传操作的方法。术语“可操作地连接的”，意指异源核苷酸序列的转录或翻译受启动子序列的影响。在本公开的一个方面，表达盒包含可操作地连接到形态发生基因和/或异源核苷酸序列的转录起始区或其变体或其片段。这种表达盒可具有多个限制位点，用于使插入该核苷酸序列的过程受调节区的转录调节。表达盒可另外含有选择性标记基因以及3’终止区。表达盒在转录的5′-3′方向上可包含转录起始区(即启动子或其变体或片段)、翻译起始区、形态发生基因和/或目的异源核苷酸序列、翻译终止区，并且任选地包含在宿主生物中有功能的转录终止区。用于本公开方法的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)，形态发生基因和/或目的多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。可替代地，这些调节区，形态发生基因和/或目的多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，关于序列的“异源性”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的形态发生基因可以是天然的和/或对于可操作地连接的目的dna序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可能源自另一种来源(即，对于启动子、形态发生基因和/或被表达的dna序列、植物宿主或其任何组合来说为外源的或异源的)。方便的终止区可获得自根癌农杆菌(a.tumefaciens)的ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见guerineau等人(1991)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；proudfoot，(1991)cell[细胞]64：671-674；sanfacon等人，(1991)genesdev.[基因与发育]5：141-149；mogen等人，(1990)plantcell[植物细胞]2：1261-1272；munroe等人，(1990)gene[基因]91：151-158；ballas等人，(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：7891-7903；以及joshi等人，(1987)nucleicacidres.[核酸研究]15：9627-9639；所述文献通过引用整体并入文中。包含可操作地连接到形态发生基因和/或任选地进一步可操作地连接到异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸、异源多核苷酸核苷酸、目的序列或性状基因的启动子的表达盒可用于转化任何植物。替代地，可操作地连接到启动子的目的异源多核苷酸，异源多核苷酸核苷酸，目的序列或性状基因可以位于转移dna(t-dna)外部的单独的表达盒上。以此方式，可以获得经基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。包含本公开的序列的表达盒还可含有针对基因、异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸或要共转化入生物体的异源多核苷酸的至少一个另外的核苷酸序列。可替代地，所述一个或多个另外的核苷酸序列可以在另一表达盒中提供。在适当的情况下，可以对其表达要在启动子序列和任何其他核苷酸序列控制下的核苷酸序列/性状基因进行优化，以提高在转化植物中的表达。也就是说，可使用植物偏好性密码子来合成这些核苷酸序列，从而改进表达。参见，例如，campbell和gowri，(1990)plantphysiol.[植物生理学]92：1-11，其通过引用整体并入文中，用于讨论宿主优选的密码子使用。本领域中可获得用于合成植物偏好性基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831，5,436,391以及murray，等人，(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：477-498，所述文献通过引用整体并入文中。已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将异源核苷酸序列的g-c含量调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mrna结构。如本文所用，“载体”是指用于将核苷酸构建体例如表达盒引入宿主细胞的dna分子，例如质粒、粘粒或细菌噬菌体。克隆载体典型地含有一个或少量限制性内切核酸酶识别位点，可以以可确定的方式在所述位点插入外来dna序列而不会丧失所述载体的基本生物学功能，以及插入适用于鉴定和选择克隆载体转化的细胞的标记基因。标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，mccormick，等人，(1986)plantcellreports[植物细胞报道]5：81-84，通过引用整体并入文中。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的表达的所得子代。可以生长两代或两代以上以确保希望的表型特征的表达稳定保持并且遗传，然后收获种子以确保希望的表型特征已经实现表达。以这种方式，本公开提供了转化种子(也称为“转基因种子”)，其具有稳定地并入其基因组中的可用于本公开方法的核苷酸构建体，例如，可用于本公开方法的表达盒。有各种各样的方法用于从植物组织再生植物。特定的再生方法将取决于起始植物组织和待再生的特定植物种类。从单个植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、发育和培养植物是本领域众所周知的(weissbach和weissbach，(1988)在：methodsforplantmolecularbiology[植物分子生物学方法]，(编辑.)，学术出版社公司(academicpress，inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥，通过引用整体并入文中)。这种再生和生长过程通常包括如下步骤：选择经转化的细胞，通过胚性发育的通常阶段、通过生根苗阶段培养那些个体化细胞。以同样的方式再生转基因胚和种子。然后将所得的转基因生根芽苗种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。优选地，再生植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反地，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法培养通过本公开方法产生的含有所需目的多核苷酸的转基因植物。用于在植物基因组的具体位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见例如，wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，所述文献通过引用整体并入文中。简而言之，侧翼为两个不相同重组位点的目标多核苷酸可包含在t-dna转移盒中。将t-dna转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。所公开的方法可用于向外植体中引入多核苷酸，所述多核苷酸用于靶向源自植物细胞的植物的基因组中的特定位点以进行修饰。可以用所公开的方法引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等。例如，所公开的方法可以用于将crispr-cas系统引入植物细胞或植物中，以用于以下目的：对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所公开的方法可以与crispr-cas系统一起使用以提供用于修饰或改变在植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。所述cas内切核酸酶基因是植物优化的cas9内切核酸酶，其中植物优化的cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。所述cas内切核酸酶由指导核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将所述双链断裂引入细胞的基因组中。所述crispr-cas系统提供用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。进一步提供了使用指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的方法，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和编辑细胞基因组中的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定出基因组靶位点，就可以采用多种方法来进一步修饰靶位点，这样使得它们包含多种目的多核苷酸。所公开的方法可以用于引入crispr-cas系统，所述系统用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由cas内切核酸酶识别的靶位点内部或外部。crispr基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(叉称spidr-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的dna基因座的家族。crispr基因座由部分回文的短而高度保守的dna重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为crispr重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于crispr基因座(wo2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。crispr基因座首先在大肠杆菌中被识别(ishino等人(1987)j.bacterial.[细菌杂志]169：5429-5433；nakata等人(1989)j.bacterial.[细菌杂志]171：3553-3556)。类似的散布的短序列重复序列已在地中海嗜盐杆菌、化脓性链球菌、鱼腥藻和结核分枝杆菌中得到鉴定(groenen等人(1993)mol.microbiol.[分子微生物学]10：1057-1065；hoe等人(1999)emerg.infect.dis.[新发传染病]5：254-263；masepohl等人(1996)biochim.biophys.acta[生物物理法]1307：26-30；mojica等人(1995)mol.microbiol.[分子微生物学]17：85-93)。该crispr基因座与其他ssr的不同之处在于重复序列的结构，该结构已经称为短规律间隔重复序列(srsr)(janssen等人(2002)omicsj.integ.biol.[组学：整合生物学杂志]6：23-33；mojica等人(2000)mol.microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。重复序列是以成簇形式发生的短元件，这些短元件总是由以恒定长度的可变序列规律地间隔开(mojica等人(2000)mol.microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。cas基因包括通常与侧翼crispr基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“cas基因”和“crispr相关的(cas)基因”在本文中可互换地使用。对cas蛋白家族的全面综述呈现于以下文献中：haft等人(2005)computationalbiology[计算生物学]，ploscomputbiol[科学公共图书馆计算生物学]1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060。除了最初描述的四个基因家族之外，在美国专利申请公开号2015/0059010中已经描述了另外41个crispr相关(cas)基因家族，该专利通过引用并入文中。此参考文献表明crispr系统属于不同类别，具有不同的重复模式、基因的组和种类范围。在给定的crispr基因座处的cas基因数目在物种之间可以不同。cas内切核酸酶涉及由cas基因编码的cas蛋白质，其中所述cas蛋白质能够将双链断裂引入dna靶序列中。cas内切核酸酶由指导多核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将所述双链断裂引入细胞的基因组中。如本文所用，术语“指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统”包括能够将双链断裂引入dna靶序列的cas内切核酸酶和指导多核苷酸的复合物。当由指导核苷酸识别靶序列时，cas内切核酸酶紧邻基因组靶位点解开dna双链体，并且切割两个dna链，但前提是正确的前间区序列邻近基序(pam)被大致定向在靶序列的3’端(参见美国专利申请公开号2015/0059010的图2a和图2b)。在一个方面中，该cas内切核酸酶基因是cas9内切核酸酶，例如但不限于，于2007年3月1日公开的wo2007/025097(通过引用并入本文)中的seqidno：462、474、489、494、499、505、以及518中列出的cas9基因。在另一方面，cas内切核酸酶基因是植物、玉蜀黍或大豆优化的cas9内切核酸酶，例如但不限于美国专利申请公开号2015/0059010的图1a中显示的那些。在另一方面，cas内切核酸酶基因可操作地连接到cas密码子区域上游的sv40核靶向信号和cas密码子区域下游的二分型vird2核定位信号(tinland等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：7442-6)。在一方面，cas核酸内切酶基因是美国专利申请公开号2015/0059010的seqidno：1、124、212、213、214、215、216、193或seqidno：5的核苷酸2037-6329的cas9核酸内切酶基因，或其任何功能片段或变体。关于cas内切核酸酶，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。关于cas内切核酸酶，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。在一个方面，cas内切核酸酶基因是可以识别n(12-30)ngg型的任何基因组序列并且原则上是可以靶向的植物密码子优化的酿脓链球菌cas9基因。内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割dna而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括i型、ii型、iii型、和iv型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在i型和iii型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(he酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点通常更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请pct/us12/30061)。基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，所述家族是laglidadg、giy-yig、h-n-h、和his-cysbox家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其dna底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的orf、内含子、和内含肽编码的酶的前缀f-、i-、或pi-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在所述识别位点附近的多核苷酸切割。该切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见，sauer(1994)curropbiotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及sadowski(1993)faseb[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(integrase)或解离酶(resolvase)家族。tal效应子核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其可以被用于在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(miller，等人(2011)naturebiotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(zfn)是由锌指dna结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，所述锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。zfn包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自ms型内切核酸酶，例如fokl的核酸酶结构域)的工程化dna结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活子结构域、转录抑制子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶dna中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于所述核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。本文所用的“dead-cas9”(dcas9)用于提供转录阻遏物结构域。dcas9已发生突变，因此无法再切割dna。dcas0在被grna引导至序列时仍然可以结合，也可以与阻遏物元件融合(参见gilbert等人，cell[细胞]2013年7月18日；154(2)：442-451，kiani等人，2015年11月naturemethods[自然方法]第12卷第11号：1051-1054)。如本文所述，融合至阻遏物元件的dcas9缩写为dcas9～rep，其中阻遏物元件(rep)可以是已在植物中表征的任何已知阻遏物基序(综述参见kagale与rozxadowski，20010plantsignaling&behavior[植物信号与行为]5：6，691-694)。表达的指导rna(grna)与dcas9～rep蛋白结合，并靶向dcas9-rep融合蛋白与启动子(t-dna内的启动子)内特定的预定核苷酸序列的结合。例如，如果使用zm-ubipro：：dcas9～rep：：piniiterm盒和u6-polpro：：grna：：u6term盒将其表达在边界外，且grna被设计成指导dcas9-rep蛋白以结合t-dna内表达盒sb-ubipro：：mopat：：piniiterm中的sb-ubi启动子，任何整合了边界外序列的事件对双丙氨膦具有敏感性。仅整合t-dna的转基因事件将表达mopat，并且对双丙氨磷具有抗性。使用与阻遏物融合的dcas9蛋白(与tetr或esr相反)的优点是能够将这些阻遏物靶向t-dna内的任何启动子。tetr和esr仅限于同源操纵子结合序列。替代地，可以使用与阻遏物结构域融合的合成的锌指核酸酶代替grna和dcas9～rep(urritia等人，2003，genomebiol.[基因组生物学]4：231)，如上所述。细菌和古细菌已经发展了适应性免疫防御，称为使用短rna直接降解外来核酸的规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)/crispr相关(cas)系统(wo2007/025097，2007年3月1日公开)。来自细菌的ii型crispr/cas系统采用crrna和tracrrna将cas内切核酸酶指导至其dna靶。该crrna(crisprrna)包含与双链dna靶的一条链互补，并且与tracrrna(反式激活crisprrna)碱基配对形成rna双链体的区域，该rna双链体引导cas内切核酸酶切割dna靶。如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个rna分子-包含可变靶向结构域的crrna(crisprrna)和tracrrna的合成性融合。在一方面，所述指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与cas内切核酸酶相互作用的rna片段。如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得cas内切核酸酶能够识别并任选地切割dna靶位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是rna序列、dna序列或其组合(rna-dna组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(lna)、5-甲基dc、2,6-二氨基嘌呤、2′-氟代a、2′-氟代u、2′-o-甲基rna、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。指导多核苷酸可以是双分子(也被称为双链体指导多核苷酸)，其包含与靶dna中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(被称为可变靶向结构域或vt结构域)和与cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(被称为cas内切核酸酶识别结构域或cer结构域)。双分子指导多核苷酸的cer结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是rna、dna和/或rna-dna组合序列。在一方面，包含连接到cer结构域的vt结构域的双链体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crdna”(当由dna核苷酸的连续延伸构成时)或“crrna”(当由rna核苷酸的连续延伸构成时)或“crdna-rna”(当由dna和rna核苷酸的组合构成时)。所述cr核苷酸可以包含天然存在于细菌和古细菌中的crna的片段。在一方面，存在于本文披露的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的crna片段的大小可以是但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一方面，包含cer结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrrna”(当由rna核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrdna”(当由dna核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrdna-rna”(当由dna和rna核苷酸的组合构成时。在一方面，指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。指导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶dna中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或vt结构域)和与cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为cas内切核酸酶识别结构域或cer结构域)。“结构域”意指可以为rna、dna和/或rna-dna组合序列的核苷酸的连续延伸。单指导多核苷酸的vt结构域和/或cer结构域可以包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列。在一方面，单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含cer结构域)的cr核苷酸(包含与cer结构域连接的vt结构域)，其中所述连接是包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列的核苷酸序列。包含来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列的单指导多核苷酸可以被称为“单指导核苷酸”(当由rna核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导dna”(当由dna核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导核苷酸-dna”(当由rna和dna核苷酸的组合构成时)。在本公开的一方面，单指导核苷酸包含可以与ii型cas内切核酸酶形成复合物的ii型crispr/cas系统的crna或crna片段和tracrrna或tracrrna片段，其中所述指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是，为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。术语“可变靶向结构域”或“vt结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链dna靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(vt结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一方面，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列或其任何组合构成。术语指导多核苷酸的“cas内切核酸酶识别结构域”或“cer结构域”在此可互换地使用，并且包括与cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。cer结构域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列(参见例如本文所述的修饰)或其任何组合构成。连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列。在一方面，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸的长度。在另一方面，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于gaaa四核苷酸环序列。指导多核苷酸、vt结构域和/或cer结构域的核苷酸序列修饰可以选自但不限于由以下各项组成的组：5′帽、3′聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsrna双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(lna)、5-甲基dc核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟代a核苷酸、2′-氟代u核苷酸、2′-o-甲基rna核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修改的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。在一个方面，该指导核苷酸和cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使得cas内切核酸酶能够在dna靶位点引入双链断裂。在本公开的一方面中，可变靶结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在本公开的一方面，指导核苷酸包含ii型crispr/cas系统中的可以与ii型cas内切核酸酶形成复合物的crna(或crna片段)和tracrrna(或tracrrna片段)，其中所述指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。在一方面，还可以通过引入重组dna分子间接地引入指导核苷酸，所述重组dna分子包含可操作地连接到植物特异性启动子的相应指导dna序列，所述植物特异性启动子能够在植物细胞中转录所述指导核苷酸。术语“相应指导dna”包括与rna分子相同的，但其中“t”取代rna分子的每个“u”的dna分子。在一方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组dna构建体的农杆菌转化的方法来引入所述指导核苷酸，所述重组dna构建体包含可操作地连接到植物u6聚合酶iii启动子的相应指导dna。在一方面，指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。使用指导核苷酸对比双链体crrna-tracrrna的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。术语“靶位点”、“靶序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体dna和线粒体dna)中的多核苷酸序列，在所述多核苷酸序列处通过cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点可以发现于异源基因组位置中。如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。在一方面，所述靶位点可以相似于由双链断裂诱导剂，例如lig3-4内切核酸酶(美国专利申请公开号2009/0133152)或ms26++大范围核酸酶(美国专利申请公开号2014/0020131)特异性识别和/或结合的dna识别位点或靶位点。“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物基因组中的靶序列。此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列：所述靶序列当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一方面，所公开的方法可用于向植物中引入用于植物中靶基因的基因抑制的多核苷酸。对于植物基因工程的几个方面来说，降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)是所希望的。用于基因沉默的许多技术是本领域技术人员熟知的，包括但不限于反义技术(参见，例如，sheehy等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]85：8805-8809；以及美国专利号5,107,065；5,453,566；和5,759,829)；共抑制(例如，taylor(1997)plantcell[植物细胞]9：1245；jorgensen(1990)trendsbiotech.[生物技术趋势]8(12)：340-344；flavell(1994)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]91：3490-3496；finnegan等人(1994)bio/technology[生物/技术]12：883-888；以及neuhuber等人(1994)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]244：230-241)；rna干扰(napoli等人(1990)plantcell[植物细胞]2：279-289；美国专利号5,034,323；sharp(1999)genesdev.[基因与发育]13：139-141；zamore等人(2000)cell[细胞]101：25-33；javier(2003)nature[自然]425：257-263；以及montgomery等人(1998)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]95：15502-15507)；病毒诱导的基因沉默(burton等人(2000)plantcell[植物细胞]12：691-705；和baulcombe(1999)curr.op.plantbio.[植物生物学现状]2：109-113)；靶rna特异性核酶(haseloff等人(1988)nature[自然]334：585-591)；发夹结构(smith等人(2000)nature[自然]407：319-320；wo99/53050；wo02/00904；和wo98/53083)；核酶(steinecke等人(1992)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]11：1525；美国专利号4,987,071；和perriman等人(1993)antisenseres.dev.[反义研究与开发]3：253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如，wo03/076574和wo99/25853)；锌指靶向分子(例如，wo01/52620；wo03/048345；和wo00/42219)；人工微小rna(us8106180；schwab等人(2006)plantcell[植物细胞]18：1121-1133)；以及本领域技术人员已知的其他方法或上述方法的组合。在一方面，所公开的方法可用于将用于将核苷酸序列靶向整合到植物中的多核苷酸引入植物中。例如，所公开的方法可以用于引入t-dna表达盒以转化包含靶位点的植物，所述转移盒包含不相同重组位点侧翼的目的核苷酸序列。在一方面，靶位点包含至少一组与t-dna表达盒上的那些相对应的不相同的重组位点。重组位点侧翼的核苷酸序列的交换通过重组酶进行。因此，所公开的方法可以用于引入t-dna表达盒以靶向整合核苷酸序列，其中所述t-dna表达盒的侧翼为由重组酶识别的不相同重组位点，所述重组酶识别并实现不相同重组位点处的重组。因此，所公开的方法和组合物可以用于提高含有不相同重组位点的植物的发育效率和发育速度。因此，所公开的方法可以进一步包括用于将外源核苷酸定向、靶向整合到转化植物中的方法。在一方面，所公开的方法在基因靶向系统中使用新的重组位点，该基因靶向系统有利于将希望的基因和核苷酸序列定向靶向到先前引入到靶植物基因组中的相应重组位点。在一方面，将侧翼有两个不相同重组位点的核苷酸序列引入到源自靶生物体基因组的外植体的一个或多个细胞中，从而建立用于插入目的核苷酸序列的靶位点。一旦建立了稳定的植物或培养组织，将侧翼有与侧翼靶位点的那些重组位点相对应的重组位点的第二构建体或目的核苷酸序列，在重组酶蛋白存在下引入稳定转化的植物或组织中。该过程导致靶位点和t-dna表达盒的不相同重组位点之间的核苷酸序列的交换。应认识到，以这种方式制备的转化植物可以包含多个靶位点；即多组不相同的重组位点。以这种方式，转化植物中的靶位点的多个操作是可获得的。转化植物中的靶位点是指已经插入到转化植物基因组中的并包含不相同重组位点的dna序列。用于所公开方法的重组位点的实例是本领域已知的，并且包括frt位点(参见，例如schlake和bode(1994)biochemistry[生物化学]33：12746-12751；huang等人(1991)nucleicacidsresearch[核酸研究]19：443-448；pauld.sadowski(1995)progressinnucleicacidresearchandmolecularbiology[核酸研究与分子生物学进展]第51卷，第53-91页；michaelm.cox(1989)mobiledna[移动dna]，berg和howe(编辑)americansocietyofmicrobiology[美国微生物学会]，华盛顿特区，第116-670页；dixon等人(1995)18：449-458；umlauf和cox(1988)theembojournal[欧洲分子生物学学会杂志]7：1845-1852；buchholz等人(1996)nucleicacidsresearch[核酸研究]24：3118-3119；kilby等人(1993)trendsgenet.[遗传学趋势]9：413-421：rossant和geagy(1995)nat.med.[自然医学]1：592-594；albert等人(1995)theplantj.[植物杂志]7：649-659：bayley等人(1992)plantmol.biol.[植物分子生物学]18：353-361；odell等人(1990)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]223：369-378；以及dale和ow(1991)proc.natl.aead.sci.usa[美国科学院院报]88：10558-105620；所有这些通过引用并入文中)；lox(albert等人(1995)plantj.[植物杂志]7：649-659；qui等人(1994)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]91：1706-1710；stuurman等人(1996)plantmol.biol.[植物分子生物学]32：901-913；odell等人(1990)mol.gen.gevet.[分子遗传学和普通遗传学]223：369-378；dale等人(1990)gene[基因]91：79-85；和bayley等人(1992)plantmol.biol.[植物分子生物学]18：353-361。)在大多数天然存在的酿酒酵母菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，其促进两个反向重复之间的dna的倒位。这种倒位在质粒拷贝数扩增中起着核心作用。名为flp蛋白的蛋白质催化位点特异性重组事件。最小重组位点(frt)已被定义并且包含围绕不对称8-bp间隔子的两个反向的13个碱基对(bp)的重复序列。flp蛋白切割所述重复序列和间隔子连接处的位点，并经由3′磷酸共价连接至dna。位点特异性重组酶(如flp)在特定靶序列处切割和再次连接dna，这导致两个相同位点之间的精确限定的重组。为了起作用，系统需要重组位点和重组酶。不需要辅助因子。因此，整个系统可以插入到植物细胞中并在其中起作用。已显示酵母flp\frt位点特异性重组系统在植物中起作用。迄今为止，该系统已被用于切除不需要的dna。参见lyznik等人(1993)nucleicacidsres.[核酸研究]21：969-975。相比之下，本公开利用不相同的frt用于植物基因组中核苷酸序列的交换、靶向、排列、插入和表达的控制。在一方面，需要转化的、含有整合到其基因组中的靶位点的目的生物体，如来自植物的外植体。靶位点的特征在于侧翼有不相同的重组位点。另外需要靶向盒，其含有侧翼有与包含在转化生物体的靶位点中的那些位点相对应的不相同重组位点的核苷酸序列。需要识别不相同重组位点并催化位点特异性重组的重组酶。应认识到，重组酶可以通过本领域已知的任何方式提供。即，通过瞬时表达或通过提供重组酶或重组酶蛋白质的信使rna(mrna)，可以在生物体或植物细胞中通过用能够在生物体中表达重组酶的表达盒转化生物体而提供。“不相同重组位点”意指侧翼重组位点在序列上不相同并且不会重组，或在位点之间的重组将是最小化的。即，一个侧翼重组位点可以是frt位点，而第二个重组位点可以是突变的frt位点。本公开的方法中使用的不相同重组位点阻止或大大抑制两个侧翼重组位点之间的重组和其中所含的核苷酸序列的切除。因此，应认识到，可以在本公开中使用任何合适的不相同重组位点，包括frt和突变frt位点、frt和lox位点、lox和突变lox位点、以及本领域已知的其他重组位点。通过合适的不相同重组位点暗示，在活性重组酶存在下，两个不相同重组位点之间的序列切除(如果有的话)以显著低于核苷酸序列重组介导的交换靶向排列到植物基因组中的效率存在。因此，用于本公开的合适的不相同位点包括那些位点之间的重组效率低的位点；例如，其中效率小于约30％至约50％，优选小于约10％至约30％，更优选小于约5％至约10％。如上所指出，靶向盒中的重组位点对应于转化植物的靶位点中的重组位点。即，如果转化植物的靶位点含有frt和突变frt的侧翼的不相同重组位点，则靶向盒将含有相同的frt和突变frt不相同的重组位点。此外还应认识到，用于所公开的方法中的重组酶将取决于转化植物的靶位点中的和靶向盒中的重组位点。即，如果使用frt位点，则需要flp重组酶。以相同的方式，在使用lox位点的情况下，需要cre重组酶。如果不相同重组位点包含frt和lox位点两者，则植物细胞中将需要flp和cre重组酶两者。该flp重组酶是催化位点特异性反应的蛋白质，该蛋白质参与在dna复制期间扩增酿酒酵母的两微米质粒的拷贝数。flp蛋白质已被克隆并表达。参见例如，cox(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]80：4223-4227。用于本公开的flp重组酶可以是衍生自酵母属的酶。可能优选的是使用植物优选密码子合成重组酶，用于在目的植物中最佳表达。参见例如，1997年11月18日提交的、标题为“novelnucleicacidsequenceencodingflprecombinase[编码flp重组酶的新颖核酸序列]”的美国申请系列号08/972,258，通过引用结合在此。该噬菌体重组酶cre催化在两个lox位点之间的位点特异性重组。该cre重组酶是本领域已知的。参见例如，guo等人(1997)nature[自然]389：40-46；abremski等人(1984)j.biol.chem.[生物化学杂志]259：1509-1514；chen等人(1996)somat.cellmol.genet.[体细胞与分子遗传学]22：477-488；以及shaikh等人(1977)j.biol.chem.[生物化学杂志]272：5695-5702。将其全部通过引用并入本文。这样的cre序列也可以使用植物优选密码子来合成。在适当的情况下，可以对待插入植物基因组的核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。在本公开中使用哺乳动物、酵母或细菌基因的情况下，可以使用植物优选密码子来合成它们以改善表达。应认识到，为了在单子叶植物中表达，也可以使用单子叶植物优选密码子合成双子叶植物基因。本领域中可获得用于合成植物优选基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831、5,436,391，以及murray等人(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：477-498，这些文献通过引用并入文中。可以从目的植物中表达的蛋白质中更频繁使用的密码子确定植物优选密码子。应认识到，可以构建单子叶植物或双子叶植物优选序列以及特定植物物种的植物优选序列。参见例如，epa0359472；epa0385962；wo91/16432；perlak等人(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]，88：3324-3328；以及murray等人(1989)nucleicacidsresearch[核酸研究]，17：477-498。美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，这些文献通过引用并入本文中。进一步认识到，该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用完全优化的或部分优化的序列。已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达并可用于本公开中。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可将序列的g-c含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级rna结构。本公开还包括新的flp重组靶位点(frt)。frt已被鉴定为包含由8个碱基间隔子隔开的两个13个碱基对重复序列的最小序列，如下所示：5′-gaagttcctattc[tctagaaa]gtataggaacttc3′，其中括号内的核苷酸表示间隔子。只要这两个13碱基的重复序列被八个核苷酸分开，间隔区中的核苷酸就可以被核苷酸组合代替。似乎间隔区的实际核苷酸序列不是关键的；然而，对于本公开的实践，间隔区域中核苷酸的某些取代可能比其他取代更好地起作用。在链交换期间，八个碱基对间隔子参与dna-dna配对。该区域的不对称性决定了重组事件中位点对齐的方向，这将随后导致倒位或切除。如上所示，大部分间隔子可以被突变而不丧失功能。参见例如，schlake和bode(1994)biochemistry[生物化学]33：12746-12751，通过引用结合在此。新的frt突变位点可用于实践所公开的方法。这样的突变位点可以通过基于pcr的诱变来构建。尽管突变frt位点是已知的(参见wo1999/025821的seqidno2、3、4和5)，但认识到其他突变frt位点可用于实践本公开。本公开不使用特定的frt或重组位点，而是可使用不相同的重组位点或frt位点以将核苷酸序列在植物基因组中靶向插入和表达。因此，可以基于本公开构建和使用其他突变frt位点。如上所讨论的，在重组酶存在下，含有具有不相同重组位点的靶位点的基因组dna与含有具有相应不相同重组位点的t-dna表达盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位点之间的t-dna表达盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列进行交换。以此方式，目的核苷酸序列可以精确地并入宿主的基因组中。认识到可以实施本公开的许多变化。例如，可以构建具有多个不相同重组位点的靶位点。因此，多个基因或核苷酸序列可以在植物基因组中的精确位置处堆叠或排序。同样地，一旦已经在基因组内建立了靶位点，可以通过将此类位点并入t-dna表达盒的核苷酸序列内并将位点转移至靶序列来引入另外的重组位点。因此，一旦已经建立了靶位点，就可能随后通过重组来添加位点或改变位点。另一种变化包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始区。优选地，该启动子将位于第一个重组位点的5′。通过用包含编码区的t-dna表达盒转化生物体，在t-dna表达盒整合到靶位点时将发生编码区的表达。这方面提供了通过提供选择性标记序列作为编码序列来选择转化细胞(特别是植物细胞)的方法。本系统的其他优点包括通过利用如上所讨论的t-dna表达盒并且用简单的整合模式选择生物体来降低转基因或转移的dna在生物体中整合的复杂性的能力。以相同的方式，可以通过比较几个转化事件来鉴定基因组内的优选位点。基因组内的优选位点包括不破坏必需序列的表达并提供转基因序列的充分表达的位点。所公开的方法还提供了在基因组内的一个位置组合多个表达盒的方法。可以在基因组内的靶位点处添加或删除重组位点。本领域已知的用于将该系统的三种组分放在一起的任何方式都可以用于本公开中。例如，植物可以稳定地转化以在其基因组中具有靶位点。重组酶可以瞬时表达或提供。可替代地，能够表达重组酶的核苷酸序列可以稳定地整合至植物的基因组中。在相应的靶位点和重组酶存在下，将侧翼有相应的不相同重组位点的t-dna转移盒插入到转化植物的基因组中。可替代地，可以通过将转化植物进行有性杂交而将该系统的各组分放在一起。在这个方面，含有整合到其基因组中的靶位点的转化植物(亲本一)可以与已经用含有侧翼不相同重组位点(其对应于植物一中的重组位点)的t-dna表达盒遗传转化的第二植物(亲本二)进行有性杂交。植物一或植物二在其基因组内含有表达重组酶的核苷酸序列。重组酶可以在组成型或诱导型启动子的控制之下。以此方式，可以控制重组酶的表达和重组位点处的后续活性。所公开的方法可用于将转移的核苷酸序列靶向整合到特定的染色体位点。该核苷酸序列可以编码任何目的核苷酸序列。特定的目的基因包括为宿主细胞和/或生物体提供容易分析的功能特征的那些，如标记基因、以及改变受体细胞表型的其他基因等。因此，影响植物生长、高度、对疾病和昆虫的易感性、营养价值等的基因可用于本公开中。核苷酸序列还可以编码“反义”序列以关闭或修饰基因表达。应认识到，核苷酸序列可以用于功能性表达单元或t-dna表达盒中。功能性表达单元或t-dna表达盒意指具有功能性启动子的目的核苷酸序列，并且在大多数情况下是终止区。在本公开的实践中有各种方式来获得功能表达单元。在本公开的一个方面中，将目的核酸作为功能表达单元转移或插入到基因组中。可替代地，可将核苷酸序列插入到基因组内启动子区的3′的位点中。在后一种情况下，将编码序列插入到启动子区3′使得在整合时实现功能表达单元。t-dna表达盒将包含与编码目的肽的核酸可操作地连接的转录起始区或启动子。这类表达盒被提供有用于将一个或多个目的基因的多个限制性位点，以使所述基因位于调节区的转录调节之下。实验实例1：质粒有关包含实例中提及的指定组分的质粒的描述，参见表7。后接“+”的质粒id包含含有指定组分和位于t-dna左边界(lb)之外的其他指定组分的t-dna。如本领域技术人员所知，其他组分可以替代地位于t-dna右边界(rb)之外。表7.实例2：培养基有关实例中提及的用于转化，选择和再生的培养基形成的描述，参见表8、9和10。表8.表9.表10概述了用于大豆转化、组织培养和再生的各种培养基的组成。在该表中，如果这是转化的起始材料，则将培养基m1用于悬浮培养。培养基m2和m3代表可用于上述所列整个范围的外植体的农杆菌转化的典型共培养基。培养基m4可用于选择(使用适当的选择剂)，m5用于体细胞胚成熟，并且培养基m6用于萌发以产生t0小植株。表10.实例3：粒子轰击使用先锋近交系ph184c(在us8445763中公开)，其在染色体-1中包含由ubipro：frt1：nptii：：piniiterm+frt87组成的预整合的位点特异性整合靶位点(chrom-1靶位点)的。轰击前，从先锋近交系ph184c的穗中分离出10-12个dap(授粉后的天数)未成熟胚，并置于605j培养基和16％蔗糖中3小时，以使盾片细胞质壁分离。每次粒子轰击通常使用四种质粒：1)供体质粒(100ng/μl)，其含有用于重组酶介导的盒交换的frt侧翼的供体盒，例如，包含frt1：pmi：：piniiterm+ubi1zmpro：：ds-red2：：piniiterm+frt87的质粒(php0004)；2)含有表达盒ubi1zmpro：：flpm：：piniiterm(php5096)的质粒(2.5ng/μl)；3)含有表达盒zm-pltppro：：zm-odp2：：os-t28term+fmv&pcsv增强子的质粒(10ng/μl)(php89030)；以及4)含有表达盒zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term的质粒(5ng/ul)(php89179)。为了将dna附着到0.6μm金颗粒上，将四种质粒混合在一起，方法是在低结合微量离心管(sorensonbioscience39640t)中将10μl每种质粒加在一起，总共40μl。向该悬浮液中添加50μl0.6μm金颗粒(30μg/μl)和1.0μltransit20/20(目录号mir5404，mirusbiollc)，并将该悬浮液置于旋转振荡器上10分钟。将悬浮液以10,000rpm(约9400xg)离心，弃去上清液。将金颗粒再悬浮在120μl100％乙醇中，在低功率下短暂超声处理，将10μl移液到每个载体盘上。然后将载体盘风干以除去所有残留的乙醇。使用biolisticspdf-1000，在28英寸汞柱下使用200psi破裂盘进行粒子轰击。粒子轰击后，在改良后以包含12.5g/l甘露糖和5g/l麦芽糖且不含蔗糖的605j培养基上选择未成熟胚。选择10-12周后，再生小植株并使用qpcr分析。预期pltp：：odp2(php89030)和pltp：：wus2(php89179)连同ssi组件(供体dna(php0004)+ubi：：flp(php5096))的共递送将产生供体片段位点特异性整合到chrom-1靶位点中的高频率(即，相对于轰击的未成熟胚的数量的4-7％的比率)。实例4：农杆菌介导的玉米转化a.农杆菌母板的制备。将带有二元供体载体的根癌农杆菌从-80℃冷冻等分试样划线到固体12r培养基上，并在黑暗中在28℃培养2-3天，以制备母板。b.在固体培养基上生长农杆菌。从母板上挑出单菌落或多菌落的农杆菌，并将其划线到含有810k培养基的第二平板上，并在黑暗中于28℃孵育过夜。将农杆菌感染培养基(700a；5ml)和100mm3′-5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮(乙酰丁香酮；5μl)添加到通风橱中的14ml锥形管中。将来自第二平板的约3个满环的农杆菌悬浮于试管中，然后将试管涡旋以形成均匀的悬浮液。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35-1.0的读数。农杆菌浓度为约0.5至2.0×109cfu/ml。将最终的农杆菌悬浮液等分到2ml微量离心管中，每个管含有约1ml悬浮液。然后尽快使用悬浮液。c.在液体培养基上生长农杆菌。替代地，可以通过在液体培养基中生长来制备农杆菌以进行转化。感染前一天，使125ml烧瓶制有30ml557a培养基(10.5g/l磷酸氢二钾，4.5g/l无水磷酸二氢钾，1g/l硫酸铵，0.5g/l脱水柠檬酸钠，10g/l蔗糖，1mm硫酸镁)和30μl大观霉素(50mg/ml)和30μl乙酰丁香酮(20mg/ml)。将来自第二平板的半环农杆菌悬浮于烧瓶中，并置于设定为200rpm的轨道振荡器上，并在28℃下孵育过夜。将农杆菌培养物以5000rpm离心10分钟。去除上清液并添加具有乙酰丁香酮溶液的农杆菌感染培养基(700a)。将细菌通过涡旋重悬，并将农杆菌悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35至2.0的读数。d.玉米转化。将玉蜀黍(zeamaysl.)栽培品种的穗在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴tween20中进行表面灭菌15-20分钟，然后在无菌水中洗涤3次。从穗分离未成熟胚(ie)，并将其置于具有乙酰丁香酮溶液的2ml农杆菌感染培养基(700a)中。胚胎的最佳大小因近交系而异，但是对于用wus2和odp2转化，可以使用大范围的未成熟胚大小。取出农杆菌感染培养基(810k)，将1ml农杆菌悬浮液加入胚胎中，并将试管涡旋5-10秒。使微量离心管在通风橱中静置5分钟。将农杆菌悬浮液和胚胎倾倒在710i(或562v)共培养基(参见表8)上。使用无菌刮刀将留在管中的任何胚胎转移到平板上。抽取农杆菌悬液并将胚胎置于培养基的轴侧。将平板在黑暗中于21℃孵育1-3天进行共培养。无需选择即可将胚胎转移到静息培养基(605t培养基)中。3至7天后，将胚胎转移到补充有选择剂的成熟培养基(289q培养基)中。实例5：用于回收仅含有性状表达盒t-dna的玉米转基因事件的农杆菌混合物以下实验证明，含有wus2的质粒与含有性状表达盒的质粒的递送提高了仅含有性状t-dna而没有载体(质粒)骨架的转基因t0植物的回收。将玉米非硬茎近交hc69的未成熟胚用农杆菌菌株lba4404thy-(参见通过引用整体并入本文的美国专利8,334,429)(agro1)转化，所述菌株含有php86491，一种具有两个“性状”(zs-green和zm-hra)表达盒的t-dna(表7)。将该农杆菌(agro1)单独使用(对照处理)来感染未成熟胚，或者作为与含有wus表达盒(php87598、php88156、php88157或php88158，参见表7)的另一农杆菌(agro2)的混合物的一部分使用。对于处理(trts)1-4，将两种农杆菌以95％含有性状的php86491质粒(agro1)与5％含有wus的质粒(agro2)(php87598、php88156、php88157或php88158，参见表7)混合。如下表11所示，当仅使用含有性状t-dna(php86491)质粒的农杆菌(agro1)进行转化时，回收具有单拷贝t-dna且没有质粒骨架(t-dna边界以外的序列)的t0植物的频率低(trtc＝1.8％)。但是，当含有具有wus表达盒(php87598、php88156、php88157或php88158，参见表7)的t-dna的第二农杆菌(agro2)以低滴度与agro1混合时，观察到仅含有单个拷贝的性状t-dna(php86491-zs-green+zm-hra)而没有整合含wus的t-dna(php87598、php88156、php88157或php88158，参见表7)或质粒骨架的转基因t0植物的回收频率显著提高(表11中trts1-4为6.4％至16.2％)。对于trtl，其中agro2(php87598)中的t-dna包含三个在驱动wus表达的zm-pltp启动子以及驱动cre表达的热休克启动子的5′端的病毒增强子元件(enh)，组成型表达的花色素苷表达盒(nospro：：crc：：sb-gkafterm)和所有三个表达盒侧翼的loxp位点，单拷贝的性状t-dna和无质粒骨架的整合频率为6.5％。对于php88156、php88157和php88158，它们都包含具有驱动wus的3xenh：pltp启动子(具有或不具有位于pltp启动子tata盒附近的玉米来源的增强子元件(eme)(一式三份(php88156中为3xeme)，单拷贝(php88157中为eme)或不具有eme(php88158中为eme-))和组成型表达的花色素苷表达盒，仅含有单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物的频率为6.4(php88156)，16.2(php88157)和12.1％(php88158)。当agro2含有php88157时，逃逸(再生的非转基因t0植物)为4％，而当agro2含有php88158时为1％。3xenh对nospro：：crc：：sb-gkafterm表达盒具有作用，如果整合包含enh和nospro：：crc：：sb-gkafterm表达盒的t-dna，则胚胎为深红色，无法产生小植株。处理2-4(表11)表明，以低滴度混合含有wus表达盒的第二农杆菌(相对于含有性状-t-dna的agro1的5％)提供了有效替代方案，用于提高仅含有单拷贝的性状t-dna且不含质粒骨架的t0植物的回收，而不需要通过切除wus表达盒来跟踪转化过程。表11.将美国专利8,907,160中公开并通过引用整体并入本文的玉蜀黍硬茎近交ph1v69的未成熟胚用含有php86491的农杆菌菌株lba4404thy-(agro1)转化(表7)。将该农杆菌(agro1)单独使用(对照处理)来感染未成熟胚，或者作为与含有wus表达盒(php87598或php88156或php88157或php88157)的另一农杆菌(agro2)的混合物的一部分使用(95％agro1与5％agro2)。在对照处理(仅agro1)中，未回收到逃逸(再生的非转基因t0植物)，也没有回收到仅包含单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物。相反，当将含有php87598的第二农杆菌(agro2)(表7)与agro1混合并将混合物用于转化时，仍然没有回收到逃逸，并且仅包含单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物的频率为16.5％。当在agro2中用php87078(表7)代替php87598时，在再生的t0植物中未观察到逃逸，仅包含单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物的频率为7.1％。这些频率代表了我们使用未不整合包含wus的表达盒的形态发生基因表达盒(例如3xenh：pltp：：wus2)来回收高质量的t0植物(单拷贝性状，没有整合外源序列(没有质粒骨架或来自agro2的任何t-dna序列))的能力得到重大改进。将玉蜀黍硬茎近交ph1v69的未成熟胚用含有质粒php86491的农杆菌菌株lba4404thy-转化(表7)。将该农杆菌(agro1)作为与含有质粒php87598(表7)的另一农杆菌(agro2)的混合物的一部分使用，所述质粒包含wus表达盒。测试了两种不同比例的agro1∶agro2，即50∶50或90∶10。当将50∶50混合物用于转化时，在所得的t0植物中未观察到逃逸，并且仅包含单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物的频率为8.2％。当将90∶10混合物用于转化时，在所得的t0植物中未观察到逃逸，并且仅包含单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物的频率为26％。该结果证明，转化混合物中agro1和agro2的相对浓度影响仅包含单拷贝的性状t-dna且没有质粒骨架的t0植物的频率。收获来自四种不同热带玉蜀黍近交系的未成熟胚，并用使用php81561(zs-yellow+nptii)或php86491(zs-green和zm-hra)的两种“性状”表达盒中的一种进行转化。对于所有四种近交系，ph2kd1、ph44mh、ph4bah和ph28sv，使用g-418选择或灭草烟选择(分别对于nptii或hra基因)的转化率有效地为0％。但是，当含有(php88158，参见表7)的第二农杆菌以相对于含有性状的agro1(含有php81561，参见表7)的10％的滴度加入并且在整个体细胞胚成熟和发芽中使用g-418选择时，相对于起始胚胎的数目，对于ph2kd1，仅包含单拷贝的t-dna且没有载体(质粒)骨架的回收的t0植物的频率为30％，对于ph44mh为38％，对于ph4bah为43％，且对于ph28sv为3.2％。当含有php88158的第二农杆菌以相对于含有zs-green和zm-hra-的agro1(含有php86491)的10％的滴度加入并且在整个体细胞胚成熟和发芽中使用0.1mg/l灭草烟选择时，相对于起始胚胎的数目，对于ph2kd1，仅包含单拷贝的t-dna且没有载体(质粒)骨架的回收的t0植物的频率为15％，对于ph44mh为18％，对于ph4bah为9.6％，且对于ph28sv为0％。这些结果表明，在agro2的t-dna内使用wus表达盒，并以相对于含性状的agro1(90％)的10％混合agro2，产生了一种用于整合性状-t-dna的有效方法，以极有效频率得到仅包含单拷贝的t-dna且没有载体(质粒)骨架的回收的t0植物。实例6：使用含有性状的t-dna边界外的wus2表达盒来刺激转化和选择不包含整合在染色体dna中的wus2表达盒的单拷贝t0玉蜀黍植物对于这些实验，测试了一组三种质粒设计。所有三种质粒均包含相同的t-dna(rb+loxp+si-ubi3pro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb)，但在左边界外的wus2或wus2/odp2表达盒不同。具体而言，php86295包含紧靠左边界外侧的两个表达盒zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term+zm-pltppro：：zm-odp2：：os-t28term(参见表7)，php86296包含紧靠左边界外侧的单个表达盒zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term，php86297包含紧靠左边界外侧的单个表达盒zm-pltppro：：zm-wus2～t2a～zm-odp2：：os-t28term。对于先锋硬茎近交ph1v69，在用这些各自的t-dna进行农杆菌介导的转化后，在体细胞胚成熟和再生期间进行0.05至0.1mg/l灭草烟选择，通过qpcr分析t0植物。根据qpcr分析，使用php86295，导致10.2％的回收的t0植物是t-dna内的性状基因的单拷贝，同时缺乏整合的wus和/或odp2而没有质粒骨架污染，这些值对于php86296和php86297分别是12.2％和12.3％。这些结果表明，将wus2和/或odp2表达盒放置在t-dna左边界之外提供转化的必要刺激，而不会伴随这些形态发生基因表达盒的整合。该结果进一步证明，wus和/或odp2可以在“边界外”递送后瞬时表达，以刺激玉蜀黍转化。相反，在近交hc69中使用这些相同的载体并没有增加没有载体(质粒)骨架的单拷贝性状t-dna事件的回收，这很可能是由于该近交倾向于产生具有高度边界读取的多拷贝整合事件。实例7：在t-dna和形态发生基因表达盒之间使用多个左边界增加了单拷贝性状t-dna整合事件的频率玉蜀黍近交系在许多形态和生理特性上各不相同。这种变异性的一种表现是不同近交系的未成熟胚盾片在农杆菌感染和共培养期间对t-dna递送和整合的敏感性。例如，当使用农杆菌菌株lba4404thy-来转化先锋近交hc69时，高频率回收的转基因t0植物包含多拷贝的t-dna，并在t-dna左边界(lb)处进行读取，导致载体(质粒)骨架的整合。引入多个左边界将减轻这种趋势。例如，在包含性状的t-dna和侧翼wus2表达盒之间的php86296中引入多个左边界，导致以下配置：rb+loxp+si-ubi3pro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb+lb+lb+zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term。当使用包含上述多个lbt-dna和侧翼wus2表达盒的lba4404来转化hc69时，预期明显较高频率回收的t0植物将是单拷贝的t-dna且没有整合wus2表达盒，并不包含质粒骨架。实例8：左边界序列的诱变增加了回收转基因事件的频率玉蜀黍近交系在许多形态和生理特性上各不相同。这种变异性的一种表现是不同近交系的未成熟胚盾片在农杆菌感染和共培养期间对t-dna递送和整合的敏感性。例如，当使用农杆菌菌株lba4404thy-来转化先锋近交ph28sv时，盾片中几乎没有细胞接受lb侧翼序列，例如侧翼wus2表达盒，因此不被刺激以迅速形成新的体细胞胚。通过选择性诱变lb序列，可以改变lb的功效，以允许更高频率的lb读取。当用于转化时，预期将产生更高频率的快速形成的体细胞胚和包含单个拷贝性状基因而没有载体(质粒)骨架的所得t0植物。农杆菌共培养对感染更具抵抗力的品种可能使形态发生基因的表达超出边界递送不切实际。预期使用更具攻击性的农杆菌菌株(例如agl1、eha101、eha105或任何具有超毒性ti质粒ptibo54的菌株)可以解决这个潜在的缺点。另外，使用具有较高拷贝数的二元载体可用于每个细胞递送增加数目的t-dna分子，从而扩增边界外读取和随后的形态发生基因表达。实例9：用于回收仅含有性状t-dna的低芥酸菜籽转基因事件的质粒混合物将低芥酸菜籽种子表面杀菌，并在半强度ms培养基上发芽，以产生无菌的一周龄植物。将下胚轴置于10ml20a培养基中(表9)并切成2mm片段。将农杆菌菌株lba4404thy-悬浮于20a培养基中，并调节至0.6od550，将10-200μl该悬浮液加入到每个含有下胚轴的平板中。用含有php88193的农杆菌菌株lba4404thy-(agro1)转化下胚轴片段，该php88193是具有两个“性状”(spcn和zs-yellow1n1)表达盒的t-dna(表7)。将该农杆菌(agro1)单独使用(对照处理)来感染下胚轴片段，或作为与含有php90094(seqidno：116)(ha-wus表达盒(表7))的另一种农杆菌(agro2)的混合物的一部分。该混合物包含95％agro1和5％agro2。在20a培养基(表9)中在低光照和21℃下与农杆菌共培养后，将下胚轴片段转移到选择培养基上，从70a培养基(表9)开始两周，70b培养基(表9)再两周，然后转移到70c培养基(表9)上持续两周。为了持续发芽和生根，将小芽转移到由半强度ms盐，10g/l蔗糖，0.5mg/liba和5g/ltc琼脂组成的调节至ph5.7的固体培养基上。一旦形成足够的根，将小植株转移到温室的土壤中。在单独用agro1的对照处理中，由于大观霉素的严格选择，预期回收不到任何逃逸(再生的非转基因t0植物)，回收转基因t0植物的频率将很低(即＜1.5％)，从农杆菌感染到回收t0小植株的时间通常需要3-4个月，并且仅包含单拷贝的性状t-dna且没有载体(质粒)骨架的t0植物的频率将很低。相反，当将含有php90094的第二农杆菌(agro2)与agro1混合并将该混合物用于转化时，预期i)回收不到逃逸，ii)回收转基因t0植物的频率会增加，iii)从农杆菌感染到t0植物回收的时间范围将大大减少，以及iv)仅包含单拷贝的性状t-dna且没有载体(质粒)骨架的t0植物的频率将大大增加。实例10：在含有性状的t-dna边界外使用wus2表达盒来刺激不含wus2表达盒的单拷贝t0低芥酸菜籽植物的转化和选择使用包含单个t-dna的单个农杆菌菌株进行转化，其中“性状”表达盒位于t-dna左右边界内，wus表达盒刚好在左边界外。例如，可以使用包含具有以下配置的增强型35spro：：wus表达盒的质粒(php0001，参见表7)：rb+at-ubq10pro：：ctp：：spcn：：ubq14term+gm-ubqpro：：zs-yellown1：：nosterm+lb+fmvenh：pscvenh：mmvenh：camv35spro：：ha-wus：：os-t28term。对于对照治疗，php88193，其中t-dna包含spcn和zs-yellown1表达盒而没有wus表达盒，由于大观霉素的严格选择，预期回收不到任何逃逸(再生的非转基因t0植物)，回收转基因t0植物的频率将很低(即＜1.5％)，从农杆菌感染到回收t0小植株的时间范围通常需要3-4个月，并且仅包含单拷贝的性状t-dna且没有载体(质粒)骨架的t0植物的频率将很低。相反，将上述增强型35spro：：wus表达盒添加到紧靠t-dna的lb外部的质粒中时，在农杆菌介导的转化后，预期i)回收不到逃逸，ii)回收转基因t0植物的频率会增加，iii)从农杆菌感染到t0植物回收的时间范围将大大减少，以及iv)仅包含单拷贝的性状t-dna且未整合wus或载体(质粒)骨架的t0植物的频率将大大增加。实例11：位于左边界3′端的wus表达盒提高了含有t-dna内组分的转基因大豆事件的回收对于该实验，构建了包含pvs1复制起点和单个t-dna的二元载体。构建在t-dna左右边界内具有两个表达盒的对照载体(php80728)。第一表达盒由驱动tag-rfp表达的大豆ubq启动子，和随后的拟南芥ubq3终止子组成。第二表达盒由驱动大豆除草剂抗性als基因(hra)表达的大豆sams启动子和大豆als终止子组成。构建第二载体(php81718)，该载体包含相同的除草剂抗性als基因和位于t-dna内的相同tag-rfp表达盒，并另外包含在左边界外的表达盒：gm-ef1apro：：at-wus：：ubq14term。将这两种质粒引入农杆菌菌株agl1中进行比较。用对照t-dna质粒(php80728)或左边界t-dna质粒外的wus(php81718)转化先锋大豆品种93y21的未成熟子叶后，将子叶培养两周，移至补充有选择性除草剂10μg/l氯磺隆的m5成熟培养基上，然后将t0小植株送入温室。取样t0植物并pcr筛选als、tag-rfp和wus表达盒的存在。左边界t-dna质粒外的wus(php81718)大大提高了体细胞胚胎发生的效率(参见图1)，将胚胎形成的效率从tag-rfp对照(php80728)低于5％的中值增加到wus处理(php81718)的超过25％。这直接转化为能够发芽形成转基因t0植物的转基因成熟体细胞胚胎的频率增加。使用tag-rfp对照载体(php80728)进行的转化未产生t0植物。相比之下，wus处理(php81718)产生了一些t0植物。通过qpcr分析了六株t0植物，四株t0植物含有als和tag-rfp表达盒，但缺乏整合的wus，且没有质粒骨架污染。该结果表明，wus可以在“边界外”递送后与整合的t-dna一起以足够高的水平瞬时表达以刺激体细胞胚的形成，而不整合到基因组中。这提供了一种使用wus快速产生转基因大豆事件(携带性状als和tag-rfp)的有效方法，而不必切除wus表达盒，因为它只是瞬时表达而未整合。实例12：在含有性状的t-dna边界外使用wus2表达盒和小麦矮化病毒repa表达盒来刺激不含wus2或repa表达盒的单拷贝t0玉蜀黍植物的转化和选择对于这些实验，比较两种质粒。第一种含有包含以下组分的t-dna；rb+loxp+si-ubi3pro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb，在紧邻左边界之外具有一个额外的表达盒；zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term(参见表7中的php86296)。第二种质粒含有包含以下组分的t-dna；rb+loxp+si-ubipro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepciterm+lb，在紧邻左边界之外具有两个额外的表达盒；zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term+zm-pltppro：：wdv-repa：：os-t28term(参见表7中的php0002)(wdv-repa是小麦矮化病毒repa，参见通过引用整体并入文中的美国专利号6,284,947)。对于先锋硬茎近交ph1v69，在用这些各自的t-dna进行农杆菌介导的转化后，在体细胞胚成熟和再生期间进行0.05至0.1mg/l灭草烟选择，通过qpcr分析t0植物。当使用php86296时，预期在t-dna内为单拷贝性状基因且没有载体(质粒)骨架的t0植物的回收频率(相对于起始未成熟胚的数目)为约10％。当在农杆菌中使用php0002时，预期转化频率将高于对照(php86296)，将加速转基因体细胞胚的生长，并且在t-dna内为单拷贝性状基因同时缺乏整合的wus和repa且没有载体(质粒)骨架的t0植物的回收频率相对于对照(php86296)处理有所增加。预期将wus2和repa表达盒置于t-dna左边界之外将提供改进的转化刺激，而不会伴随这些形态发生基因表达盒的整合。替代地，预期在lb外含有包含rb+si-ubipro：：zs-green：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb+zm-pltppro：：wus2～t2a～wdv-repa：：in2-1term的单个表达盒的t-dna(php0005)与对照等效，但转化效率更高，相对于对照处理，加速转基因体细胞胚的生长，提高在t-dna内为单拷贝性状基因同时缺乏整合的wus和repa且没有载体(质粒)骨架的t0植物的回收频率。实例13：使用靶向含有性状的t-dna边界外的玉蜀黍pickle(pkl)转录物的wus2表达盒和amirna表达盒来刺激不含wus2或repa表达盒的单拷贝t0玉蜀黍植物的转化和选择对于这些实验，比较两种质粒。第一种php86296含有包含以下组分的t-dna；rb+loxp+si-ubi3pro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb，在紧邻左边界之外具有一个额外的表达盒；zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term。第二种质粒含有在左边界之外具有一个额外的表达盒zm-pltppro：：pklamirna：：os-t28term的修饰的php86296(表7中的php0003)。pklamirna组分是靶向玉蜀黍pickle(pkl)转录物中的短序列的人工微rna，该短序列使pkl转录物不稳定而引起降解。对于先锋硬茎近交ph1v5t，在用这些各自的t-dna进行农杆菌介导的转化后，在体细胞胚成熟和再生期间进行0.05至0.1mg/l灭草烟选择，通过qpcr分析t0植物。预期使用php86296将导致在t-dna内为单拷贝性状基因且缺乏整合的wus和pklamirna且没有质粒骨架的t0植物的回收频率(相对于起始未成熟胚的数目)为约1％。当在农杆菌中使用php0003时，预期转化频率将高于php86296，将加速转基因体细胞胚的生长，并且在t-dna内为单拷贝性状基因同时缺乏整合的wus和repa且没有质粒骨架的t0植物的回收频率相对于php86296处理有所增加。当使用包含这两种质粒的农杆菌从近交ph1v5t转化玉蜀黍叶片组织，然后在体细胞胚成熟和再生期间进行0.05至0.1mg/l灭草烟选择，通过qpcr分析t0植物。预期使用php86296将导致转基因愈伤组织的回收，并且在两至三周后，体细胞胚将以约1％的频率形成(相对于起始未成熟胚的数目)。当农杆菌中使用php0003时，预期转化频率将高于php86296，体细胞胚将直接从叶细胞快速形成(无中间愈伤组织阶段)，并且在t-dna内为单拷贝性状基因同时缺乏整合的wus和pklamirna且没有载体(质粒)骨架的t0植物的回收频率相对于php86296处理有所增加。实例14：使用在含有性状的t-dna边界外的组成型表达的四环素阻遏物以及驱动t-dna内的mopat～dsred表达的阻遏型启动子，来促进紧邻lb之外不包含阻遏物表达盒的单拷贝双丙氨膦抗性事件的回收。对于这些实验，质粒php38042(参见表7)含有包含以下组分的t-dna；rb+camv35spro：3xtet-op：adh1intron1：：mo-pat～ds-redexpress：：piniiterm+lb+ubi1zmpro：：tetrepressor：：piniiterm。对于先锋硬茎近交ph1v5t，在用此t-dna进行农杆菌介导的转化后，在体细胞胚成熟和再生期间进行3.0mg/l双丙氨磷选择，通过qpcr分析t0植物。预期使用php38042将导致在t-dna内为单拷贝性状基因且缺乏整合的tetrepressor且没有质粒骨架的t0植物的回收频率(相对于起始未成熟胚的数目)为约3-5％，缺乏整合的tetrepressor的t0植物将具有除草剂耐受性并表达ds-red。实例15：在含有性状基因的t-dna边界外使用wus2表达盒和组成型表达的dcas～阻遏物(rep)融合表达盒来刺激不包含wus2或repa表达盒的单拷贝t0玉蜀黍植物的转化和选择对于这些实验，比较两种质粒。第一种含有包含以下组分的t-dna：rb+si-ubi3pro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb(对照质粒)。第二种质粒在t-dna内包含相同组分(rb+si-ubi3pro：：zs-green1：：piniiterm+sb-alspro：：zm-hra：：sb-pepc1term+lb)加上紧邻左边界之外的三个额外的表达盒：i)含有zm-u6pro：：grna：：zm-u6term的表达盒；ii)zm-ubipro：：dcas9～rep：：piniiterm表达盒；iii)pltppro：：zm-wus2：：in2-1term表达盒(测试质粒)。第一个表达盒内的grna已设计为将dcas9～rep靶向sb-alspro序列，该序列在转录上使hra表达沉默并使细胞对灭草烟敏感。对于先锋硬茎近交hc69，在用含有对照质粒的农杆菌菌株lba4404thy-进行农杆菌介导的转化之后，在体细胞胚成熟和再生期间，通过qpcr分析t0植物。在农杆菌中使用对照质粒，预期在t-dna内为单拷贝性状基因且没有载体(质粒)骨架的t0植物的回收频率(相对于农杆菌感染的未成熟胚的数目)为约5％。当在农杆菌中使用测试质粒时，预期转化频率高于对照，相对于对照处理，加速转基因体细胞胚的生长，提高在t-dna内为单拷贝性状基因同时缺乏整合的wus和dcas9～rep且没有载体(质粒)骨架的t0植物的回收频率。预期将dcas9～rep和wus2表达盒置于t-dna左边界之外将提供改进的转化刺激，而不会伴随这些形态发生基因表达盒的整合。替代地，在上述实例中，可以使用与阻遏物结构域融合的合成锌指核酸酶来代替grna和dcas9～rep(urritia等人，2003，genomebiol.[基因组生物学]4：231)。实例16：棉花的转化脱绒棉(gossypiumhirsutum)栽培品种coker310和312使用40％(v/v；80ml漂白剂和120ml水)商业漂白剂和1滴tritonx-100进行表面杀菌，持续30分钟，并用无菌水冲洗三次，间隔2分钟。漂白剂处理后，将种子用95％乙醇冲洗1分钟，再用无菌水冲洗3次。然后将种子放在无菌纸巾上以吸干种子。在含有1/2强度ms盐(2.2g/l)，1/2强度b5维生素，0.9g/l氯化镁六水合物，15g/l葡萄糖，3.6g/lphytagel(sigma)的ph调节至5.8的′棉籽培养基′(csm；(gh3210))中，在28℃下，将20个经过表面杀菌的种子发芽，每个植酸盘5粒种子，并在黑暗中孵育约7-9天。约3天后，当种皮裂开并且胚根出芽。通过使用无菌镊子去除种皮，将所有种子的圆形尖端(chalazas)轻轻捏放在培养基表面以暴露折叠的子叶，并将胚根插入培养基中。将植酸盘再次在28℃下孵育以完成发芽。8天后，用剪刀从幼苗上切除下胚轴和子叶外植体。将下胚轴和子叶外植体置于无菌培养皿中，并用解剖刀片将其切成0.9cm片段(对于下胚轴)和0.5cm2片段(对于子叶)。然后将这些片段放在无菌的100x25mm(宽x深)陪替氏培养皿中，该培养皿中具有35ml液体共培养基(ms盐，b5维生素，30g/l葡萄糖，0.9g/l氯化镁六水合物，1.9g/l硝酸钾，0.1g/l肌醇，ph5.8)，准备用于农杆菌处理。在该实验中，质粒php89484包含具有以下组分的t-dna：rb+at-ubq10pro：：ctp：：spcn：：ubq14term+gm-ubqpro：：ds-red2：：ubq3term+lb+camv35spro：：ha-wus：：os-t28term+fmcenh：：pcsvenh：：mmvenh。不存在wus表达盒的对照质粒(php88193)含有具有以下组分的t-dna；rb+at-ubq10pro：：ctp：：spcn：：ubq14term+gm-ubqpro：：zs-yellow1n1：：nosterm+lb。在810k基本培养基加100ug/ml大观霉素和200μm乙酰丁香酮中制备含有php89484的农杆菌菌株lba4404。将农杆菌培养物在培养箱振荡器中于28℃和280rpm下生长过夜，直到在600nm下的od达到0.6-0.8。通过以4000rpm离心15分钟使细菌细胞沉淀，并重悬于700a培养基中，最终od600为0.6。将40ml农杆菌溶液加入到每个含有切段的陪替氏培养皿中，并在间歇振荡下孵育30分钟。感染后，将约50个下胚轴片段或50个子叶外植体置于具有固体710i共培养基的陪替氏培养皿中，并用无菌滤纸覆盖。在弱光(5μe)下于28℃在16h的光周期下共培养4天。然后将外植体直接转移到没有选择剂的‘愈伤组织诱导培养基’(cim)(ms盐，b5维生素，30g/l葡萄糖，0.9g/l氯化镁六水合物，1.9g/l硝酸钾，0.1g/l肌醇，0.1mg/l激动素，0.1mg/l(0.45μm)2，4-d，500mg/l羧苄青霉素，3.6g/lphytagel(ph5.8))的表面。14天后，将外植体与60mg/l大观霉素一起转移至cim。农杆菌处理7天后，在表面荧光立体显微镜下观察到瞬时rfp表达。在子叶和下胚轴外植体中均在切割表面周围观察到强表达的ds-red病灶。在稳定的愈伤组织中观察到ds-red表达，所述愈伤组织在3周后显示多细胞ds-red表达结构。相比之下，当在相同菌株中和在相同实验条件下使用对照t-dna(在php88193中)时，基于荧光，t-dna递送是相似的，但在农杆菌处理后三周，没有观察到多细胞结构的生长。实例17：使用病毒增强子和大麦ltp2pro以驱动wus2表达进一步改善了对于“性状”t-dna仅单拷贝转基因事件的回收。在所有处理中均使用含有毒力质粒php71539(seqidno：132)的农杆菌菌株lba4404thy-。包含具有“性状”表达盒(rb+sb-ubipro：：zs-green1：：os-ubiterm+sb-alspro：：zm-hra：：piniiterm+lb)的t-dna的php86491(seqidno：110)也用于所有处理。处理1(trt.no.1)作为阴性对照，使用仅含有php86491的单一农杆菌菌株(agro1)。处理2(trt.no.2)作为阳性对照，将含有php88158(seqidno：109)(rb+fmvenh：pscvenh：mmvenh：zm-pltppro：：zm-wus2：：in2-1term+nospro：：crc：：sb-gkafterm+lb)的第二农杆菌(agro2)与agro1混合。将两种农杆菌悬浮液均调节至0.7od550，然后以90％agro1与10％agro2的比例混合。在第三种处理，处理3(trt.no.3)中，将php93161(seqidno：130)(rb+loxp+fmvenh：pcsvenh：mmvenh：：ltp2pro：：zm-wus2：：in2-1term+nospro：：crc：：sb-gkafterm+lb)代替agro2中的php88158，在trt.no.2和trt.no.3中agro1/agro2的比例保持相同(90％/10％)。在trt.no.1中，用农杆菌混合物感染近交hc69的三百五十八(358)个未成熟胚，并产生九十一(91)株转基因t0植物(转化频率为25％)，其中11％的那些植物是单拷贝性状(相对于胚胎的起始数量)。在trt.no.2中，相对于trt.no.1，转化频率和单拷贝频率均得到改善(分别从25％到31％以及从11％到16％)。最终“性状单拷贝％”值的提高是成功将高质量的可育转基因植物递送到温室的最终量度。该值受到该过程中多个单独步骤的结果的影响，包括初始转化频率(产生转基因细胞)，再生频率(从转基因细胞产生植物)以及最终分子分析。分子分析证实转基因植物i)是独立的整合事件，ii)包含单拷贝的所需t-dna及其复合性状表达盒，iii)不包含具有形态发生基因表达盒的t-dna，以及iv)不包含农杆菌质粒骨架序列。这些结果中的每一个(转化频率，再生频率和分子质量控制频率)都对整个过程中的磨损产生了影响，并且如表12中所示的“性状单拷贝％”频率总结。由于该最终结果的重要性-产生高质量可育t0植物的频率-从trt.no.1中的11％提高到trt.no.2中的16％代表了对这种有价值的先锋近交系的总体转化效率的重要和实质性的改进。如上所述，在php93161(seqidno：130)中，用于表达zm-wus2基因的启动子从trt.no.2中的zm-pltp启动子切换到trt.no.3中的ltp2启动子(kalla等人，1994，theplantj.[植物杂志]6：849-860)。trt.no.2和trt.no.3中的两种植物启动子前面是来自三种不同病毒(即玄参花叶病毒、花生褪绿条纹病毒和紫菜莉花叶病毒)的三种启动子增强子元件(这三种增强子元件序列按此顺序在表12中缩写为“3xenh”)。当在trt.no.3中使用ltp2启动子时，相对于trt.no.2，转化频率和“性状单拷贝％”频率均提高(分别从31％到45％以及从16％到24％)。这表明不同的启动子可用于该策略。这也加强了比较trt.no.1和trt.no.2得出的结论；通过将一种农杆菌(在t-dna内包含性状表达盒)与另一种农杆菌(在t-dna内包含形态发生基因表达盒)混合，与使用含有仅具有性状的t-dna的单一农杆菌相比，产生高质量可育t0植物(基于pcr表征的独立事件)的总频率增加。表12.表12显示了当trt.no.1中不存在agro2(形态发生基因表达盒)时，或利用含有具有两种不同促进子的wus2基因表达盒的agro2(trt.no.2和trt.no.3)的转化效率。基于相对于未成熟胚的起始数目回收的转基因(tnx)t0植物的数目计算转化频率。使用定量pcr确定性状基因(zs-green1andhra)和形态发生基因(wus2)的单拷贝分析，以确定基因存在和拷贝数。仅含有单拷贝性状基因而没有wus2基因的t0植物用于计算相对于未成熟胚的起始数目的“性状单拷贝％”值。实例18：使用含有性状的农杆菌和含有形态发生基因的农杆菌的混合物提高向日葵胚轴转化农杆菌菌株lba4404thy-用于向日葵(helianthusannuus品种f1503lg)转化。将成熟的干燥向日葵种子在漂白剂溶液中(含一滴吐温洗涤剂的10-15％v/v水)杀菌十五(15)分钟，然后在无菌水中冲洗三(3)次。将种子吸收过夜。从软化的壳中取出胚胎。一旦分离出胚胎，就在子叶的底部切开以促进胚胎分离，从而暴露出覆盖顶端分生组织的叶原基。将根尖留在胚胎上。分离后，将胚轴(ea)转移到陪替氏培养皿中进行感染。将两种农杆菌(每种含有不同的t-dna质粒)悬浮在液体感染培养基中。第一种农杆菌携带质粒php92349(seqidno：131)质粒，该质粒具有含有spcn(大观霉素抗性)和ds-red2(荧光)基因的“性状”表达盒的t-dna，具体地含有rb+loxp+gm-qbupro：：ctp：spcn：：ubq14term+gm-ef1a2pro：：ds-red2：：ubq3term+loxp+lb。第二种农杆菌携带php90094，其具有含有ha-wus的形态发生基因表达盒的t-dna，具体地含有rb+camv35spro：：ha-wus：：os-t28term+fmvenhancer：pcsvenhancer：mmvenhancer+lb。将每种农杆菌菌株悬浮于20a培养基中，并将细菌悬浮液的浓度调节至0.5od550。将农杆菌悬浮液以1∶1的比例混合在一起，并将五(5)ml悬浮液添加到ea中以覆盖外植体。然后将ea在温和搅拌下置于真空中二十(20)分钟。从农杆菌中除去ea，并将胚根端向下插入272ac培养基(标准ms盐和维生素水平(murashige和skoog，1962，physiol.plant[植物生理学]15：473-497)，0.1g/l肌醇，50mg/l胸腺嘧啶核苷，100um乙酰丁香酮，0.1mg/lbap，40g/l蔗糖，6g/lbacto琼脂，ph5.6)中，将顶端分生组织留在272ac培养基上方，并于21℃在弱光下放置三天进行共培养。共培养后，将ea于28℃在全光照下转移至272ab大观霉素选择培养基(标准ms盐和维生素水平(murashige和skoog，1962，physiol.plant[植物生理学]15：473-497)，0.1g/l肌醇，10mg/l美罗培南，0.1mg/l间拓扑林，30mg/l大观霉素二盐酸盐，0.1ug/l，40g/l蔗糖，6g/lbacto琼脂，ph5.6)。允许ea生长，并定期修剪漂白的叶子。暴露于大观霉素后约三周内，观察到绿色部分或整个绿色叶子。该绿色组织也表达了ds-red，证实来自php92349的t-dna已被整合。为了生根，将转基因事件转移至bio-domesponge生根材料(parkseedco.，3507cokesburyroad，hodges，sc)。转移到bio-domesponge生根材料后，在1至3周内形成根，将植物盆栽并转移到温室或生长室中。在对照实验中，仅使用含有“性状”质粒php92349的单一农杆菌，从八百二十三(823)个农杆菌感染的ea中仅回收三(3)株转基因t0植物，转化频率为0.4％。当使用含有php92349(“性状”表达盒)的农杆菌和含有php90094(形态发生基因(wus)表达盒)的农杆菌的1∶1混合物时，从三百七十(370)个农杆菌感染的ea中回收到六株转基因t0植物-，转化频率为1.6％。另外，所有含“性状”的转基因t0植物均不含形态发生基因(wus)表达盒。这证明了使用两种农杆菌的混合物赋予形态发生刺激而不整合形态发生基因表达盒的优点，提高了向日葵的转化效率。实例19：从一个细菌菌株共递送两种t-dna质粒使用两种农杆菌(每种包含两种质粒中的一种)的混合物递送性状基因表达盒和形态发生基因表达盒的替代方案是使用包含两种不同t-dna的单个农杆菌。这是通过构建包含两种t-dna的单个质粒或通过使用两个单独的质粒来实现的，其中一个包含性状基因表达盒t-dna，另一个质粒包含形态发生基因表达盒t-dna。玉蜀黍近交系在许多形态和生理特性上各不相同。这种变异性的一种表现是不同近交系的未成熟胚盾片在农杆菌感染和共培养期间对t-dna递送和整合的敏感性。例如，当将两种细菌菌株中包含的质粒混合物用于转化非硬茎近交hc69时，许多细胞仅接受其中一个质粒，因此不会被刺激以迅速形成新的体细胞胚并产生具有性状的转基因事件。代替用于递送质粒混合物的不同比例的agro1：agro2，从同一细菌细胞中递送质粒混合物可以导致接收两种t-dna的细胞的频率更高，并允许更高频率的转基因事件产生。当用于转化时，预期更高频率的快速形成的体细胞胚，并将产生包含单拷贝性状基因表达盒t-dna而没有载体(质粒)dna且未整合形态发生基因表达盒t-dna的所得t0植物。实例20：使用具有不同复制起点的t-dna质粒来调节质粒拷贝数对于这些实验，通过将具有不同复制起点(ori)的两种质粒上携带这些t-dna，以不同的比例(相对于彼此)从单个细菌细胞递送两种不同的t-dna。不同的ori在细菌细胞中维持的质粒数量不同。不同的ori可用于滴定质粒拷贝数，以在同一细菌细胞中获得不同比例的质粒。在该实验中，设计一种质粒，该质粒在相同的细菌细胞内具有一个或多个选自以下ori的ori：bbr1ori；psaori；psa+pardeori；pvs1ori；repabcori；rk2ori；rk2+pardeori；或rsf1010ori(美国专利公开20180216123和wo2017078836，通过引用整体并入本文)。在这些不同的ori中，先前已经确定，在农杆菌中，pvs1赋予高质粒拷贝数(约20个拷贝/细胞)，而repabc赋予低拷贝数(约1-2个拷贝/细胞)(zhi等人，2015，plantcellrep.[植物细胞报告]34：745-754)。表13.为了验证该概念，用导致高质粒拷贝数(pvs1)的ori和含有性状基因表达盒如zs-green和hra的t-dna构建第一质粒。用导致低拷贝数(repabc)的ori和包含形态发生基因表达盒(wus2)的t-dna构建第二质粒。将两种质粒都引入单个农杆菌中。当将位于同一细菌细胞中的质粒共递送到同一植物细胞中时，递送的t-dna的相对比例将反映这些质粒在农杆菌中的稳定比例。以这种方式，与混合两种含有性状基因表达盒t-dna或形态发生基因表达盒t-dna的不同农杆菌的方法(即，以90％/10％agro1和agro2混合物)相比，产生类似的效果。与农杆菌混合法相似，从同一细菌菌株递送质粒混合物可导致接受两种t-dna的细胞的频率更高，并允许更高的转化频率。当用于转化时，预期更高频率的快速形成的体细胞胚，并将产生包含单拷贝性状基因表达盒t-dna而没有载体(质粒)dna且未整合形态发生基因表达盒t-dna的所得t0植物。实例21.在t-dna外部使用阻遏基因表达盒来阻遏t-dna内选择标记的表达使用的农杆菌菌株lba4404thy-除了t-dna外的同源阻遏表达基因盒外，还携带包含阻遏/去阻遏选择标记的质粒携带的t-dna。例如，农杆菌质粒包含以下t-dna：rb+camv35spro：top3：：nptii：：piniiterm+lb，其中top3表示camv35s启动子在tata框周围具有与转录起始位点重叠的三个四环素阻遏物结合序列(操纵子序列)，以及位于左边界外的ubi1zmpro：：tetr：：pinii。除了上述配置中所述的表达盒外，还可以添加t-dna内的性状基因表达盒(使用示例性性状zs-green1)和t-dna外的形态发生基因表达盒(使用wus2)，得到以下农杆菌质粒：rb+sb-ubipro：：zs-green1：：os-ubiterm+camv35spro：top3：：nptii：：piniiterm+lb+ubi1zmpro：：tetr：：pinii+pltp：：wus2：：in2-1term(缩写rb+zs-green+repressiblenptii+lb+tetr+wus2)。通过农杆菌感染将该第二种配置(rb+zs-green+repressiblenptii+lb+tetr+wus2)从近交hc69引入玉蜀黍未成熟胚中。在大多数回收的转基因事件中，预期仅t-dna(包含性状基因表达盒和选择标记基因表达盒)整合，而tetr和wus2基因表达盒不整合，导致tetr和wus2基因的瞬时表达。因此，wus2刺激的体细胞胚形成增加了转化频率，而瞬时tetr表达导致nptii表达受到暂时阻遏。感染后培养一周后，将转基因细胞转移到含有150mg/lg418的培养基中。预期容易选择包含整合的t-dna(具有性状基因表达盒和选择标记基因表达盒)的形成的体细胞胚，并且产生高频率的可育转基因植物。实例22.在t-dna外部使用dcas9：阻遏物融合表达盒来阻遏t-dna内选择标记的表达使用的农杆菌菌株lba4404thy-除了t-dna外的dcas9-阻遏物表达盒外，还携带包含驱动选择标记表达的组成型启动子的质粒携带的t-dna。例如，农杆菌质粒包含以下t-dna：rb+ubi1zmpro：：nptii：：piniiterm+lb和位于左边界外的ubi1zmpro：：dcas：ear：：pinii，其中ear表示与dcas9框内融合的阻遏肽的序列。除了上述配置中所述的表达盒外，还可以添加t-dna内的性状基因表达盒(使用示例性性状zs-green1)和t-dna外的形态发生基因表达盒(使用wus2)，得到以下农杆菌质粒：rb+sb-ubipro：：zs-green1：：os-ubiterm+camv35spro：top3：：nptii：：piniiterm+lb+ubi1zmpro：：dcas9：ear：：pinii+zmu6pro：：grna：：zmu6term+pltp：：wus2：：in2-1term(缩写rb+zs-green+repressiblenptii+lb+dcas9：ear+grna+wus2)。通过农杆菌感染将该第二种配置(rb+zs-green+repressiblenptii+lb+dcas9：ear+grna+wus2)从近交hc69引入玉蜀黍未成熟胚中。在大多数回收的转基因事件中，预期仅t-dna(包含性状基因表达盒和选择标记基因表达盒)整合，而dcas9：ear和wus2基因表达盒不整合，导致dcas9：ear和wus2基因的瞬时表达。因此，wus2刺激的体细胞胚形成增加了转化频率，而瞬时dcas9：ear表达导致nptii表达受到暂时阻遏。感染后培养一周后，可以将转基因细胞转移到含有150mg/lg418的培养基中。预期容易选择包含整合的t-dna(具有性状基因表达盒和选择标记基因表达盒)的形成的体细胞胚，并且产生高频率的可育转基因植物。如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“所述”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。本说明书中提到的所有专利、出版物和专利申请指示了本公开所属领域技术人员的水平。将所有专利、出版物和专利申请通过引用以其整体并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别专利、出版物或专利申请以其整体并入一样。虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述公开进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。当前第1页12当前第1页12