用双相互作用发夹探针进行的靶标介导的原位信号放大的制作方法

文档序号:19792559发布日期:2020-01-24 14:35阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一对相互作用的发夹寡核苷酸探针,其能够在固定和透性化的细胞中的核酸靶序列上相邻地杂交并相互作用以产生能够起始杂交链反应(hcr)或滚环扩增(rca)放大的单链起始子序列,所述探针对包括:

第一供臂发夹探针,其是具有双链茎的茎环寡核苷酸,包含靶序列互补单链环序列侧翼的两条互补的臂序列,其中臂序列之一(供体臂)包括单链延伸,和

第二臂受体发夹探针,其是具有双链茎的茎环寡核苷酸,包含单链环序列侧翼的两条互补的臂序列、环和包含hcr或rca起始子序列的一条臂,另一条臂具有包含至少末端靶序列互补序列的单链延伸,所述第二探针能够与所述第一探针相邻地与所述靶序列杂交,

其中,当在溶液中游离或非特异性结合时,探针能够维持其茎环结构,

其中,第一探针的环序列与靶序列的杂交打开该探针的茎,但第二探针的末端靶序列互补序列与靶序列的杂交不打开该探针的茎,且

其中,如果第一和第二探针正确地在靶序列上相邻地杂交,则第一探针的供体臂是单链且能够与第二探针的具有单链延伸的臂杂交,从而使其hcr或rca起始子序列成为单链。

2.根据权利要求1所述的探针对,其中臂受体探针的单链延伸包括与供臂探针的供体臂的茎形成部分互补的立足点序列。

3.根据权利要求1所述的探针对,其中臂受体探针的单链延伸仅包括末端的靶序列互补序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的探针对,其中所述探针是dna探针。

5.多个根据权利要求1所述的探针对的组,其中每个探针对均与靶序列的不同子序列相邻地杂交,且其中每个探针对相互作用以产生相同的单链hcr起始子序列。

6.两个根据权利要求1所述的探针对的组,其用于检测靶序列的两个等位基因变体,其包含:

第一探针对,其包括仅与第一等位基因变体杂交的供臂探针和在供臂探针杂交位置的3’与所述靶序列杂交的臂受体探针,其中所述第一探针对相互作用以产生第一单链hcr起始子序列;和

第二探针对,其包括仅与第二等位基因变体杂交的供臂探针和在供臂探针杂交位置的5’与所述靶序列杂交的臂受体探针,其中所述第二探针对相互作用以产生与第一单链hcr起始子序列不同的第二单链hcr起始子序列。

7.两个根据权利要求1所述的探针对的组,其共享相同的供臂第一探针,其中两个臂序列均为包含单链延伸的供体臂,其中,如果第一探针和两个第二探针都正确地在靶序列上相邻地杂交,则第一探针的每个供体臂都是单链且能够与具有单链延伸的一个第二探针的臂杂交,从而使其hcr或rca起始子序列成为单链,且其中每个探针对相互作用,以为同一对hcr单体产生单链hcr起始子序列。

8.一种寡核苷酸组,其包含用于选定的靶序列的至少一对根据权利要求1所述的探针和一对hcr发夹寡核苷酸单体,二者均被同一种荧光团标记,当在溶液中游离时,其能够维持其发夹结构,

其中由所述至少探针对中的每一个所产生的起始子序列能够用所述单体对启动hcr扩增。

9.一种寡核苷酸组,其包含两个根据权利要求3所述的探针对,

第一对均用第一颜色的第一荧光团标记的hcr发夹寡核苷酸单体,和第二对均用不同颜色的第二荧光团标记的hcr发夹寡核苷酸单体,

其中当在溶液中游离时,两个单体对均能够维持其发夹结构,且

其中第一单链起始子序列能够用第一对hcr发夹单体起始hcr扩增,但不能用第二对起始hcr扩增,且第二单链起始子序列能够用第二对hcr发夹单体起始hcr扩增,但不能用第一对起始hcr扩增。

10.一种用于在细胞样品中检测靶序列的sm-fish方法,所述细胞样品包括或者怀疑包括含有靶序列的核酸靶标分子,所述方法包括:

a)固定和透性化样品中的细胞;

b)洗涤经固定和透性化的细胞;

c)将含有经洗涤的细胞的样品与至少一对根据权利要求1所述的相互作用的发夹探针一起孵育,以产生用于hcr聚合或用于rca聚合的单链起始子序列;

d)优选但非强制性地,洗涤经孵育的细胞以除去未杂交的探针;

e)在步骤c)或步骤d),如果包括的话,之后,添加聚合试剂并孵育以产生扩增产物,所述聚合试剂对于hcr信号放大包含至少一对荧光团标记的hcr单体,或者对于rca信号放大包含至少一种环状dna模板和dna聚合酶;

f)洗掉过量(未使用)的hcr发夹寡核苷酸单体或过量(未使用)的rca环状模板;

g)对于rca信号放大,针对每个靶序列添加并孵育荧光团标记的检测探针;和

h)通过显微镜或流式细胞术检测所述细胞中的荧光。

11.根据权利要求10所述的方法,其中至少一对相互作用的发夹杂交探针由单独一对组成。

12.根据权利要求10所述的方法,其中细胞包括或怀疑包括靶序列的两种密切相关的变体中的一种或两种,且其中至少一对相互作用的发夹探针包含两对根据权利要求6所述的相互作用的发夹探针。

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