修饰后诺如病毒VP1蛋白和包含修饰后诺如病毒VP1蛋白的VLP的制作方法

本发明涉及修饰后诺如病毒(norovirus)vp1蛋白、包含修饰后诺如病毒vp1蛋白的vlp以及其产生方法。

背景技术：

由诺如病毒感染造成的全球疾病负担较重，估计与全世界所有腹泻病例的20％相关并且每年死亡人数超过20万人。诺如病毒是北美洲食源性疾病爆发的主要原因，也是老年人当中大部分医院获得性爆发的病原体。诺如病毒株还被认为是全球小儿胃肠道疾病的主要原因。

诺如病毒包括杯状病毒科(caliciviridae)的多个属之一。人类诺如病毒基因组是编码三个开放阅读框(orf)并由vpg蛋白在其5’端封端的单链正义rna分子。orf1编码六种非结构性病毒蛋白，包含vpg、rna依赖性rna聚合酶和病毒蛋白酶。orf2编码主要结构性衣壳蛋白(vp1)。orf3编码次要衣壳蛋白(vp2)。

vp1包括2个结构域：壳体(s)结构域和突起(p)结构域(protrudingdomain)。例如gi.1毒株的s结构域包括前225个n端氨基酸并且含有衣壳组装以及病毒二十面体的形成所需的结构要素。p结构域包括vp1蛋白的剩余部分且进一步包括p1亚结构域和p2亚结构域。p2亚结构域被称为高变结构域并且被认为在受体结合和免疫反应性方面起到重要作用。

vp1蛋白通过p结构域介导的蛋白质相互作用形成二聚体。二聚化增加病毒粒子衣壳的稳定性并且使得形成由s结构域形成的诺如病毒颗粒的碱基核心延伸的突起。在表达时，诺如病毒vp1蛋白可自动组装以形成2个病毒粒子结构：180-mer衣壳结构，具有t＝3二十面体对称，直径为38-40nm；以及60-mer衣壳结构，具有t＝1二十面体对称，直径为23nm。

次要结构蛋白vp2具有大约21kda至24kda的分子量(mw)。研究表明vp2是高度碱性的并且位于衣壳内部。vp2的功能尚未充分了解，但普遍认为其通过防止病毒粒子分解和降解而在衣壳稳定性方面发挥重要作用(ertolotti-ciarleta.、crawfords.e.、hutsona.m.、estesm.k.2003，病毒学杂志(j.virol.)77：11603-11615)。vp2还可能在rna基因组封装期间起到作用。vp2次要结构蛋白在病毒粒子中的量相对较低，其中1.5至8个拷贝并入成熟病毒粒子。bertolotti-ciarlet等人(2003)报告，在昆虫和哺乳动物细胞中，由vp1/vp2构成的vlp比仅含有vp1的vlp更耐蛋白酶裂解，且vp2的顺式表达使得vp1蛋白产量增加。另外，orf2基因下游的3’utr的存在增加nvorf2mrna的稳定状态水平。当表达驻留在同一构建体上且在一个启动子的调控下的orf2+orf3+3’utr时，观察到vp1表达的最大增加。vp2的反式表达并未引起vp1表达的任何增加，从而指示orf2-orf2-3’utr的亚基因组组织为vp1产量的观察到的增加所需。

诺如病毒是根据其vp1氨基酸序列的系统发育聚类进行分类的。目前为止，已分类出七个基因群(gi至gvii)，其中已知仅gi、gii和giv会感染人类。在目前与人类感染相关的32个特定基因型中，gii.4诺如病毒为大部分近期诺如病毒爆发的原因。gii.4的新毒株每两至三年出现一次，通过由表位中的突变驱动的过程进化，所述表位决定vp1的高变p2结构域的区。这个过程允许诺如病毒逃避先前暴露于较早毒株所获得的体液免疫应答。

在面临使诺如病毒株迅速进化和遗传多样化的困难的同时，其它挑战使得有效诺如病毒疫苗的开发情况恶化。举例来说，直到最近，人类诺如病毒仍不能在细胞培养中生长，且即使现在，仍缺乏用于vlp和减毒活诺如病毒的稳固细胞培养系统。

疫苗开发的另一个挑战在于对于诺如病毒感染的免疫是毒株和基因型特异性的，针对其它基因组具有最小交叉免疫。此外，对诺如病毒株的免疫并不是终生的，且估计从任何时候开始持续六个月到九年。

已采取各种方法来开发抵抗诺如病毒感染的合适疫苗，所述方法包含在昆虫和植物表达系统中产生重组诺如病毒蛋白。

huo等人(病毒研究(virusresearch)，2015，204：1-5)证实在昆虫sf9细胞中产生的诺如病毒vp1vlp的m27g突变衣壳蛋白使得产生包括58kda和55kda蛋白的38nm和21nmvlp。55kda蛋白是全长p1衣壳蛋白的降解或裂解的结果，而不是内部起始密码子的转译产物。包括vp1蛋白的26或38个缺失氨基酸残基的n端缺失突变体使得产生21nmvlp。26个氨基酸缺失的突变体产生较低数量的38nmvlp，而38个氨基酸缺失的突变体未形成38nmvlp。

us2013/0273105教示包括来源于基因组i(g1)、基因组ii(gii)或共有病毒序列的抗原肽、蛋白质或vlp的诺如病毒制剂的产生。诺如病毒抗原可包含表达在vlp中的衣壳蛋白的变异体。

us2015/0023995提供一种疫苗制剂，其包括在昆虫sf9细胞中产生的vlp，所述vlp包括来源于至少两个病毒蛋白序列的复合氨基酸序列。举例来说，描述了包括来自gii.4minerva2006-a以及gii.4laurens2006-b和gii.4houston2002诺如病毒株的vp1序列的复合gii.4vp1vlp。还描述了来源于gii.1、gii.2snowmountain和gii.3的复合序列，以及来源于norwalkgi.1、southamptongi.1和chibagi.1的gi复合序列。

mason等人(美国科学院院报(procnatlacadsciu.s.a.)，1996，93(11)：5335-40)教示基因工程烟草植物和马铃薯块茎表达来自天然vp1蛋白的gi.1诺如病毒vlp的用途。植物产生的诺如病毒vlp在形态上和物理上都类似于在昆虫细胞中产生的38nmnorwalkvlp。经口施用来自天然衣壳蛋白的经过纯化的烟草产生的norwalkvlp或表达gi.1衣壳蛋白的马铃薯块茎诱导小鼠和人类的体液免疫应答(tacket等人，传染病杂志(j.infect.dis.)，2000，182(1)：302-5)。

huang等人(生物技术与生物工程(biotechnol.bioeng.)，2009，103(4)：706-14)描述了一种用于在植物中产生gi.1诺如病毒vlp的双生病毒来源dna复制子载体。在本氏烟(nicotianabenthamiana)中共同递送大豆矮黄病毒来源载体和rep/repa供应载体引起迅速且稳固的蛋白质产生。

技术实现要素：

本发明涉及修饰后诺如病毒蛋白、包括修饰后诺如病毒蛋白的病毒样颗粒(vlp)和产生诺如病毒蛋白的方法，以及包括修饰后诺如病毒蛋白的病毒样颗粒(vlp)。

本发明的目的在于产生修饰后诺如病毒蛋白、包括修饰后诺如病毒蛋白的vlp，且在于在植物中产生包括修饰后诺如病毒蛋白的vlp。

如本文中所描述，提供了一种重组多核苷酸，其包括编码修饰后诺如病毒vp1蛋白的核苷酸序列，其中所述修饰后诺如病毒vp1蛋白包括：在以下氨基酸处的一个或一个以上取代、修饰或突变：

在选自与诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43、57、84和94序列比对的位置的氨基酸，

与诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，

对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的39至46位的突变成序列sstavata的氨基酸，或

其组合，且

所述核苷酸序列不是来源于基因型gi.1诺如病毒vp1。

还提供一种如上文所描述的重组多核苷酸，其中所述核苷酸序列来源于选自由以下组成的组的诺如病毒vp1：gi.2、gi.3、gi.5、gi.7、gii.2、gii.3、gii.4、gii.6、gii.12和gii.17。举例来说(不应被视为限制性的)，所述核苷酸序列可来源于由以下组成的组：g1.2/leuven/2003/belgi.3/s29/2008/lillaedet/sweden、gi.5/siklos-hun5407/2013/hun、gi.7/usa/2014/ga5043、gii.2/cgmh47/2011/tw、gii.3/jingzhou/2013402/chn、gii.4/sydney/nsw0514/2012/au、gii.6/ohio/490/2012/usa、gii.12/hs206/2010/usa和gii.17_kawa_2014_a0a077kvu6。

上文所描述的所述重组多核苷酸可包括独立地选自以下的特定取代、修饰或突变：

在与vp1基因型gi.1的氨基酸43序列比对的位置处变为缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸的取代、修饰或突变；

在与vp1基因型gi.1的氨基酸57序列比对的位置处变为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸的取代、修饰或突变；

在与vp1基因型gi.1的氨基酸84序列比对的位置处变为丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸的取代、修饰或突变；以及

在与vp1基因型gi.1的氨基酸94序列比对的位置处变为亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸的取代、修饰或突变。

上文所描述的所述重组多核苷酸中的任一个还可针对人类密码子使用、增大gc含量或其组合进行优化。

本文还描述了一种由上文所描述的重组多核苷酸中的任一种编码的修饰后诺如病毒vp1蛋白。此外，还公开了一种vlp，其包括由上文所描述的重组多核苷酸中的任一种编码的所述修饰后诺如病毒vp1蛋白。包括由上文所描述的重组多核苷酸中的任一种编码的所述诺如病毒vp1蛋白的所述vlp可进一步包括诺如病毒vp2蛋白。

本文还提供一种在植物、植物的部分或植物细胞中产生修饰后诺如病毒vp1的方法。所述修饰后诺如病毒vp1可由上文所描述的重组多核苷酸中的任一种编码。所述方法包括将上文所描述的重组多核苷酸中的一种或一种以上引入到所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞中，以及在允许表达所述一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白的条件下培育所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞。本文提供的所述方法可进一步包括收获所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞的步骤。另外，所述方法可包括从所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞浸提、纯化或浸提并纯化所述一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白的步骤。此外，在所述引入步骤中，所述方法可进一步包括将编码诺如病毒vp2蛋白的第二核酸序列引入到所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞中，且在所述培育步骤中，所述条件允许在所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞中共表达并共产生所述一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白和所述诺如病毒vp2蛋白。

还描述了一种用于在植物、植物的部分或植物细胞中产生诺如病毒样颗粒(vlp)的方法，其中所述vlp包括由上文所描述的重组多核苷酸中的一种或多种编码的一种或一种以上所述修饰后诺如病毒vp1蛋白。所述方法包括将上文所描述的重组多核苷酸中的一种或一种以上引入到所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞中，以及在允许表达所述一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白的条件下培育所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞，从而产生所述诺如病毒vlp。本文提供的所述方法可进一步包括收获所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞的步骤。另外，所述方法可包括从所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞浸提、纯化或浸提并纯化所述诺如病毒vlp的步骤。此外，在所述引入步骤中，所述方法可进一步包括将编码诺如病毒vp2蛋白的第二核酸序列引入到所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞中，且在所述培育步骤中，所述条件允许在所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞中共表达并共产生所述修饰后诺如病毒vp1蛋白和所述诺如病毒vp2蛋白，从而产生所述诺如病毒vlp。通过本文所描述的所述方法产生的所述诺如病毒vlp可具有约15nm至50nm的直径。或者，所述vlp可具有约23nm(对于t＝1二十面体对称而言)或约38nm(对于t＝3二十面体对称而言)。

本文提供一种产生抗体或抗体片段的方法，其中所述方法包括向受试者或宿主动物施用由上文所描述的所述重组多核苷酸中的一种或一种以上编码的所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上，或包括所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上的所述诺如病毒vlp，从而产生所述抗体或所述抗体片段。

本文还提供一种植物、植物的部分或植物细胞，其包括上文所描述的所述重组多核苷酸、由所述重组多核苷酸中的一种或一种以上编码的所述修饰后诺如病毒vp1或包括一种或一种以上所述修饰后诺如病毒vp1蛋白的所述诺如病毒vlp。

本文还描述一种用于诱导免疫应答的组合物。所述组合物包括有效剂量的由上文所描述的所述重组多核苷酸中的一种或一种以上编码的所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上，或包括所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上的所述诺如病毒vlp，以及药学上可接受的载剂、佐剂、媒剂或赋形剂。

本公开还提供一种用于诱导免疫应答的疫苗，其中所述疫苗包括有效剂量的由上文所描述的所述重组多核苷酸中的一种或一种以上编码的所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上，或包括所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上的所述vlp。

诺如病毒的多个毒株已得到表征，且诺如病毒株可随着时间推移而进化。因此，本公开还涉及来自诺如病毒的vp1和vp2蛋白，其展现与图2a和2b中所列的任一所述诺如病毒株的所述vp1蛋白、所述vp2蛋白或所述vp1和vp2蛋白的约30％至100％或其间任何量的氨基酸序列同一性，前提是所述vp1蛋白可表达于植物中，且当向受试者施用所述vp1蛋白时，所述vp1蛋白诱导所述受试者对诺如病毒的免疫。举例来说，诺如病毒株包含与图2a和2b中所列的任一所述毒株的所述vp1蛋白、所述vp2蛋白或所述vp1和所述vp2蛋白具有30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％或其间的任何量的氨基酸序列同一性(序列相似性；同一性百分比；相似性百分比)的毒株，前提是所述vp1蛋白可表达于植物中，且当向受试者施用所述vp1蛋白时，所述vp1蛋白诱导所述受试者对诺如病毒的免疫。

本文提供一种抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段通过向受试者或宿主动物施用由上文所描述的所述重组多核苷酸中的一种或一种以上编码的所述修饰后诺如病毒vp1中的一种或一种以上，或包括所述修饰后诺如病毒vp1中的一种或一种以上的所述诺如病毒vlp来制备。

本文还描述一种诱导受试者对诺如病毒感染的免疫的方法，其中所述方法包括施用由上文所描述的所述重组多核苷酸中的一种或一种以上编码的所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上，或包括所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的一种或一种以上的所述诺如病毒vlp。可向所述受试者经口、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经直肠或阴道内施用所述修饰后诺如病毒vp1蛋白中的所述一种或一种以上，或所述诺如病毒vlp。

本发明内容部分不一定描述了本发明的全部特征。

附图说明

通过在下文中参照附图给出的说明，本发明的这些和其它特征将变得更加明显，在附图中：

图1a展示诺如病毒基因组以及由其转译的多聚蛋白和蛋白质的线性结构的示意图。图1b展示包括壳体(s)结构域、p1亚结构域(p1)和p2亚结构域(p2)的诺如病毒vp1蛋白的三维结构的带状图。图1c展示包括两个s结构域(s)、两个p1亚结构域(p1)和两个p2亚结构域(p2)的诺如病毒vp1蛋白二聚体的三维结构的带状图。

图2a展示几种诺如病毒vp1蛋白(上图)和vp2蛋白(下图)的uniprot和ncbi参考。图2b展示几种诺如病毒vp1核酸序列(上图)和vp2核酸序列(下图)的ncbi参考。图2c展示诺如病毒vp1蛋白的几个s结构域的比对。将诺如病毒gi.1序列(seqidno：1)用作参考序列，其它诺如病毒vp1序列(gi.2，seqidno：4；gi.3，seqidno：6；gi.5，seqidno：12；gi.7seqidno：101；gii.1，seqidno：13；gii.2，seqidno：14；gii.3，seqidno：15；gii.4，seqidno：16；gii.5，seqidno：17；gii.6，seqidno：20；gii.7，seqidno：18；gii.12，seqidno：19；gii.13，seqidno：22；gii.14，seqidno：32；gii.17，seqidno：24；以及gii.21，seqidno：26)与所述参考序列比对。vp1蛋白的gii家族的vp1氨基酸序列包括在氨基酸14至16处的3个氨基酸的缺失以及在26位的一个氨基酸的缺失，这导致giivp1序列与givp1序列之间存在4个氨基酸的比对偏差。

图3a展示由用以下物质浸渗后9天(dpi)的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page：左图：野生型(wt)人类密码子优化(hcod)gi.1/unitedstates/norwalk/1968vp1(构建体编号：2724；seqidno：3(核苷酸)；seqidno：1(氨基酸))和hcodgi.5vp1(构建体编号：3980；seqidno：33(核苷酸)；seqidno：12(氨基酸)；中间图：野生型gi.1和wthcodgii.12/unitedstates/hs206/2010vp1(构建体编号：3995；seqidno：87(核苷酸)；seqidno：19(氨基酸)；以及右图：野生型gi.1和wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012vp1(构建体编号：3760；seqidno：52(核苷酸)；seqidno：16(氨基酸))。箭头：vp1诺如病毒蛋白。每个图的第一泳道为由模拟浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物。图3b的上图使用由表达wthcodvp1gi.1/unitedstates/norwalk/1968vp1(构建体编号2724)或wthcodvp1(构建体编号2724)且与wthcodvp2(构建体编号2725)共表达的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度分离的级分的考马斯染色sds-page分析展示诺如病毒蛋白表达和vlp组装。下图展示从vp1的33％碘克沙醇梯度级分纯化的或共表达vp1和vp2蛋白的诺如病毒vlp的电子显微图。展示天然诺如病毒vlp的电子显微图以供进行比较。图3c展示由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：左图：wthcodgi.5/hungary/siklos/hun5407/2013vp1(构建体编号：3980；seqidno：33(核苷酸)；seqidno：12(氨基酸))；右图：gii.12/unitedstates/hs206/2010vp1(构建体编号：3995；seqidno：87(核苷酸)；seqidno：19(氨基酸)。图3d展示在im免疫接种一剂(第21天)和两剂(第42天)，每个制剂1μg或10μg之后，在动物的血清样本中测量的gi.1vlp特异性总igg滴度。使用涂布gi.1vlp的培养板通过elisa测量总igg滴度(loq＝100)。由具有95％置信区间的几何平均滴度(gmt)表示每个处理组(n＝8个动物/组)的总igg滴度。相同字母(a、b、c、d)：在处理组之间未检测到明显差异(p＞0.05)。

图4a展示由本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析，所述本氏烟叶表达wthcodgi.2vp1(构建体编号：3300；seqidno：5(核苷酸)；seqidno：4(氨基酸))。图4b展示从vp1的29％至35％碘克沙醇密度梯度级分纯化的诺如病毒vlp的电子显微图。

图5a展示由用以下物质浸渗后9天(dpi)的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page：wthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1(构建体编号：3979；seqidno：7(核苷酸)；seqidno：6(氨基酸))、muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/sweden_s94lvp1(构建体编号：4141；seqidno：9(核苷酸)；seqidno：8(氨基酸))或muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/sweden_q84s+s94lvp1(构建体编号：4142；seqidno：11(核苷酸)；seqidno：10(氨基酸))，含或不含wthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp2(构建体编号：3303；seqidno：95(核苷酸)；seqidno：94(氨基酸))。第一泳道：由模拟浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物。图5b展示由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1(构建体编号：3979，左图)、muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1_s94l(构建体编号：4141，中间图)、muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1_q84s+s94l(构建体编号：4142，右图)。图5c展示从由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的透射电子显微图(tem)：wthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1(构建体编号：3979，左图；图5b的级分f2+f3、f6+f7)、muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1_s94l(构建体编号：4141，中间图；图5b的级分f2至f6)或muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/swedenvp1_q84s+s94l(构建体编号：4142，右图；图5b的级分f2至f6)。15,000×放大；比例尺＝500nm。图5d展示由用muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/sweden_m57i+s94lvp1(构建体编号：4180；seqidno：171(核苷酸)；seqidno：172(氨基酸))浸渗后9天(dpi)的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page。图5e展示从由表达muthcodgi.3/s29/2008/lilaedet/sweden_m57i+s94lvp1(构建体编号：4180)的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的透射电子显微图(tem)；15,000×放大；比例尺＝500nm。图5f展示与野生型gi.3的vlp产量相比，包括在第94位氨基酸处具有取代的非天然vp1gi.3(gi.3s94；设置为“倍数变化”1)的vlp的相对产量：c编号：构建体编号。

图6a展示由用以下物质浸渗后9天(dpi)的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page：wthcodgi.1/unitedstates/norwalk/1968vp1(构建体编号：2724；seqidno：3(核苷酸)；seqidno：1(氨基酸))、wthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hunvp1(构建体编号：3980；seqidno：33(核苷酸)；seqidno：12(氨基酸))、muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_q84svp1(构建体编号：4130；seqidno：35(核苷酸)；seqidno：34(氨基酸))、muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_a94lvp1(构建体编号：4131；seqidno：37(核苷酸)；seqidno：36(氨基酸))或muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_q84s+a94lvp1(构建体编号：4132；seqidno：39(核苷酸)；seqidno：38(氨基酸))。箭头：vp1诺如病毒蛋白；第一泳道＝由模拟浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物。图6b展示由从左至右表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hunvp1(构建体编号3980)、muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_q84svp1(构建体编号：4130，左图)、muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_a94lvp1(构建体编号：4131，中间图)或muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_q84s+a94lvp1(构建体编号：4132，右图)。图6c展示从由从左至右表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的投射电子显微图(tem)：wthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hunvp1(构建体编号3980)、wthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_q84svp1(构建体编号：4130，左图)、muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_a94lvp1(构建体编号：4131，中间图)或muthcodgi.5/siklos/hun5407/2013/hun_q84s+a94lvp1(构建体编号：4132，右图)。15,000×放大；比例尺＝200nm。图6d展示由从左至右表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wthcodgi.7/ga5043/usa/2014vp1(构建体编号4209；seqidno：101(核苷酸)；seqidno：204(氨基酸))、muthcodgi.7/ga5043/usa/2014_r84s(构建体编号4210；seqidno：176(核苷酸)；seqidno：177(氨基酸))、muthcodgi.7/ga5043/usa/2014_m57i(构建体4217；seqidno：178(核苷酸)；seqidno：179(氨基酸))、muthcodgi.7/ga5043/usa/2014_m57i+r84s构建体编号4218；seqidno：180(核苷酸)；seqidno：181(氨基酸))。*获得以供进行tem分析的样本(参见图6e)。图6e展示从由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的投射电子显微图(tem)：左上：wthcodgi.7/ga5043/usa/2014vp1(构建体编号4209)，右上：muthcodgi.7/ga5043/usa/2014_r84s(构建体编号4210)；左下：muthcodgi.7/ga5043/usa/2014_m57i(构建体4217)；右下：muthcodgi.7/ga5043/usa/2014_m57i+r84s构建体编号4218)。15,000×放大；比例尺＝500nm。图6f展示与野生型gi.7的vlp产量相比，包括在第57位氨基酸处具有取代的非天然vp1gi.7(gi.7m57；设置为“倍数变化”1)的vlp的相对产量：c编号：构建体编号。

图7a展示由用以下物质浸渗后9天(dpi)的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page：wthcodgii.2/cgmh47/2011/twvp1(构建体编号：3982；seqidno：40(核苷酸)；seqidno：14(氨基酸))、muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_e80svp1(构建体编号：4143；seqidno：86(核苷酸)；seqidno：85(氨基酸))、muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_a90lvp1(构建体编号：4144；seqidno：42(核苷酸)；seqidno：41(氨基酸))或muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_e80s+a90lvp1(构建体编号：4145；seqidno：44(核苷酸)；seqidno：43(氨基酸))。箭头：vp1诺如病毒蛋白；第一泳道＝由模拟浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提浸提物。图7b展示由从左至右表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wthcodgii.2/cgmh47/2011/twvp1(构建体编号3982)、muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_e80svp1(构建体编号4143)、muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_a90l(构建体编号：4144)或muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_e80s+a90lvp1(构建体编号：4145)。图7c展示由本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析(每个图的上部分)以及从由本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提浸提物的29％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的投射电子显微图(tem)(每个图的下部分)，所述本氏烟叶表达：左上图：wthcodgii.2/cgmh47/2011/twvp1(构建体编号3982)；由上图：muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_e80s+a90lvp1(构建体编号4145)；左下图：muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_a39v+e80s+a90lvp1(构建体编号4182；seqidno：183(核苷酸)；seqidno：182(氨基酸))；右下图：muthcodgii.2/cgmh47/2011/tw_m53i+e80s+a90lvp1(构建体编号4183seqidno：185(核苷酸)；seqidno：184(氨基酸))；15,000×放大；比例尺＝500nm。

图8a展示由从左至右表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wthcodgii.3/jingzhou/2013402/chnvp1(构建体编号：3983；seqidno：45(核苷酸)；seqidno：15(氨基酸；第一图))、muthcodgii.3/jingzhou/2013402/chn_e80svp1(构建体编号：4146；seqidno：47(核苷酸)；seqidno：46(氨基酸；第二图))、muthcodgii.3/jingzhou/2013402/chn_a90lvp1(构建体编号：4147；seqidno：49(核苷酸)；seqidno：48(氨基酸；第三图))或muthcodgii.3/jingzhou/2013402/chn_e80s+a90lvp1(构建体编号：4148，seqidno：51(核苷酸)；seqidno：50(氨基酸；第四图))。图8b展示从由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的投射电子显微图(tem)：wthcodgii.3/jingzhou/2013402/chnvp1(构建体编号3983，第一图)或muthcodgii.3/jingzhou/2013402/chn_e80svp1(构建体编号：4146，第二图)。15,000×放大；比例尺＝500nm。

图9a展示由用以下物质浸渗后9天(dpi)的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page：wtgi.1/unitedstates/norwalk/1968vp1(构建体编号：2724；seqidno：3(核苷酸)；seqidno：1(氨基酸))、wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1(构建体编号：3760；seqidno：52(核苷酸)；seqidno：16(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_a39vvp1(构建体编号：4155；seqidno：54(核苷酸)；seqidno：53(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_v47pvp1(构建体编号：4156；seqidno：56(核苷酸)；seqidno：55(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_r53ivp1(构建体编号：4157；seqidno：58(核苷酸)；seqidno：57(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80svp1(构建体编号：4133；seqidno：60(核苷酸)；seqidno：59(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_s90lvp1(构建体编号：4134；seqidno：62(核苷酸)；seqidno：61(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_δ35-42vp1(构建体编号：4158；seqidno：64(核苷酸)；seqidno：63(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_sstavatavp1(构建体编号：4159；seqidno：66(核苷酸)；seqidno：65(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+a39v(构建体编号：4165；seqidno：68(核苷酸)；seqidno：67(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+v47pvp1(构建体编号：4166；seqidno：70(核苷酸)；seqidno：69(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+r53ivp1(构建体编号：4167；seqidno：72(核苷酸)；seqidno：71(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+s90lvp1(构建体编号：4135；seqidno：74(核苷酸)；seqidno：73(氨基酸))、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+δ35-42vp1(构建体编号：4168；seqidno：76(核苷酸)；seqidno：75(氨基酸))或muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+sstavatavp1(构建体编号：4169；seqidno：78(核苷酸)；seqidno：77(氨基酸))。箭头：vp1诺如病毒蛋白；第一泳道＝由模拟浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物。图9b展示从由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的考马斯染色sds-page分析(上图)和投射电子显微图(tem；下图；15,000x放大；比例尺＝200nm)：wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1(构建体编号：3760)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80svp1(构建体编号：4133)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_s90lvp1(构建体编号：4134)、gii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+s90lvp1(构建体编号：4135)。图9c展示从由表现以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的考马斯染色sds-page分析(上图)和投射电子显微图(tem；下图；15,000x放大；比例尺＝200nm)：wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1(构建体编号：3760)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80svp1(构建体编号：4133)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_a39vvp1(构建体编号：4155)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+a39v(构建体编号：4165)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_δ35-42vp1(构建体编号：4158)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+δ35-42vp1(构建体编号：4168)。图9d展示从由表现以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的考马斯染色sds-page分析(上图)和投射电子显微图(tem；下图；15,000x放大；比例尺＝200nm)：wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1(构建体编号：3760)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80svp1(构建体编号：4133)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_r53ivp1(构建体编号：4157)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_r53i+p80svp1(构建体编号：4167)。图9e展示从由表现以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的考马斯染色sds-page分析：wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1(构建体编号：3760)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80svp1(构建体编号：4133)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_v47pvp1(构建体编号：4156、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80s+v47pvp1(构建体编号：4166)。图9f展示从由表现以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的考马斯染色sds-page分析：wthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1(构建体编号：3760)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_p80svp1(构建体编号：4133)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_sstavatavp1(构建体编号：4159)、muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_sstavata+p80svp1(构建体编号：4169)。图9g展示由表现本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析(上图)以及从由本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的透射电子显微图(tem)，所述本氏烟叶表达：左图：muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_r53i+p80svp1(构建体编号4167)；右图：muthcodgii.4/sydney/nsw0514/2012/au_a39v+r53i+p80svp1(构建体编号4186；seqidno：191(核苷酸)；seqidno：190(氨基酸))；15,000×放大；比例尺＝500nm。图9h展示与野生型(天然)gii.4/2012相比，包括在第80位氨基酸处具有取代的非天然vp1gii.4/2012(gii.4/2012p80；设置为“倍数变化”1；c编号：构建体编号)的vlp的相对产量。图9i展示与包括a39的gii.4/2012(p80s)的vlp产量相比，包括在第39位氨基酸处具有另一取代的vp1gii.4/2012(p80s)的vlp的相对产量。gii.4/2012(p80s)a39设置为“倍数变化”1；c编号：构建体编号。

图10a展示由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wthcodgii.6/ohio/490/2012/usavp1(构建体编号：3993；seqidno：21(核苷酸)；seqidno：20(氨基酸))和wthcodgii.6/hs245/2010/usavp2(构建体编号：3307；seqidno：97(核苷酸)；seqidno：96(氨基酸))、muthcodgii.6/ohio/490/2012/usa_e80svp1(构建体编号：4149；seqidno：80(核苷酸)；seqidno：79(氨基酸))和wthcodgii.6/hs245/2010/usavp2(构建体编号：3307)、muthcodgii.6/obio/490/2012/usa_s90lvp1(构建体编号：4150；seqidno：82(核苷酸)；seqidno：81(氨基酸))和wthcodgii.6/hs245/2010/usavp2(构建体编号3307)或muthcodgii.6/ohio/490/2012/usa_e80s+s90lvp1(构建体编号：4151；seqidno：84(核苷酸)；seqidno：83(氨基酸))和wthcodgii.6/hs245/2010/usavp2(构建体编号：3307)。图10b展示从由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的透射电子显微图(tem)：wthcodgii.6/ohio/490/2012/usavp1(构建体编号：3993)和wthcodgii.6/hs245/2010/usavp2(构建体编号：3307)、muthcodgii.6/ohio/490/2012/usa_s90lvp1(构建体编号：4150)和wthcodgii.6/hs245/2010/usavp2(构建体编号：3307)。15,000×放大；比例尺＝200nm。

图11a展示由用以下物质浸渗后9天的农杆菌浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的考马斯染色sds-page：wthcodgi.1/unitedstates/norwalk/1968vp1(构建体编号：2724；seqidno：3(核苷酸)；seqidno：1(氨基酸))、wthcodgii.12/hs206/2010/usavp1(构建体编号：3995；seqidno：87(核苷酸)；seqidno：19(氨基酸))、muthcodgii.12/hs206/2010/usa_e80svp1(构建体编号：4136；seqidno：89(核苷酸)；seqidno：88(氨基酸))、muthcodgii.12/hs206/2010/usa_a90lvp1(构建体编号：4137；seqidno：91(核苷酸)；seqidno：90(氨基酸))或muthcodgii.12/hs206/2010/usa_e80s+a90lvp1(构建体编号：4138；seqidno：93(核苷酸)；seqidno：92(氨基酸))。第一泳道＝由模拟浸渗本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物。图11b展示由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析：wtgii.12/hs206/2010/usavp1(构建体编号：3995)、gii.12/hs206/2010/usa_e80svp1(构建体编号：4136)、gii.12/hs206/2010/usa_a90lvp1(构建体编号：4137)或gii.12/hs206/2010/usa_e80s+a90lvp1(构建体编号：4138)。图11c展示从由表达以下物质的本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的透射电子显微图(tem)：wtgii.12/hs206/2010/usavp1(构建体编号：3995，第一图)、gii.12/hs206/2010/usa_p80svp1(构建体编号：4136，第二图)、gii.12/hs206/2010/usa_s90lvp1(构建体编号：4137，第三图)或gii.12/hs206/2010/usa_p80s+s90lvp1(构建体编号：4138，第四图)。15,000×放大；比例尺＝500nm。图11d展示由本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sds-page分析(每个图的上部分)以及从由本氏烟叶制备的粗蛋白质浸提物的31％至35％碘克沙醇梯度级分纯化的病毒样颗粒(vlp)的投射电子显微图(tem)(每个图的下部分)，所述本氏烟叶表达：左上图：wthcodgii.17kawa2014a0a077kvu6vp1(构建体编号3998；seqidno：25(核苷酸)；seqidno：24(氨基酸))；右上图：muthcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_a90lvp1(构建体编号4232；seqidno：197(核苷酸)；seqidno：196(氨基酸))；左下图：muthcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_a39vvp1(构建体编号4234；seqidno：193(核苷酸)；seqidno：192(氨基酸))；右下图：muthcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_r53ivp1(构建体编号4235；seqidno：195(核苷酸)；seqidno：194(氨基酸))；15,000×放大；比例尺＝500nm。

图12a展示vp1gi.1unitedstatesnorwalk1968的氨基酸序列(seqidno：1)；图12b展示野生型vp1gi.1unitedstatesnorwalk1968的核酸序列(seqidno：2)；图12c展示hcodvp1gi.1unitedstatesnorwalk1968的核酸序列(seqidno：3)。

图13a展示vp1g1.2leuven2003d2del3的氨基酸序列(seqidno：4)；图13b展示hcodvp1g1.2leuven2003d2del3的核酸序列(seqidno：5)。

图14a展示vp1gi.3lillaedet2008h2dg70的氨基酸序列(seqidno：6)；图14b展示hcodgi.3lillaedet2008h2dg70的核酸序列(seqidno：7)。

图15a展示vp1gi.5sikloshun54072013hunahw99832的氨基酸序列(seqidno：12)。图15b展示hcodvp1gi.5sikloshun54072013hunahw99832的核酸序列(seqidno：33)。

图16a展示gi.7/ga5043/usa/2014vp1的氨基酸序列(seqidno：101)。图16b展示gi.7/ga5043/usa/2014vp1的核酸序列(seqidno：175)。图16c展示vp1gii.1ascension2082010usaafa55174的氨基酸序列(seqidno：13)。

图17a展示vp1gii.2cgmh472011twagt39206的氨基酸序列(seqidno：14)。图17b展示hcodvp1gii.2cgmh472011twagt39206的核酸序列(seqidno：40)。

图18a展示vp1gii.3jingzhou2013402chnagx01095的氨基酸序列(seqidno：15)。图18b展示hcodvp1gii.3jingzhou2013402chnagx01095的核酸序列(seqidno：45)。

图19a展示vp1gii.4sydneynsw05142012的氨基酸序列(seqidno：16)。图19b展示hcodvp1gii.4sydneynsw05142012的核酸序列(seqidno：52)。图19c展示vp1us96：gii.4dresden1741997deay741811的氨基酸序列(seqidno：27)。图19d展示vp1fh02：gii.4farmingtonhills2002usay502023的氨基酸序列(seqidno：28)。图19e展示p1hnt04：gii.4hunter-nsw504d2004audq078814的氨基酸序列(seqidno：29)。图19f展示vp12006b：gii.4shellharbour-nsw696t2006auef684915的氨基酸序列(seqidno：30)。图19g展示vp1no09：gii.4orange-nsw001p2008augq845367的氨基酸序列(seqidno：31)。

图20展示vp1gii.5alberta2013caalt54485的氨基酸序列(seqidno：17)。

图21a展示vp1gii.6ohio2012m9t020的氨基酸序列(seqidno：20)。图21b展示hcod优化vp1gii.6ohio2012m9t020的核酸序列(seqidno：21)。

图22展示vp1gii.7musa2010aii73774的氨基酸序列(seqidno：18)。

图23a展示vp1gii.12_hs206_2010_usa_aei29586的氨基酸序列(seqidno：19)；图23b展示hcodvp1gii.12_hs206_2010_usaaei29586的核酸序列(seqidno：87)。

图24a展示vp1gii.13va1732010h9awu4的氨基酸序列(seqidno：22)。图24b展示人类密码子优化vp1gii.13va1732010h9awu4的核酸序列(seqidno：23)。

图25展示vp1gii.14saga2008jpnade28701的氨基酸序列(seqidno：32)。

图26a展示vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6的氨基酸序列(seqidno：24)。图26b展示人类密码子优化vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6的核酸序列(seqidno：25)。

图27展示vp1gii.21sali2011usaafc89665的氨基酸序列(seqidno：26)。

图28a展示修饰后vp1gi.3_lil08_q84s的氨基酸序列(seqidno：98)。图28b展示vp1gi.3_lil08_q84s的核酸序列(seqidno：167)。图28c展示vp1gi.3lil08_s94l的氨基酸序列(seqidno：8)。图28d展示hcodvp1gi.3lil08_s94l的核酸序列(seqidno：9)。图28e展示vp1gi.3lil08_q84s+s94l的氨基酸序列(seqidno：10)。图28f展示hcodvp1gi.3lil08_q84s+s94l的核酸序列(seqidno：11)。图28g展示p1gi.3lil08_a43v+s94l的氨基酸序列(seqidno：170)。图28h展示hcodvp1gi.3lil08_a43v+s94l的核酸序列(seqidno：169)。图28i展示vp1gi.3lil08_m57i+s94l的氨基酸序列(seqidno：172)。图28j展示hcodvp1gi.3lil08_m57i+s94l的核酸序列(seqidno：171)。图28k展示vp1gi.3lil08_a43v+m57i+s94l的氨基酸序列(seqidno：174)。图28l展示hcodvp1gi.3lil08_a43v+m57i+s94l的核酸序列(seqidno：173)。图28m展示vp1_gi.3_lil08_s94x的氨基酸序列(seqidno：292)；其中x选自v、i、m、t、e、d、n、q、k或h。图28n展示vp1_gi.3_lil08_s94x的人类密码子优化序列(seqidno：293)；其中x选自编码v(例如xxx＝gtg)、i(例如xxx＝atc)、m(例如xxx＝atg)、t(例如xxx＝acc)、e(例如xxx＝gag)、d(例如xxx＝gac)、n(例如xxx＝aac)、q(例如xxx＝cag)、k(例如xxx＝aag)或h(例如xxx＝cac)的密码子。

图29a展示修饰后vp1gi.5siklosq84s的氨基酸序列(seqidno：34)。图29b展示修饰后vp1gi.5siklosq84s的核酸序列(seqidno：35)。图29c展示vp1gi.5siklosa94l的氨基酸序列(seqidno：36)。图29d展示hcodvp1gi.5siklosa94l的核酸序列(seqidno：37)。图29e展示vp1gi.5siklosq84s+a94l的氨基酸序列(seqidno：38)。图29f展示hcodvp1gi.5siklosq84s+a94l的核酸序列(seqidno：39)。图29g展示修饰后vp1gi.7/ga5043/usa/2014_r84s的氨基酸序列(seqidno：177)。图29h展示修饰后vp1hcodgi.7/ga5043/usa/2014_r84s的核酸序列(seqidno：176)。图29i展示修饰后vp1gi.7/ga5043/usa/2014_m57i的氨基酸序列(seqidno：179)。图29j展示修饰后vp1hcodgi.7/ga5043/usa/2014_m57i的核酸序列(seqidno：178)。图29k展示修饰后vp1gi.7/ga5043/usa/2014_m57i+r84s的氨基酸序列(seqidno：181)。图29l展示修饰后vp1hcodgi.7/ga5043/usa/2014_m57i+r84s的核酸序列(seqidno：180)。图29m展示vp1_gi.7/ga5043/usa/2014_m57x的氨基酸序列(seqidno：290)；其中x选自l、g、s、t、n、q、k或h。图29n展示人类密码子优化vp1_gi.7/ga5043/usa/2014_m57x(seoidno：291)；其中x选自编码l(例如xxx＝ctg)、g(例如xxx＝ggc)、s(例如xxx＝agc)、t(例如xxx＝acc)、n(例如xxx＝aac)、o(例如xxx＝cag)、k(例如xxx＝aag)或h(例如xxx＝cac)的密码子。

图30a展示vp1gii.2cgmh47e80s的氨基酸序列(seqidno：85)。图30b展示hcodvp1gii.2cgmh47e80s的核酸序列(seqidno：86)。图30c展示vp1gii.2cgmh47a90l的氨基酸序列(seqidno：41)；图30d展示hcodvp1gii.2cgmh47a90l的核酸序列(seqidno：42)。图30e展示vp1_gii.2_cgmh47_e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：43)。图30f展示hcodvp1_gii.2_cgmh47_e80s+a90l的核酸序列(seqidno：44)。图30g展示vp1_gii.2_cgmh47_a39v+e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：182)。图30h展示hcodvp1_gii.2_cgmh47_a39v+e80s+a90l的核酸序列(seqidno：183)。图30i展示vp1_gii.2_cgmh47_r53i+e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：184)。图30j展示hcodvp1_gii.2_cgmh47_r53i+e80s+a90l的核酸序列(seqidno：185)。图30k展示vp1_gii.2_cgmh47_a39v+r53i+e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：186)。图30l展示hcodvp1_gii.2_cgmh47_a39v+r53i+e80s+a90l的核苷酸序列(seqidno：187)。

图31a展示vp1gii.3_jing_e80s的氨基酸序列(seqidno：46)。图31b展示hcodvp1gii.3_jing_e80s的核酸序列(seqidno：47)。图31c展示vp1gii.3_jing_a90l的氨基酸序列(seqidno：48)。图31d展示hcodvp1gii.3_jing_a90l的核酸序列(seqidno：49)。图31e展示vp1gii.3_jing_e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：50)。图31f展示hcodvp1gii.3_jing_e80s+a90l的核酸序列(seqidno：51)。

图32a展示vp1gii.4syd12a39v的氨基酸序列(seqidno：53)。图32b展示hcodvp1gii.4_syd12_a39v的核酸序列(seqidno：54)。图32c展示vp1gii.4_syd12_v47p的氨基酸序列(seqidno：55)。图32d展示hcodvp1gii.4_syd12_v47p的核酸序列(seqidno：56)。图32e展示vp1gii.4_syd12_r53i的氨基酸序列(seqidno：57)。图32f展示hcodvp1gii.4_syd12_r53i的核酸序列(seqidno：58)。图32g展示vp1；gii.4_syd12_p80s的氨基酸序列(seqidno：59)。图32h展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s的核酸序列(seqidno：60)。图32i展示vp1gii.4_syd12_s90l的氨基酸序列(seqidno：61)。图32j展示hcodvp1gii.4_syd12_s90l的核酸序列(seqidno：62)。图32k展示vp1gii.4_syd12_δ35-42的氨基酸序列(seqidno：63)。图32l展示hcodvp1gii.4_syd12_δ35-42的核酸序列(seqidno：64)。图32m展示vp1gii.4_syd12_sstavata的氨基酸序列(seqidno：65)。图32n展示hcodvp1gii.4_syd12_sstavata的核酸序列(seqidno：66)。图32o展示vp1gii.4_syd12_p80s+a39v的氨基酸序列(seqidno：67)。图32p展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s+a39v的核酸序列(seqidno：68)。图32q展示vp1gii.4_syd12_p80s+v47p的氨基酸序列(seqidno：69)。图32r展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s+v47p的核酸序列(seqidno：70)。图32s展示vp1gii.4_syd12_p80s+r53i的氨基酸序列(seqidno：71)。图32t展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s+r53i的核酸序列(seqidno：72)。图32u展示vp1gii.4_syd12_p80s+s90l的氨基酸序列(seqidno：73)。图32v展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s+s90l的核酸序列(seqidno：74)。图32w展示vp1gii.4_syd12_p80s+δ35-42的氨基酸序列(seqidno：75)。图32x展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s+δ35-42的核酸序列(seqidno：76)。图32y展示vp1gii.4_syd12_p80s+sstavata的氨基酸序列(seqidno：77)。图32z展示hcodvp1gii.4_syd12_p80s+sstavata的核酸序列(seqidno：78)。图32aa展示vp1gii.4syd12a39v+r53i的氨基酸序列(seqidno：188)。图32bb展示hcodvp1gii.4_syd12_a39v+r53i的核酸序列(seqidno：189)。图32cc展示vp1gii.4syd12a39v+r53i+p80s的氨基酸序列(seqidno：190)。图32dd展示hcodvp1gii.4_syd12_a39v+r53i+p80s的核酸序列(seqidno：191)。图32ee展示人类密码子优化vp1gii.4_syd12_p80x的核酸序列(seoidno：287)；其中x选自编码a(例如xxx＝gcc)、n(例如xxx＝aac)、k(例如xxx＝aag)或h(例如xxx＝cac)的密码子。图32ff展示vp1_gii.4_syd12_p80x的氨基酸序列(seqidno：286)；其中x选自a、n、k或h。图32gg展示vp1gii.4_syd12_p80s+a39x的人类密码子优化序列的核酸序列(seqidno：289)；其中x选自编码i(例如xxx＝atc)、m(例如xxx＝atg)、g(例如xxx＝ggc)、s(例如xxx＝agc)、e(例如xxx＝gag)、d(例如xxx＝gac)、n(例如xxx＝aac)、o(例如xxx＝cag)、k(例如xxx＝aag)或h(例如xxx＝cac)的密码子。图32hh展示vp1_gii.4_syd12_p80s+a39x的氨基酸序列(seqidno：288)；其中x选自i、m、g、s、e、d、n、q、k或h。

图33a展示vp1gii.6_ohio_e80s的氨基酸序列(seqidno：79)。图33b展示hcodvp1gii.6_ohioe80s的核酸序列(seqidno：80)。图33c展示vp1gii.6_ohio_s90l的氨基酸序列(seqidno：81)。图33d展示hcodvp1gii.6_ohio_s90l的核酸序列(seqidno：82)。图33e展示vp1gii.6_ohio_e80s+s90l的氨基酸序列(seqidno：83)。图33f展示hcodvp1gii.6_ohio_e80s+s90l的核酸序列(seqidno：84)。

图34a展示vp1gii.12_hs10_e80s的氨基酸序列(seqidno：88)。图34b展示hcodvp1gii.12_hs10_e80s的核酸序列(seqidno：89)。图34c展示vp1gii.12_hs10_a90l的氨基酸序列(seqidno：90)。图34d展示hcodvp1gii.12_hs10_a90l的核酸序列(seqidno：91)。图34e展示vp1gii.12_hs10_e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：92)；图34f展示hcodvp1gii.12_hs10_e80s+a90l的核酸序列(seqidno：93)。图34g展示vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6_a39v的氨基酸序列(seqidno：192)。图34h展示vp1hcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_a39v的核酸序列(seqidno：193)。图34i展示vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6_r53i的氨基酸序列(seqidno：194)。图34j展示vp1hcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_r53i的核酸序列(seqidno：195)。图34k展示vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6_a90l的氨基酸序列(seqidno：196)。图34l展示vp1hcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_a90l的核酸序列(seqidno：197)。图34m展示vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6_a39v+m53i的氨基酸序列(seqidno：198)。图34n展示vp1hcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_a39v+m53i的核酸序列(seqidno：199)。图34o展示vp1gii.17kawa2014a0a077kvu6_e80s+a90l的氨基酸序列(seqidno：200)。图34p展示vp1hcodgii.17kawa2014a0a077kvu6_e80s+a90l的核酸序列(seqidno：201)。

图35a展示vp2_gi.1_norwalk的氨基酸序列(seqidno：99)。图35b展示人类密码子优化vp.2_gi1_norwalk的核酸序列(seqidno：100)。

图36a展示vp2_gi.3_lil08的氨基酸序列(seqidno：94)。图36b展示人类密码子优化vp2_gi.3_lil08的核酸序列(seqidno：95)。

图37a展示vp2_gii.6_hs10的氨基酸序列(seqidno：96)。图37b展示人类密码子优化vp2_gii6_hs10的核酸序列(seqidno：97)。

图38a展示从左t-dna到右t-dna的克隆载体1190(seqidno：162)。图38b展示从2x35s启动子到nos终止子的构建体2724(seqidno：163)。图38c展示从左t-dna到右t-dna的克隆载体3677(seqidno：164)。图38d展示从2x35s启动子到nos终止子的构建体4133(seqidno：165)。图38e展示从2x35s启动子到nos终止子的构建体4135(seqidno：166)。

图39a展示构建体2724(vp1wtgi.1hcod)的示意图。图39b展示构建体3300(vp1wtgi.2hcod)的示意图。图39c展示构建体3979(vp1wtgi.3hcod)的示意图。

图40a展示构建体4140(vp1gi.3_q84shcod)的示意图。图40b展示构建体4141(vp1gi.3_s94lhcod)的示意图。图40c展示构建体4142(vp1gi.3_p84s+s94lhcod)的示意图。图40d展示构建体4179(vp1gi.3_a43v+s94lhcod)的示意图。图40e展示构建体4180(vp1gi.3_m57i+s94lhcod)的示意图。图40f展示构建体4181(vp1gi.3_a43v+m57i+s94lhcod)的示意图。

图41a展示构建体3980(vp1wtgi.5hcod(wtgi.5hcod)的示意图。图41b展示构建体4130(vp1gi.5_q84s)的示意图。图41c展示构建体4131(vp1gi.5_a94lhcod)的示意图。图41d展示构建体4132(vp1gi.5_q84s+a94lhcod)的示意图。图41e展示构建体4210(vp1gi.7_r84shcod)的示意图。图41f展示构建体4217(vp1gi.7_m57ihcod)的示意图。图41g展示构建体4218(vp1gi.7_m57i+r84shcod)的示意图。

图42a展示构建体3982(wtvp1gii.2hcod)的示意图。图42b展示构建体4143(vp1gii.2_e80s)的示意图。图42c展示构建体4144(vp1gii.2_a90lhcod)的示意图。图42d展示构建体4145(vp1gii.2_e80s+a90lhcod)的示意图。图42e展示构建体4182(vp1gii.2_a39v+e80s+a90lhcod)的示意图。图42f展示构建体4183(vp1gii.2_r53i+e80s+a90lhcod)的示意图。图42g展示构建体4184(vp1gii.2_a39v+r53i+e80s+a90lhcod)的示意图。

图43a展示构建体3983(wtvp1gii.3hcod)的示意图。图43b展示构建体4146(vp1gii.3_e80shcod)的示意图。图43c展示构建体4147(vp1gii.3_a90lhcod)的示意图。图43d展示构建体4148(vp1gii.3_e80s+a90l)的示意图。

图44a展示构建体3760(wtvp1gii.4hcod)的示意图。图44b展示构建体4155(vp1gii.4_a39vhcod)的示意图。图44c展示构建体4156(vp1gii.4_v47phcod)的示意图。图44d展示构建体4157(vp1gii.4_r53ihcod)的示意图。图44e展示构建体4133(vp1gii.4_p80shcod)的示意图。图44f展示构建体4134(vp1gii.4_s90lhcod)的示意图。图44g展示构建体4158(vp1gii.4_δ35-42hcod)的示意图。图44h展示构建体4159(vp1gii.4_sstavatahcod)的示意图。图44i展示构建体4165(vp1gii.4_a39v+p80shcod)的示意图。图44j展示构建体4166(vp1gii.4_v47p+p80shcod)的示意图。图44k展示构建体4167(vp1gii.4_r53i+p80shcod)的示意图。图44l展示构建体4135(vp1gii.4_p80s+s90lhcod)的示意图。图44m展示构建体4168(gii.4_p80s+δ35-42hcod)的示意图。图44n展示构建体4169(vp1gii.4_p80s+sstavatahcod)的示意图。图44o展示构建体4185(vp1gii.4_a39v+r53ihcod)的示意图。图44p展示构建体4186(vp1gii.4_a39v+r53i+p80shcod)的示意图。

图45a展示构建体3993(wtvp1gii.6hcod)的示意图。图45b展示构建体4149(vp1gii.6_e80shcod)的示意图。图45c展示构建体4150(vp1gii.6_s90lhcod)的示意图。图45d展示构建体4151(vp1gii.6_e80s+s90l)的示意图。

图46a展示构建体3995(wtvp1gii.12hcod)的示意图。图46b展示构建体4136(vp1gii.12_e80shcod)的示意图。图46c展示构建体4137(vp1gii.12_a90lhcod)的示意图。图46d展示构建体4138(vp1gii.12_e80s+a90l)的示意图。图46e展示构建体4234(vp1gii.17_a39v)的示意图。图46f展示构建体4235(vp1gii.17_r53i)的示意图。图46g展示构建体4232(vp1gii.17_a90l)的示意图。图46h展示构建体4236(vp1gii.17_a39v+r53i)的示意图。图46i展示构建体4233(vp1gii.17_e80s+a90l)的示意图。

图47a展示构建体2725(wtvp2gi.1)的示意图。图47b展示构建体3303(wtvp2gi.3hcod)的示意图。图47c展示构建体3307(wtvp2gii.6)的示意图。

图48展示构建体1190(克隆载体1190)的示意图。

图49展示构建体3677(克隆载体3677)的示意图。

图50a展示gii.4p80x构建体(克隆载体)的示意图，其中x选自：a(构建体4281)；n(构建体4285)；k(构建体4286)；或h(构建体4287)。图50b展示gii.4p80s+a39x构建体(克隆载体)的示意图，其中x选自：i(构建体4256)；m(构建体4257)；g(构建体4258)；s(构建体4259)；e(构建体4260)；d(构建体4261)；n(构建体4262)；q(构建体4263)；构建体k(4264)；或h(构建体4265)。

图51展示gi.7m57x构建体(克隆载体)的示意图，其中x选自：l(构建体4266)；g(构建体4268)；s(构建体4269)；t(构建体4270)；n(构建体4273)；q(构建体4274)；k(构建体4275)；或h(构建体4276)。

图52展示gi.3s94x构建体(克隆载体)的示意图，其中x选自：v(构建体4288)；i(构建体4289)；m(构建体4290)；t(构建体4292)；e(构建体4293)；d(构建体4294)；n(构建体4295)；q(构建体4296)；k(构建体4297)；或h(构建体4298)。

具体实施方式

以下描述了优选实施例。

如本文所用，术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”以及其语法变体是包含性的或开放性的，不排除其它未列举的元素和/或方法步骤。当在本文中与用途或方法结合使用时，术语“主要由......组成”表示可存在其它的元素和/或方法步骤，但这些添加不会对列举的方法或使用的功能方式产生重大影响。当在本文中与用途或方法结合使用时，术语“由......组成”排除其它元素和/或方法步骤的存在。本文描述为包括某些元素和/或步骤的用途或方法在某些实施例中也可能主要由这些元素和/或步骤组成，并且在其它实施例中由这些元素和/或步骤组成，无论是否具体提及这些实施例。另外，除非另有说明，否则单数的使用包含复数，并且“或”意味着“和/或”。本文所用的术语“多个”是指一个以上，例如两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上等。除非本文中另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本领域中的普通技术人员通常所理解的含义相同。如本文所用，术语“约”指代大致与给定值相差+/-10％。应理解，无论是否具体提及，在本文中提供的任何给定值中始终包含这种差异。词语“一”或“一个”在本文中与术语“包括”搭配使用时可意为“一个”，但其也可表示“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或一个以上”的含义。

本文所用的术语“植物”、“植物的部分”、“植物部分”、“植物物质”、“植物生物量”、“植物材料”、“植物浸提物”或“植物叶片”可包括能够提供用于表达本文所描述的一种或一种以上核酸的转录、转译和转译后机制和/或可进行对所表达蛋白质或vlp的浸提和纯化的植物整体、其组织、细胞或任何部分、细胞内植物组分、细胞外植物组分、液体或固体植物浸提物或其组合。植物可包含但不限于农作物，包含例如油菜籽；芸苔属(brassicaspp.)；玉蜀黍；烟草属(nicotianaspp.)(烟草)，例如本氏烟(nicotianabenthamiana)、黄花烟草(nicotianarustica)、红花烟草(nicotiana，tabacum)、翼柄烟草(nicotianaalata)；拟南芥(arabidopsisthaliana)；紫花苜蓿；马铃薯；红薯(甘薯；ipomoeabatatmian’huaus)；人参；豌豆；燕麦；大米；大豆；小麦；大麦；向日葵；棉花；玉米；黑麦(secalecereale)；高粱(sorghumbicolor；sorghumvulgare)；红花(carthamustinctorius)。

如本文所用的术语“植物部分”指代植物的任何部分，包含但不限于叶片、茎、根、花、果实、从叶片、茎、根、花、果实获得的植物细胞、从叶片、茎、根、花、果实获得的植物浸提物，或其组合。如本文所用的术语“植物浸提物”指代在以物理方式(例如通过冷冻，接着在合适的缓冲液中浸提)、以机械方式(例如通过研磨或均质化植物或植物部分，接着在合适的缓冲液中浸提)、以酶促方式(例如使用细胞壁降解酶)、以化学方式(例如使用一种或多种螯合剂或缓冲液)或其组合方式处理植物、植物的部分、植物细胞或其组合之后获得的植物来源产物。可进一步处理植物浸提物以去除不合需要的植物成分，例如细胞壁碎片。可获得植物浸提物以有助于从植物、植物的部分或植物细胞回收一个或多个组分，例如来自植物、植物的部分或植物细胞的蛋白质(包含蛋白质复合体、蛋白质表壳构造和/或vlp)、核酸、脂质、碳水化合物或其组合。如果植物浸提物包括蛋白质，那么其可被称为蛋白质浸提物。蛋白质浸提物可以是包括来自植物组织的一种或多种蛋白质、蛋白质复合体、蛋白质表壳构造和/或vlp的粗植物浸提物、部分纯化植物或蛋白质浸提物或纯化产物。在需要时，蛋白质浸提物或植物浸提物可使用本领域技术人员已知的技术部分纯化，例如可对浸提物进行盐或ph沉淀、离心、梯度密度离心、过滤、层析(例如尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析)或其组合。还可以使用本领域的技术人员已知的技术纯化蛋白质浸提物。

如本文所用的术语“核酸区段”指代编码所关注蛋白质的核酸的序列。除了核酸的序列以外，核酸区段还包括以可操作方式连接到核酸的序列的调控区和终止子。调控区可例如包括启动子以及以可操作方式连接到启动子的视情况存在的增强子元件。

如本文所用的术语“核酸”指代两个或两个以上核酸区段的组合。两个或两个以上核酸取代可存在于单个核酸中，使得核酸复合体包括两个或两个以上核酸区段，其中每一核酸区段受调控区和终止子的控制。或者，核酸复合体可包括两个或多个单独的核酸，每一个核酸包括一个或一个以上核酸区段，其中每一核酸区段受调控区和终止子的控制。举例来说，核酸复合体可包括包含两个核酸区段的一个核酸；核酸复合体可包括两个核酸，每一核酸包括一个核酸区段；或核酸复合体可包括两个或两个以上核酸，其中每一核酸包括一个或一个以上核酸区段。

如本文所用的术语“载体”或“表达载体”指代用于将外源性核酸序列转移到宿主细胞(例如植物细胞)中并引导外源性核酸序列在宿主细胞中的表达的重组核酸。“表达盒”指代包括受适当启动子或用于宿主细胞中的所关注核酸的转录的其它调控元件控制并可操作地(或以可操作方式)连接到所述启动子或调控元件的所述所关注核酸的核苷酸序列。本领域技术人员应了解，表达盒可包括终止(终止子)序列，其为在植物宿主中具活性的任何序列。举例来说，终止序列可来源于双组分rna病毒(例如豇豆花叶病毒(comovirus))的rna-2基因组区段；终止序列可为nos终止子；或终止序列可从紫花苜蓿质体蓝素基因的3’utr获得。

本公开的构建体可进一步包括3’非转译区(utr)。3’非转译区含有多腺苷酸化信号以及能够实现mrna加工或基因表达的任何其它调控信号。多腺苷酸化信号通常通过实现多腺苷酸踪迹到mrna启动子的3’端的添加来表征。多腺苷酸化信号通常通过与标准形式5’aataaa-3’存在同源性来识别的，虽然变异并不罕见。合适的3’非转译区的非限制实例为含有农杆菌(agrobacterium)肿瘤诱发(ti)质粒基因(例如胭脂碱合酶(nos基因))和植物基因(例如大豆贮藏蛋白)的多腺苷酸化信号、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶基因(ssrubisco；us4,962,028；其以引用的方式并入本文中)的较小亚基、用于调控质体蓝素表达的启动子的3’转录非转译区。

“调控区”、“调控元件”或“启动子”意指通常但并非总是在基因的蛋白质编码区上游的核酸部分，所述基因包括dna或rna或者dna和rna。当调控区是活性的，且与所关注的核苷酸序列以可操作方式缔合或以可操作方式连接时，可能引起所关注核苷酸序列的表达。调控元件能够调节器官特异性或控制发育或暂时基因激活。“调控区”包含启动子元件、展现基础启动子活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激而进行诱导的元件、调节启动子活性的元件(例如负调控元件)或转录增强子。如本文所用的“调控元件”还包含在转录后具活性的元件，例如调节基因表达的调控元件，例如转译和转录增强子、转译和转录抑制子、上游激活序列和mrna不稳定性决定子。后面的元件中的几个可位于编码区的近端。

在本公开的上下文中，术语“调控元件”或“调控区”通常指代经常但并非总是在结构基因的编码序列上游(5’)的dna序列，其通过提供对rna聚合酶和/或在特定位点开始转录所需的其它因子的识别控制编码区的表达。然而，应理解，位于内含子内或序列的3’的其它核苷酸序列也可有助于所关注编码区的表达的调控。提供对rna聚合酶或确保特定位点处起始的其它转录因子的识别的调控元件的实例为启动子元件。大部分但并非全部真核生物启动子元件含有tata框，其为包括通常位于转录起始位点上游的大约25个碱基对的腺苷与胸苷核苷酸碱基对的保守核酸序列。启动子元件可包括负责转录起始的基础启动子元件以及修饰基因表达的其它调控元件。

存在几种类型的调控区，包含发育调控的、可诱导的或组成性的那些调控区。为发育调控的或在其控制下控制基因的差异表达的调控区是在某些器官或器官组织的发育期间的特定时刻在所述器官或组织中激活的。然而，发育调控的一些调控区可在特定发育阶段在某些器官或组织中优先具有活性，其还可能以发育调控方式或以基本水平同样在植物内的其它器官或组织中具有活性。组织特异性调控区(例如茎特异性调控区)的实例包含油菜籽蛋白(napin)启动子和十字花科蛋白(cruciferin)启动子(rask等人，1998，植物生理学杂志(j.plantphysiol.)152：595-599；bilodeau等人，1994，植物细胞(plantcell)14：125-130)。叶片特异性启动子的实例包含质体蓝素启动子(参见us7,125,978，其以引用的方式并入本文中)。

可诱导调控区是能够响应于诱导物直接或间接激活一个或多个dna序列或基因的转录的调控区。在无诱导物时，dna序列或基因将不会被转录。通常，特异性结合于可诱导调控区以激活转录的蛋白质因子可能以非活性形式存在，其随后直接或间接通过诱导物转化成活性形式。然而，也可能不存在所述蛋白质因子。诱导物可以是例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物的化学剂，或由热、冷、盐或有毒元素直接施加或通过病原体或病原(例如病毒)的作用而间接施加的生理应激。可通过将诱导物在外部施加到细胞或植物(例如喷洒、淋洒、加热或类似方法)而将含有可诱导调控区的植物细胞暴露于诱导物。可诱导调控元件可来源于植物或非植物基因(例如gatz，c.和lenk，i.r.p.，1998，植物科学发展趋势(trendsplantsci.)3：352-358)。潜在可诱导启动子的实例包含但不限于四环素可诱导启动子(gatz，c.，1997，植物生理学和植物分子生物学年鉴(ann.rev.plantphysiol.plantmol.biol.)48，89-108)、类固醇可诱导启动子(aoyama，t.和chua，n.h.，1997，植物学报(plantj.)2，397-404)和乙醇可诱导启动子(salter，m.g.等人，1998，植物学报16，127-132；caddick，m.x.等人，1998，自然生物技术(naturebiotech.)16，177-180)、细胞分裂素可诱导ib6和cki1基因(brandstatter，i.和kieber，j.j.，1998，植物细胞(plantcell)10，1009-1019；kakimoto，t.，1996，科学(science)274，982-985)以及植物生长素可诱导元件dr5(ulmasov，t.，等人，1997，植物细胞9，1963-1971)。

组成性调控区引导基因在植物的各个部分中且在整个植物发育过程中的表达。已知组成性调控元件的实例包含与camv35s转录物相关的启动子(p35s；odell等人，1985，自然(nature)，313：810-812；其以引用的方式并入本文中)、大米肌动蛋白1(zhang等人，1991，植物细胞，3：1155-1165)、肌动蛋白2(an等人，1996，植物学报，10：107-121)或tms2(u.s.5,428,147)和磷酸丙糖异构酶1(xu等人，1994，植物生理学(plantphysiol.)106：459-467)基因、玉米泛素蛋白1基因(cornejo等人，1993，植物分子生物学(plantmol.biol.)29：637-646)、拟南芥泛素蛋白1与6基因(holtorf等人，1995，植物分子生物学)29：637-646)、烟草转译起始因子4a基因(mandel等人，1995植物分子生物学)29：995-1004)；木薯叶脉花叶病毒启动子pcas(verdaguer等人，1996)；核酮糖二磷酸羧化酶的较小亚基的启动子prbcs：(outchkourov等人，2003)、pubi(对于单子叶植物和双子叶植物)。

如本文所用的术语“组成性”不一定指示在组成性调控区的控制下的核苷酸序列在所有细胞类型中以相同水平表达，而是即使常常观察到大量变异，所述序列仍在较大范围的细胞类型中表达。

如上文所描述的表达构建体可存在于载体中。载体可包括允许将表达盒转移并整合到生物体或宿主的基因组中的边界序列。构建体可以是植物二元载体，例如基于ppzp的二元转化载体(hajdukiewicz等人1994)。其它实例构建体包含pbin19(参见frisch，d.a.，l.w.harris-haller等人1995，植物分子生物学27：405-409)。

如本文所用的术语“天然”、“天然蛋白”或“天然结构域”指代具有与野生型一致的一级氨基酸序列的蛋白质或结构域。天然蛋白质或结构域可以由与野生型序列具有100％序列相似性的核苷酸序列编码。天然氨基酸序列还可以由人类密码子(hcod)优化核苷酸序列或包括与野生型核苷酸序列相比增加的gc含量的核苷酸序列编码，前提为由hcod核苷酸序列编码的氨基酸序列展现与天然氨基酸序列的100％序列同一性。

作为“人类密码子优化”或“hcod”核苷酸序列的核苷酸序列意味着，选择用于合成寡核苷酸序列或其片段的适当dna核苷酸接近通常在人类核苷酸序列的寡核苷酸序列内发现的密码子使用。“增加的gc含量”意味着，选择用于合成寡核苷酸序列或其片段的适当dna核苷酸以便接近密码子使用在与对应天然寡核苷酸序列比较时包括在寡核苷酸序列的编码部分的长度内的约1％至约30％或其间任何值的gc含量增加。例如，在寡核苷酸序列的编码部分的长度内的约1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或其间的任何值的增加。如下文所描述，人类密码子优化核苷酸序列或包括增加的gc含量(与野生型核苷酸序列相比)的核苷酸序列展现与非人类优化(或较低gc含量)核苷酸序列相比增加的在植物、植物的部分或植物细胞中的表现。

本文描述诺如病毒vp1突变蛋白(也被称为修饰后vp1蛋白或修饰后诺如病毒vp1蛋白)以及在植物中产生诺如病毒vp1突变蛋白的方法。修饰后诺如病毒vp1蛋白中的几种包括在非gi.1vp1的s结构域中的变成gi.1s结构域中所发现的对应氨基酸的特定取代、修饰或突变。已观察到，在某些诺如病毒基因型中，特定氨基酸突变成gi.1vp1中发现的对应氨基酸，使得vp1和/或vlp的特性与野生型(非gi.1)vp1和/或vlp相比是相似的或有所改进。vp1和/或vlp的改进后特性的实例包含：

-在表达于植物细胞中时，与不包括取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vp1的产量相比，vp1蛋白产量增加；

-与包括不含取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vp1的vlp的密度相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的密度增加(例如，如使用密度梯度分离以及视情况存在的sds-page和/或蛋白质印迹分析(westernanalysis)所确定)；

-与包括不含取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vp1的vlp的完整性、稳定性或这两种特性相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的完整性、稳定性或这两种特性有所改进；

-当表达于植物细胞中时，与不包括取代、修饰或突变的同一基因型的野生vlp产量水平相比，vlp产量增加；

-与包括不含取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vp1的vlp的聚集相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的聚集有所改进；

-与不包括取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vp1相比，组装成38nmvlp相对于组装成23nmvlp的vlp比例更大；以及

-其组合。

举例来说，修饰后诺如病毒vp1蛋白以及产生修饰后诺如病毒vp1蛋白的方法可包含编码如下vp1蛋白的核苷酸序列，所述vp1蛋白包括在与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1；参见图2c)的43、57、84和94位序列比对的任何一个或多个氨基酸处的s结构域取代、突变或修饰，或与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，或其组合。编码诺如病毒vp1突变蛋白的序列可针对人类密码子使用、增加的gc含量或其组合进行优化。

参考图2c中所示的序列，将诺如病毒gi.1序列(seqidno：1)用作参考序列，其它诺如病毒vp1序列可与所述参考序列比对。vp1蛋白的“gii”家族的vp1氨基酸序列包括相对于gi.1序列的4个氨基酸的缺失，包括14至16位的3个氨基酸的缺失和26位的一个氨基酸的缺失。因此，giivp1序列与givp1序列之间的比对相差氨基酸13之后的3个氨基酸以及26位之后的4个氨基酸。举例来说，gi.1的氨基酸84与gii.4的氨基酸80对齐(参见图2c)。对于其84位(gi.1)和80位(gii.4)的取代、修饰或突变的提及指代相同比对氨基酸：

本文还提供增加包括修饰后诺如病毒vp1蛋白的vlp在植物中的产量的方法。举例来说，方法可包含将编码本文所描述的诺如病毒vp1蛋白的核酸引入到植物、植物的部分或植物细胞中。一种或一种以上诺如病毒突变蛋白可表达于植物、植物的部分或植物细胞中，以便产生包括一种或一种以上修饰后诺如病毒蛋白的vlp。或者，所述方法可包括提供编码本文所描述的修饰后诺如病毒vp1蛋白的核酸的植物、植物的部分或植物细胞，以及表达编码修饰后诺如病毒vp1蛋白的核酸以便产生包括一种或一种以上修饰后诺如病毒蛋白的vlp。

产生包括vp1突变蛋白的vlp的方法还可包括在植物、植物的部分或植物细胞中共表达编码vp2蛋白的核酸序列的步骤。

如本文所用的术语“单个构建体”或“单个的构建体”指代包括单个核酸序列的核酸载体。如本文所用的术语“双重构建体”或“双重的构建体”指代包括两个核酸序列的核酸载体。

共表达意指两个或多个核苷酸序列的引入和表达，两个或多个核苷酸序列中的每一个在植物、植物的部分或植物细胞中编码所关注蛋白质或所关注蛋白质的片段。可在一个载体内将两个或多个核苷酸序列引入到植物、植物的部分或植物细胞中，使得两个或多个核苷酸序列中的每一个都在单独调控区(例如包括双重构建体)的控制下。或者，可在单独的载体(例如包括单个构建体)内将两个或多个核苷酸序列引入到植物、植物的部分或植物细胞中，且每一载体包括用于表达对应核酸的适当调控区。举例来说，两个核苷酸序列(各处于单独的载体上并引入到单独的根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)宿主中)可通过混合所需体积(例如相等体积，或每一根癌农杆菌宿主的比率可改变)的每一根癌农杆菌宿主的悬浮液，之后进行真空浸渗来共表达。以这种方式，共浸渗多种根癌农杆菌悬浮液允许共表达多种转基因。

包括编码本文所描述的诺如病毒vp1突变蛋白的核酸可进一步包括增强诺如病毒vp1突变蛋白在植物、植物的部分或植物细胞中的表达的序列。增强表达的序列可包含与编码诺如病毒vp1突变蛋白的核酸以可操作方式缔合的cpmv增强子元件或植物来源表达增强子。还可针对人类密码子使用、增加的gc含量或其组合优化编码vp1突变蛋白的序列。此外，编码vp2的核酸可与编码vp1突变蛋白的序列一起共表达。共表达编码vp2的核酸可引起包括一种或一种以上类型的vp1突变蛋白的vlp的产量增加、密度增大、完整性增加或其组合。

如本文所用的术语“cpmv增强子元件”指代编码调控豇豆花叶病毒(cpmv)rna2多肽的5’utr的核苷酸序列，或本领域中已知的修饰后cpmv序列。举例来说，cpmv增强子元件或cpmv表达增强子包含如以下文献中所描述的核苷酸序列：wo2015/14367；wo2015/103704；wo2007/135480；wo2009/087391；sainsburyf.和lomonossoffg.p.，(2008，植物生理学148：第1212至1218页)，所述文献中的每一个以引用的方式并入本文中。cpmv增强子序列可增强其所连接的下游异源开放阅读框(orf)的表达。cpmv表达增强子可包含cpmvht、cpmvx(其中x＝160、155、150、114)(例如cpmv160)、cpmvx+(其中x＝160、155、150、114)(例如cpmv160+)、cpmv-ht+、cpmvht+[wt115]或cpmvht+[511](wo2015/143567；wo2015/103704；其以引用的方式并入本文中)。cpmv表达增强子可用于包括调控区的植物表达系统内，所述调控区与cpmv表达增强子序列和所关注核苷酸序列以可操作方式连接。术语“5’utr”或“5’非转译区”或“5’前导序列”指代未转译的mrna的区。5’utr通常开始于转录起始位点并恰好在转译起始位点或编码区的起始密码子之前结束。5’utr可调节mrna转录物的稳定性和/或转译。

如本文所用的术语“植物来源表达增强子”指代从植物获得的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码5’utr。植物来源表达增强子的实例描述于第62/643,053号美国临时专利申请(2018年3月14日提交；其以引用的方式并入本文中)或diamosa.g.等人(2016，植物科学前沿(frontpltsci.)7：1-15；其以引用的方式并入本文中)中。植物来源表达增强子可选自nbmt78、nbatl75、nbdj46、nbchp79、nben42、athsp69、atgrp62、atpk65、atrp46、nb30s72、nbgt61、nbpv55、nbppi43、nbpm64(seqidno：14)和nbh2a86(如us62/643,053中所描述)。植物来源表达增强子可用于包括调控区的植物表达系统内，所述调控区与植物来源表达增强子序列和所关注核苷酸序列以可操作方式连接。

术语“5’utr”或“5’非转译区”或“5’前导序列”指代未转译的mrna的区。5’utr通常开始于转录起始位点并恰好在转译起始位点或编码区的起始密码子之前结束。5’utr可调节mrna转录物的稳定性和/或转译。

“以可操作方式连接”意味着特定序列直接或间接地相互作用以实现预期功能，例如核酸序列的表达的介导或调节。例如，以可操作方式连接的序列的相互作用可通过与以可操作方式连接的序列相互作用的蛋白质介导。

当一种或一种以上类型的修饰后诺如病毒vp1蛋白表达于植物、植物的部分或植物细胞中时，所述一种或一种以上修饰后vp1蛋白自动组装成vlp。可在合适的浸提和纯化条件下收获植物或植物的部分，以维持vlp的完整性，并且可纯化包括一种或一种以上类型的vp1突变(修饰后)蛋白的vlp。一种或一种以上vp1突变蛋白还可与编码vp2的核苷酸序列共表达，使得vlp可包括修饰后vp1蛋白和vp2蛋白。本公开还提供本文所描述的一种或一种以上类型的vp1突变蛋白在植物、植物的部分或植物细胞中的产生，以及一种或一种以上类型的vp1突变蛋白从植物、植物的部分或植物细胞的浸提和纯化，以产生包括修饰后(突变)vp1蛋白的植物物质、植物浸提物或蛋白质浸提物。

还提供包括本文所描述的诺如病毒vp1突变蛋白的植物物质、植物浸提物或蛋白质浸提物。植物物质、植物浸提物或蛋白质浸提物可用于诱导受试者对诺如病毒感染的免疫。或者，可纯化或部分纯化vp1突变蛋白或包括vp1突变蛋白(和视情况存在的vp2)的vlp，并且纯化或部分纯化后的配制品可用于诱导受试者对诺如病毒感染的免疫。

本公开还提供一种组合物，其包括有效剂量的用于诱导免疫应答的一种或一种以上类型的修饰后诺如病毒vp1蛋白，或包括一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白和视情况存在的vp2的vlp，以及药学上可接受的载剂、佐剂、媒剂或赋形剂。

本文还提供诱导受试者对诺如病毒感染的免疫的方法，其包括向受试者经口、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经直肠或阴道内施用一种或一种以上类型的突变(修饰后)诺如病毒vp1蛋白或包括一种或一种以上类型的诺如病毒vp1突变蛋白的vlp。

如本文所用的术语“诺如病毒”指代以具有单链正义rna为特征的杯状病毒科的诺如病毒属的无包膜病毒株。诺如病毒基因组的长度为7,654个核苷酸。orf1编码由病毒3c样蛋白酶裂解成6种蛋白质(包含rna依赖性rna聚合酶)的非结构性多聚蛋白。orf2和orf3分别编码主要(vp1)和次要(vp2)衣壳蛋白(参见图1a)。

本文所公开的诺如病毒株包含任何已知诺如病毒株，但也包含已知随时间推移定期发生的对已知诺如病毒株的修饰。举例来说，诺如病毒株可包含(如由其氨基酸序列所描述)但不限于hu/gi.1/unitedstates/norwalk/1968(gi.1；seqidno：1；图12a)、hu/gi.2/leuven/2003/bel(gi.2；seqidno：4；图13a)、hu/gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(gi.3；seqidno：6；图14a)、hu/gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(gi.5；seqidno：12；图15a)、hu/gi.7/usa/2014/ga5043(gi.7；seqidno：101；图16a)、hu/gii.1/ascension208/2010/usa(gii.1；seqidno：13；图16b)、hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(gii.2；seqidno：14；图17a)、hu/gii.3/jingzhou/2013402/chn(gii.3；seqidno：15；图18a)、hu/gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(gii.4；seqidno：16；图19a)、us96/gii.4/dresden174/1997/de_ay741811(seqidno：27；图19c)、fh02/gii.4/farmingtonhills/2002/us_ay502023(seqidno：28；图19d)、hnt04：gii.4/hunter-nsw504d/2004/au_dq078814(seqidno：29；图19e)、2006b：gii.4/shellharbour-nsw696t/2006/au_ef684915(seqidno：30；图19f)、no09：gii.4/orange-nsw001p/2008/au_gq845367(seqidno：31；图19g)、hu/gii.5/albertaei390/2013/ca(gii.5；seqidno：17；图20)、hu/gii.6/ohio/490/2012/usa(gii.6；seqidno：20；图21a)、gii.7/musa/2010/all73774(gii.7；seqidno：18；图22)、hu/gii.12/hs206/2010/usa(gii.12；seqidno：19；图23a)、gii.13/va173/2010/h9awu4(gii.13；seqidno：22；图24a)、gii.14_saga_2008_jpn_ade28701天然vp1(gii.14；seqidno：32；图25)、hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(gii.17；seqidno：24；图26a)以及hu/gii.21/salisbury150/2011/usa(gii.21；seqidno：26；图27)。已知诺如病毒株容易一直突变。因此，诺如病毒株还包含与上文以及图2a和2b中所列的毒株中的任何以上诺如病毒株的vp1蛋白、vp2蛋白或vp1和vp2蛋白具有约30％至100％或其间任何量的氨基酸序列同一性的毒株，前提是vp1蛋白可表达(即产生)于植物中，且当向受试者施用vp1蛋白时，vp1蛋白诱导受试者对诺如病毒的免疫。举例来说，诺如病毒株还包含与上文以及在图2a和2b中所列的毒株的任何以上诺如病毒株的vp1蛋白、vp2蛋白或vp1和vp2蛋白具有30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％或其间任何量的氨基酸序列同一性(序列相似性；同一性百分比；相似性百分比)的毒株，前提是vp1蛋白可表达于植物中，且当向受试者施用vp1蛋白时，所述vp1蛋白诱导受试者对诺如病毒的免疫。图2c中示出几个诺如病毒株(其不应被认为是限制性的)的vp1蛋白的s结构域之间的氨基酸序列同一性比较。

当提及特定序列时，使用术语“相似性百分比”、“序列相似性”、“同一性百分比”或“序列同一性”，如universityofwisconsingcg软件程序中所述，或通过人工比对和目视检查(参见，例如，分子生物学实验室指南，ausubel等人编1995年增补)。序列比对方法在本领域众所周知。可以进行最优序列比对以进行比较，例如使用smith&waterman算法(1981，应用数学进展(adv.appl.math.)2：482)，通过needleman&wunsch比对算法(1970，分子生物学杂志48：443)，通过pearson&lipman相似性搜索法(1988，美国科学院院报85：2444)，通过这些算法的计算机化实施(例如：遗传学电脑集团(gcg)wisconsingenetics软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，575madison，wis科学博士)进行。

用于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例为blast和blast2.0算法，这些算法分别描述于altschul等人(1977，核酸研究(nuc.acidsres.)25：3389-3402)和altschul等人(1990，分子生物学杂志215：403-410)中。以本文中所描述的参数使用blast和blast2.0，以确定本发明的核酸和蛋白质的序列同一性百分比。举例来说，blastn程序(针对核苷酸序列)可默认使用字长(w)11、预期(e)10、m＝5、n＝-4以及两个链的比较。针对氨基酸序列，blastp程序可默认使用字长3、预期(e)10和blosum62评分矩阵(参见henikoff&henikoff，1989，美国科学院院报89：10915)比对(b)50、预期(e)10、m＝5、n＝-4以及两个链的比较。通过国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)可公开获取用于执行blast分析的软件(参见url：ncbi.nlm.nih.gov/)。

如本文所用的术语“vp1”指代如下诺如病毒主要衣壳蛋白或多肽，其包括类似于由本文所描述的一个或多个诺如病毒株的orf2编码的蛋白或多肽的氨基酸序列。主要衣壳蛋白折叠成两个主要结构域：壳体(s)结构域和突起(p)结构域(参见图1b)。vp1蛋白在并入到病毒样颗粒或vlp中时形成二聚体(图1c)。vp1n端的第一部分包括s结构域，其中vp1多肽的剩余部分包括p结构域。举例来说，在gi.1中，n端vp1蛋白的前225个氨基酸包括s结构域。在折叠时，vp1采用图1b中所描绘的构型，包括球形s结构域(带状结构的底部)和p结构域(带状结构的顶部)。

如图1c所示，vp1蛋白通过p结构域相互作用而二聚化。这些相互作用使诺如病毒衣壳分子的自发组装稳定。

本文中描述在植物、植物的部分或植物细胞中产生诺如病毒vp1蛋白和修饰后诺如病毒vp1蛋白的方法，其包含引入编码诺如病毒vp1蛋白或修饰后vp1蛋白的重组多核苷酸，以及在允许表达诺如病毒vp1蛋白或修饰后诺如病毒蛋白的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞。然而，还应理解，诺如病毒vp1蛋白可以从包括vp1蛋白的诺如病毒vlp获得，如ausar等人(ausars.f.、foubertt.r、hudsonm.h.、vedvickt.s.、middaughc.r.，2006，生物化学杂志(j.biol.chem.)281：19478-19488)。举例来说，包括诺如病毒蛋白或修饰后诺如病毒蛋白的诺如病毒vlp可在ph8或8以上或高于55℃的温度下解离成其vp1蛋白成分，从而产生vp1蛋白。

如本文所用的术语“病毒样颗粒”或“vlp”指代如下诺如病毒病毒样颗粒，其包括一种或一种以上类型的诺如病毒vp1蛋白、一种或一种以上类型的vp1突变蛋白或其组合，且自组装成不含诺如病毒基因组的任何部分的非复制、无包膜、非感染性病毒衣壳结构。举例来说，vlp可包括一种类型的本文所描述的修饰后vp1蛋白，或vlp可包括两种或多种本文所描述的不同修饰后vp1蛋白。此外，vlp可包括vp2蛋白。包括vp1蛋白、vp1+vp2蛋白、修饰后vp1蛋白或修饰后vp1蛋白+vp2蛋白的vlp具有约15nm至50nm或其间任何量的大小，例如15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm或其间的任何量。举例来说，对于t＝1二十面体对称而言，vlp可为约23nm，或对于t＝3二十面体对称而言，vlp可为约38nm至约40nm。

如图3b、4b、5c、5e、6c、6e、7c、8b、9b、9c、9d、9g、10b、11c和11d的电子显微图所示，来源于几个诺如病毒株的植物产生的vp1蛋白和修饰后vp1蛋白自组装成vlp。

植物中的诺如病毒vp1蛋白产生

vp1蛋白包含包括与来自以下诺如病毒的vp1氨基酸序列具有约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％、约98％至约100％或其间任何量的序列同一性(其也可被称为序列相似性)的氨基酸序列的任何vp1蛋白：gi.1(seqidno：1；图12a)、gi.2(seqidno：4；图13a)、gi.3(seqidno：6；图14a)、gi.5(seqidno：12；图15a)、hu/gi.7/usa/2014/ga5043(gi.7；seqidno：101；图16a)、gii.1(seqidno：13；图16b)、gii.2(seqidno：14；图17a)、gii.3(seqidno：15；图18a)、gii.4/sydney(seqidno：16；图19a)、gii.4/dresden(seqidno：27；图19c)、gii.4/farmingtonhills(seqidno：28；图19d)、gii.4/hunter(seqidno：29；图19e)、gii.4/shellharbour(seqidno：30；图19f)、gii.4/orange(seqidno：31；图19g)、gii.5(seqidno：17；图20)、gii.6(seqidno：20；图21a)、gii.7(seqidno：18；图22)、gii.12(seqidno：19；图23a)、gii.13(seqidno：22；图24a)、gii.14/saga(seqidno：32；图25)、gii.17(seqidno：24；图26a)、gii.21(seqidno：26；图27)，前提是vp1蛋白表达于植物中，且其在向受试者施用时诱导对诺如病毒的免疫。

本文所描述的vp1蛋白可被修饰且包括在与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1；参见图2c)的43、57、84和94位序列比对的任何一个或多个氨基酸处的s结构域取代、修饰或突变，或与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，或其组合。可针对人类密码子使用、针对增加的gc含量或其组合优化编码修饰后诺如病毒vp1蛋白的核苷酸序列。修饰后vp1蛋白可表达于植物、植物的部分或植物细胞中。

如图2c中所示，相对于高变p结构域，诺如病毒vp1s结构域的一级氨基酸序列十分保守。举例来说，图2c中所示的诺如病毒株的vp1s结构域序列具有与gi.1vp1的s结构域的同一性在55.2％至98.9％范围内的序列。举例来说，本文所描述的核酸序列可展现与gi.1vp1的s结构域的约55％至约99％或其间任何量的序列同一性。举例来说，本文所描述的核酸序列可展现与gi.1vp1的s结构域的约55％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其间任何量的序列同一性。

如先前在美国临时申请62/475,660(2017年3月23日提交；其以引用的方式并入本文中)和pct/ca2018/050352(2018年3月23日提交；其以引用的方式并入本文中)中所示，野生型(也被称为天然)诺如病毒vp1蛋白可在植物中产生且产生包括vp1蛋白的vlp。用包括编码作为单个核酸构建体的gi.1vp1、作为单个核酸构建体的gi.1vp2、vp1和vp2核酸序列引入到单独的载体(“vp1+vp2”；双重构建体)中或同一载体(“vp1/vp2”或“vp1/vp2/3’utr”；单个的核酸构建体)上的gi.1vp1和vp2的表达载体的根癌农杆菌真空浸渗叶片(来自本氏烟)允许共表达vp1和/或vp2序列，且检查叶片的vp1和vp2产量。在浸渗后6或9天之后(分别为6dpi和9dpi)，用叶片匀浆制备总粗蛋白浸提物，通过sds-page进行分离，并用考马斯亮蓝染料染色。用包括对应于编码vp1蛋白的野生型gi.1orf2的核苷酸序列的表达载体浸渗叶片，产生较低或不可检测的含量的gi.1vp1，如使用考马斯染色凝胶所确定。相比之下，用包括针对人类表达进行密码子优化(hcod)或相比野生型vp1核酸序列的gc含量增浓gc含量的gi.1vp1核苷酸序列的表达载体浸渗叶片，产生在考马斯染色凝胶中量增加的gi.1vp1蛋白。表明当vp1自身进行表达时，可在植物中产生hcodgi.1vp1。

此外，如在美国临时申请62/475,660和pct/ca2018/050352(分别在2017年3月23日和2018年3月23日提交；都以引用的方式并入本文中)中所描述，用包括野生型gi.1vp1和vp2或人类密码子优化gi.1vp1和vp2的载体浸渗叶片，产生考马斯染色凝胶中较低含量的gi.1vp1蛋白，表明当使用与病毒基因组中所发现的相同组织来顺式共表达于同一载体上(使用一个启动子来控制表达)时，vp1的表达没有因vp2的存在而增强。然而，当vp1或人类密码子优化vp1分别与vp2或hcodvp2(hcodvp1+vp2)反式(在单独构建体上)共表达时，观察到vp1蛋白的增加。vp1和vp2核酸区段中的每一个包括调控区和终止子，并且将构建体作为核酸复合体引入到植物中，这引起vp1蛋白产量的对应增加。

这个观察结果与在昆虫和哺乳动物细胞中观察到的结果相反(bertolotti-ciarleta.、crawfords.e.、hutsona.m.、estesm.k.2003，病毒学杂志(j.virol.)77：11603-11615)，其报告仅在vp1和vp2(或vp1+vp2+3’utr)顺式地驻留并在一个启动子和终止子的控制下使用与病毒基因组中发现的相同组织共表达时，观察到vp1表达的增加。当反式共表达vp1和vp2时，bertolotti-ciarlet(2003)在昆虫或哺乳动物细胞中未观察到vp1表达的增加。

如下文更详细描述，当本文所描述的修饰后vp1蛋白表达于植物中时，优选从与用于获得修饰后vp1序列的基因型和毒株相同的诺如病毒基因型和毒株获得编码vp2的orf3序列。在本文提供的实例中，除非另有说明，否则修饰后vp1蛋白和vp2蛋白是从相同诺如病毒基因型和毒株获得的，且编码修饰后vp1蛋白和vp2蛋白的核苷酸序列使用单独的表达系统(例如在单独的质粒上)共表达于植物中，或vp1和vp2可表达于同一载体上，但编码vp1和vp2的每一个序列应受单独的启动子和终止子序列的控制，使得其具有单独的表达系统。

取决于所表达的诺如病毒vp1的基因型，植物中的所浸提的诺如病毒vp1蛋白的产量或量以及包括诺如病毒vp1蛋白的vlp的产量不同。举例来说，如图3a中所示，野生型gi.1vp1、gi.5vp1和gii.12vp1的表达稳固，且蛋白质产量良好(使用sdspage确定)。此外，还产生了具有直径大部分为38nm的结构良好的衣壳的高密度野生型gi.1vlp(图3b)，并且由表达野生型gi.5vlp、gii.12vlp(图3c)和gi.2vlp(图4a)的植物产生了高密度vlp。相比之下，野生型gii.4vp1在植物中的表达较少(图3a右图)，并且在将其它野生型vp1蛋白(例如gii.2vp1、gii.3vp1和gii.6vp1)表达于植物中之后，观察到较低产量的vp1蛋白或不可检测量的vp1蛋白(使用sds-page)(表5，实例3)。

此外，天然vp1蛋白在植物中的表达可使得vlp以包括较大比例的23nmvlp而不是38nmvlp为特征。举例来说，野生型gi.3vp1的表达使得产生大量23nmvlp(参见图5c，左图)。更大比例的23nmvlp还使得vlp以在密度梯度离心之后较不稠密为特征(参见图5b，左图)。

本公开提供编码修饰后诺如病毒vp1蛋白的核酸序列，其中修饰后诺如病毒vp1包括在选自由与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的氨基酸组成的组的氨基酸处的一个或一个以上取代、修饰或突变，或与诺如病毒基因型vp1gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，或其组合。表达编码修饰后诺如病毒vp1蛋白的核酸序列且包括在选自由与诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43、57、84和94序列比对的氨基酸组成的组的氨基酸处的一个或一个以上取代、修饰或突变，或者与诺如病毒基因组vp1gi.1的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，或其组合的植物展现与不包括所述一个或一个以上取代、修饰或突变的野生型vp1和/或vlp相比相似或改进的vp1和/或vlp特性。

修饰后vp1和/或vlp改进特性的实例包含：

-当表达于植物细胞中时，与不包括所述一个或一个以上取代、修饰或突变的野生型vp1相比，修饰后vp1蛋白产量增加(例如使用考马斯染色sds-page和蛋白质印迹法分析确定)。举例来说，与对应野生型vp1产量相比，修饰后vp1蛋白的产量增加可在1.5倍至50倍的范围内，或其间的任何量；

-与不包括所述一个或一个以上取代、修饰或突变的野生型vp1的密度梯度分离相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的密度增加，例如使用蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度分离所确定。举例来说，在密度梯度离心之后，在同样稠密或更稠密的级分中观察到包括修饰后vp1蛋白的vlp；

-与不包括所述一个或一个以上取代、修饰或突变的野生型vp1相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的整体性有所改进。举例来说，可使用tem确定分裂的或部分组装的vlp的数量；

-当表达于植物细胞中时，与不包括取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vlp产量相比，vlp产量增加。可使用tem，在从含有密度梯度离心之后的级分的vlp获得的清洗后样本中确定vlp产量。举例来说，与包括野生型vp1蛋白的vlp的对应产量相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的产量增加可在1.5至20倍的范围内，或其间的任何量；

-与包括不包括取代、修饰或突变的同一基因型的野生型vp1的vlp的聚集相比，包括修饰后vp1蛋白的vlp的聚集有所改进；

-与包括不包括所述一个或一个以上取代、修改或突变的野生型vp1的vlp相比，组装成38nmvlp相对于组装成23nmvlp的vlp的比例更大(使用tem确定)；以及

-这些改进特性的组合。

在不希望受理论束缚的情况下，与野生型诺如病毒vlp相比，在密度梯度离心后以较高密度分数观察到的vlp指示，在表达于植物中和从植物浸提时，包括天然vp1的vlp的组装可能不如包括修饰后vp1蛋白的vlp稳定。天然vlp因此可能更容易受畸形衣壳颗粒影响并容易产生片段化产物。因此，以具有增大的密度为特征的包括修饰后vp1蛋白的vlp还可展现比使用对应野生型vp1产生的vlp更好的结构完整性。

本文所描述的核酸序列可展现与上文鉴别且在图2a至2c中列出的编码vp1(排除gi)的任何核酸序列的约50％至约99％序列相似性。举例来说，本文所描述的核酸序列可展现与编码例如来自以下的诺如病毒vp1的任何核酸序列的约50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其间的任何量的序列同一性：hu/gi.2/leuven/2003/bel(gi.2；seqidno：4；图12a)、hu/gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(gi.3；seqidno：6；图14a)、hu/gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(gi.5；seqidno：12；图15a)、hu/gi.7/usa/2014/ga5043(gi.7；seqidno：101；图16a)、hu/gii.1/ascension208/2010/usa(gii.1；seqidno：13；图16b)、hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14；图17a)、hu/gii.3/jingzhou/2013402/chn(gii.3；seqidno：15；图18a)、hu/gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(gii.4；seqidno：16；图19a)、us96/gii.4/dresden174/1997/de_ay741811(seqidno：27；图19c)、fh02/gii.4/farmingtonhills/2002/us_ay502023(seqidno：28；图19d)、hnt04：gii.4/hunter-nsw504d/2004/au_dq078814(seqidno：29；图19e)、2006b：gii.4/shellharbour-nsw696t/2006/au_ef684915(seqidno：30；图19f)、no09：gii.4/orange-nsw001p/2008/au_gq845367(seqidno：31；图19g)、hu/gii.5/albertaei390/2013/ca(gii.5；seqidno：17；图20)、hu/gii.6/ohio/490/2012/usa(gii.6；seqidno：20；图21a)、g11.7/musa/2010/all73774(gii7；seqidno：18；图22)、hu/gii.12/hs206/2010/usa(gii.12；seqidno：19；图23a)、gii.13/va173/2010/h9awu4(seqidno：22；图24a)、gii.14_saga_2008_jpn_ade28701天然vp1(seqidno：32；图25)、hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(gii.17；seqidno：24；图26a)、hu/gii.21/salisbury150/2011/usa(gii.21；seqidno：26；图27)，前提是当向受试者施用vp1蛋白时，所述vp1蛋白诱导受试者对诺如病毒的免疫。

类似地，本发明包含展现与以下vp1序列中的任一个约30％至约99％或其间的任何量的序列相似性的氨基酸序列：例如hu/gi.2/leuven/2003/bel(gi.2；seqidno：4；图12a)、hu/gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(gi.3；seqidno：6；图14a)、hu/gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(gi.5；seqidno：12；图15a)、hu/gi.7/usa/2014/ga5043(gi.7；seqidno：101；图16a)、hu/gii.1/ascension208/2010/usa(gii.1；seqidno：13；图16b)、hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14；图17a)、hu/gii.3/jingzhou/2013402/chn(gii.3；seqidno：15；图18a)、hu/gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(gii.4；seqidno：16；图19a)、us96/gii.4/dresden174/1997/de_ay741811(seqidno：27；图19c)、fh02/gii.4/farmingtonhills/2002/us_ay502023(seqidno：28；图19d)、hnt04：gii.4/hunter-nsw504d/2004/au_dq078814(seqidno：29；图19e)、2006b：gii.4/shellharbour-nsw696t/2006/au_ef684915(seqidno：30；图19f)、no09：gii.4/orange-nsw001p/2008/au_gq845367(seqidno：31；图19g)、hu/gii.5/albertaei390/2013/ca(gii.5；seqidno：17；图20)、hu/gii.6/ohio/490/2012/usa(gii.6；seqidno：20；图21a)、g11.7/musa/2010/all73774(gii7；seqidno：18；图22)、hu/gii.12/hs206/2010/usa(gii.12；seqidno：19；图23a)、gii.13/va173/2010/h9awu4(seqidno：22；图24a)、gii.14_saga_2008_jpn_ade28701天然vp1(seqidno：32；图25)、hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(gii.17；seqidno：24；图26a)、hu/gii.21/salisbury150/2011/usa(gii.21；seqidno：26；图27)，前提是当向受试者施用时，vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。举例来说，本文所描述的氨基酸序列可与上文定义的vp1氨基酸序列中的任一个具有约30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其间的任何量的序列相似性，前提是当向受试者施用时，vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。

“vp1突变蛋白”、“突变vp1蛋白”、“修饰后vp1蛋白”、“修饰后诺如病毒vp1蛋白”等意指如下诺如病毒vp1蛋白：其包括在与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1；参见下表1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的位置或氨基酸处的一个或一个以上取代、突变或修饰，或与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，或其组合。术语“残基”、“残基氨基酸”和“氨基酸”可互换使用，且通常指代氨基酸序列内的指定位置(位点)处的氨基酸。

表1：诺如病毒基因型(毒株)以及gi和gii毒株的等效氨基酸位置的列表。

如本文所用，术语“保守取代”或“保守性取代”指代gii.4vp1蛋白的序列中存在不同于所描述取代的氨基酸但与所述氨基酸为同一种类的氨基酸残基。举例来说，非极性氨基酸可用于替换非极性氨基酸，芳香族氨基酸用于替换芳香族氨基酸，极性非带电氨基酸用于替换极性非带电氨基酸，和/或带电氨基酸用于替换带电氨基酸。另外，保守性取代可涵盖与替换对应野生型氨基酸的氨基酸具有符号相同且量级通常类似的界面亲水性值的氨基酸。

如本文所用，术语“非极性氨基酸”指代甘氨酸(g，gly)、丙氨酸(a，ala)、缬氨酸(v，val)、亮氨酸(l，leu)、异亮氨酸(i，ile)和脯氨酸(p，pro)；术语“芳香族残基”(或芳香族氨基酸)指代苯丙氨酸(f，phe)、酪氨酸(y，tyr)和色氨酸(w，trp)；术语“极性非带电氨基酸”指代丝氨酸(s，ser)、苏氨酸(t，thr)、半胱氨酸(c，cys)、蛋氨酸(m，met)、天冬酰胺(n，asn)和谷氨酰胺(q，gln)；术语“带电氨基酸”指代带负电氨基酸天冬氨酸(d，asp)和谷氨酸(e，glu)以及带正电氨基酸赖氨酸(k，lys)、精氨酸(r，arg)和组氨酸(h，his)。其它类别的氨基酸可为以下氨基酸：具有疏水侧链的氨基酸(脂肪族)：丙氨酸(a，ala)、异亮氨酸(i，ile)、亮氨酸(l，leu)、蛋氨酸(m，met)和缬氨酸(v，val；具有疏水性侧链的氨基酸(芳香族)：苯丙氨酸(f，phe)、色氨酸(w，trp)、酪氨酸(y，tyr)；具有极性中性侧链的氨基酸：天冬酰胺(n，asn)、半胱氨酸(c，cys)、谷氨酰胺(q，gln)、丝氨酸(s，ser)和苏氨酸(t，thr)；具有带电侧链的氨基酸(酸性)：天冬氨酸(d，asp)、谷氨酸(e，glu)；具有带电侧链的氨基酸(碱性)：精氨酸(r，arg)；组氨酸(h，his；赖氨酸(k，lys)、甘氨酸(g，gly)和脯氨酸(p，pro)。

保守性氨基酸取代对所得修饰后gii.4vp1蛋白的活性的作用很可能与初始取代或修饰相似。关于保守性取代的其它信息可见于例如benbassat等人(细菌学杂志(j.bacteriol)，169：751-757，1987)、o’regan等人(基因，77：237-251，1989)、sahin-toth等人(蛋白质scl，3：240-247，1994)、hochuli等人(生物技术(bio/technology)，6：1321-1325，1988)。

blosum矩阵常用于确定多肽序列的相关性(henikoff等人，美国科学院院报89：10915-10919，1992)。阈值90％同一性用于blosum90矩阵的高度保守目标频率。阈值65％同一性用于blosum65矩阵。blosum矩阵中为零和零以上的评分被视为以所选同一性百分比“保守性取代”。下表展示保守性氨基酸取代的实例：表2。

表2：示范性保守性氨基酸取代。

对于本文所描述的修饰，可使用表2中所概述的极高度保守取代、高度保守取代或保守取代以及上文所描述的芳香族、极性、极性非带电、极性中性或非极性带负电、带正电、疏水性氨基酸来对氨基酸进行取代。

如本文所描述，包括氨基酸43、57、84和94(在gi毒株中，等效于gii毒株中的氨基酸39、53、80和90)处的一个或一个以上氨基酸取代的修饰后vp1蛋白使得修饰后vp1蛋白或使用修饰后vp1蛋白产生的vlp的特性有所改进。应理解，改进的特性不限于在指定位点取代特定氨基酸，如本领域的技术人员应理解，具有类似特性的氨基酸可取代为已鉴别位置处的氨基酸。举例来说，修饰q84s包括用以具有极性中性侧链为特征的氨基酸-丝氨酸取代84位的谷氨酰胺。所述位置的谷氨酰胺还可用以极性中性侧链为特征的替代氨基酸(例如天冬酰胺、半胱氨酸或苏氨酸)取代，即q84x，其中x＝s、n、c或t。类似地，除用丝氨酸取代天然氨基酸以外，关于包括用丝氨酸取代80位的谷氨酸e80s，或p80s(丝氨酸取代脯氨酸)，所述位置处的氨基酸还可用具有极性中性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、半胱氨酸或苏氨酸)取代，即p80x，其中x＝s、n、c或t。此外，如本文所描述，另外的p80x变型可用于产生vp1，其中x选自s、a、n、k或h。在包括用亮氨酸(以具有疏水性侧链为特征的氨基酸)取代丝氨酸或丙氨酸的修饰s94l、s90l、a94l或a90l中，天然氨基酸可使用以具有疏水性侧链为特征的氨基酸(例如异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸，或在s94x或s90x的情况下，丙氨酸)取代，即s94x(s90x)，其中x＝l、i、m、v或a，或a94x(a90x)，其中x＝l、i、m或v。此外，如本文所描述，另外的s94x变型也可用于产生vp1，其中x选自v、i、m、t、e、d、n、q、k或h。修饰a39v包括在39位用缬氨酸(以具有疏水性侧链为特征的氨基酸)取代丙氨酸；除缬氨酸以外，天然氨基酸还可用以具有疏水性侧链为特征的氨基酸(例如异亮氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代，即a39x，其中x＝v、i、l或m。此外，如本文所描述，另外的a39x变型也可用于产生vp1，其中x选自i、m、g、s、e、d、n、q、k或h。包括用脯氨酸取代缬氨酸的修饰v47p还可包括用甘氨酸取代缬氨酸，即v47x，其中x＝p或g。修饰r53i包括在53位用异亮氨酸(以具有疏水性侧链为特征的氨基酸)取代精氨酸，除异亮氨酸以外，精氨酸还可用以疏水性侧链为特征的氨基酸(例如亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或蛋氨酸)取代，即r53x，其中x＝i、l、v、a或m。修饰m57i包括在57位用异亮氨酸(以具有疏水性侧链为特征的氨基酸)取代蛋氨酸，除异亮氨酸以外，蛋氨酸还可用以具有疏水性侧链为特征的氨基酸(例如亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸)取代，即m57x，其中x＝i、l、v或a。此外，如本文所描述，另外的57x变型可用于产生vp1，其中x选自l、g、s、t、n、q、k或h。

vp1突变蛋白(修饰后vp1蛋白)的实例包含但不限于以下：

-gi.3_q84svp1(gi.3_q84x，其后x＝s、n、c或tvp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的谷氨酰胺已突变成例如丝氨酸(gi.3_q84s；seqidno：98，图28a)；或展现与gi.3_q84svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.3vp1蛋白可与gi.3_q84svp1蛋白(seqidno：98，图28a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t，例如丝氨酸，且前提是当向受试者施用时，gi.3q84xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.3vp1的序列可从任何gi.3毒株获得，例如但不限于gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(seqidno：6氨基酸；seqidno：7，核苷酸；图14a、14b)。

-gi.3_s94xvp1，其中x＝l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h，其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丝氨酸已突变成例如亮氨酸(gi.3_s94l；seqidno：8，图28c)、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸(gi.3_s94x，其中x＝v、i、m、t、e、d、n、q、k或h；seqidno：292，图28m)；或展现与gi.3_s94xvp1蛋白的氨基酸序列的约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列，其中x＝l、v、i、m、t、e、d、n、q、k或h。举例来说，gi.3vp1蛋白可与gi.3_s94xvp1蛋白(其中x＝l、v、i、m、t、e、d、n、q、k或h)的vp1蛋白(seqidno：8，图28c，seqidno：292；图28m)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、v、i、m、t、e、d、n、q、k或h，例如亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸，且前提是当向受试者施用时，gi.3s94xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.3vp1的序列可从任何gi.3毒株获得，例如但不限于gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(seqidno：6氨基酸；seqidno：7，核苷酸；图14a、14b)。

-gi.3_a43x+s94xvp1，其中x＝v、l、i或m，且x＝l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43和94的丙氨酸和丝氨酸已分别被取代或突变成例如但不限于缬氨酸和亮氨酸(gi.3_a43v+s94l；seqidno：170，图28g)；或展现与gi.3_a43v+s94lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.3vp1蛋白可与gi.3_a43v+s94lvp1蛋白(seqidno：170，图28g)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43和94的位置处的取代、修饰或突变保持分别为v、l、i或m(例如缬氨酸)以及l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gi.3_a43x+s94xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.3vp1的序列可从任何gi.3毒株获得，例如但不限于gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(seqidno：6氨基酸；seqidno：7，核苷酸；图14a、14b)。

-gi.3_m57x+s94xvp1，其中x＝i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h，且x＝l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57和94的蛋氨酸和丝氨酸已分别突变成例如异亮氨酸和亮氨酸(gi.3_m57i+s94l；seqidno：172，图28i)；或展现与gi.3_m57i+s94lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.3vp1蛋白可与gi.3_m57i+s94lvp1蛋白(seqidno：172，图28i)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57和94的位置处的取代、修饰或突变保持分别为i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h(例如异亮氨酸)以及l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gi.3_m57x+s94xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.3vp1的序列可从任何gi.3毒株获得，例如但不限于gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(seqidno：6氨基酸；seqidno：7，核苷酸；图14a、14b)。

-gi.3_q84x+s94x，vp1，其中x＝s、n、c或t，且x＝l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酰胺和丝氨酸已分别突变成例如丝氨酸和亮氨酸(gi.3_q84s+s94l；seqidno：10，图28e)；或展现与gi.3_q84s+s94lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.3vp1蛋白可与gi.3_q84s+s94lvp1蛋白(seqidno：10，图28e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变保持分别为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gi.3_q84x+s94xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.3vp1的序列可从任何gi.3毒株获得，例如但不限于gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(seqidno：6氨基酸；seqidno：7，核苷酸；图14a、14b)。

-gi.3_a43x+m57z+s94xvp1，其中x＝v、l、i或m，z＝i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h，且x＝l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57和94的丙氨酸、蛋氨酸和丝氨酸已分别突变成例如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(gi.3_a43v+m57i+s94l；seqidno：174，图28k)；或展现与gi.3_a43v+m57i+s94lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.3vp1蛋白可与gi.3_a43v+m57i+s94lvp1蛋白(seqidno：174，图28k)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43、57和94的位置处的取代、修饰或突变保持分别为v、l、i或m(例如缬氨酸)、i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h(例如异亮氨酸)以及l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gi.3_a43x+m57z+s94xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.3vp1的序列可从任何gi.3毒株获得，例如但不限于gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(seqidno：6氨基酸；seqidno：7，核苷酸；图14a、14b)。

-gi.5_q84svp1(gi.5_q84x，其中x＝s、n、c或t，vp1)，其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的谷氨酰胺已突变成例如丝氨酸(gi.5_q84s；seqidno：34，图29a)；或展现与gi.5_q84svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.5vp1蛋白可与gi.5_q84svp1蛋白(seqidno：34，图29a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t，例如丝氨酸，且前提是当向受试者施用时，vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.5vp1的序列可从任何gi.5毒株获得，例如但不限于gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(seqidno：12，氨基酸；图15a)。

-gi.5_a94lvp1(gi.5_a94x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丙氨酸已突变成例如亮氨酸(gi.5_a94l；seqidno：36，图29c)；或展现与gi.5_a94lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.5vp1蛋白可与gi.5_a94lvp1蛋白(seqidno：36，图29c)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m或v，例如亮氨酸，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.5vp1的序列可从任何gi.5毒株获得，例如但不限于gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(seqidno：12，氨基酸；图15a)。

-gi.5_q84s+a94lvp1(gi.5_q84x，其中x＝s、n、c或t+a94x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酰胺和丙氨酸已分别突变成例如丝氨酸和亮氨酸(gi.5_q84s+a94l；seqidno：38，图29e)；或展现与gi.5_q84s+a94lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.5vp1蛋白可与gi.5_q84s+a94lvp1蛋白(seqidno：38；图29e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变保持分别为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.5vp1的序列可从任何gi.5毒株获得，例如但不限于gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(seqidno：12，氨基酸；图15a)。

-gi.7_m57xvp1，其中x＝i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h，其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57的蛋氨酸已突变成例如异亮氨酸(gi.7_m57i；seqidno：179，图29i)、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸(gi.7_m57xvp1，其中x＝i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h；seqidno：290；图29m)；或展现与gi.7_m57xvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列，其中x＝i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h。举例来说，gi.7vp1蛋白可与gi.7_m57xvp1蛋白(其中x＝i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h)(seqidno：179，图29i；seqidno：290；图29m)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性的序列，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57的位置处的取代、修饰或突变保持为i、v、a、l、g、s、t、n、q、k或h，例如异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸，且前提是在向受试者施用时，gi.7_m57xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.7vp1的序列可从任何gi.7毒株获得，例如但不限于gi.7/ga5043/usa/2014(seqidno：101，氨基酸；图16a)。

-gi.7_r84svp1(gi.7_r84x，其中x＝s、n、c或t，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的精氨酸已突变成例如丝氨酸(gi.7_r84s；seqidno：177，图29g)；或展现与gi.7_r84svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.7vp1蛋白可与gi.7_r84svp1蛋白(seqidno：177，图29g)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性的序列，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t，例如丝氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.7vp1的序列可从任何gi.7毒株获得，例如但不限于gi.7/ga5043/usa/2014(seqidno：101，氨基酸；图16a)。

-gi.7_m57x+r84xvp1，其中x＝l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h，且x＝s、n、c或t，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57和84的蛋氨酸和精氨酸已分别突变成例如异亮氨酸和丝氨酸(gi.7_m57i+r84s；seqidno：181，图29k)；或展现与gi.7_m57i+r84svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gi.7vp1蛋白可与gi.7_m57i+r84svp1蛋白(seqidno：181，图29k)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57和84的位置处的取代、修饰或突变分别保持为l、i、a、v、m、t、e、d、n、q、k或h(例如异亮氨酸)以及s、n、c或t(例如丝氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gi.7_m57x+r84xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gi.7vp1的序列可从任何gi.7毒株获得，例如但不限于gi.7/ga5043/usa/2014(seqidno：101，氨基酸；图16a)。

-gii.2_e80svp1(gii.2_e80x，其中x＝s、n、c或t，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的谷氨酸已突变成例如丝氨酸(gii.2_e80s；seqidno：85，图30a)；或展现与gii.2_e80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.2vp1蛋白可与gii.2_e80svp1蛋白(seqidno：85，图30a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t，例如丝氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.2vp1的序列可从任何gii.2毒株获得，例如但不限于hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14，氨基酸；图17a)。

-gii.2_a90lvp1(gii.2_a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：例如其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丙氨酸已突变成亮氨酸(gii.2_a90l；seqidno：41，图30c)；或展现与转换gii.2_a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.2vp1蛋白可与gii.2_a90lvp1蛋白(seqidno：41，图30c)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m或v，例如亮氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.2vp1的序列可从任何gii.2毒株获得，例如但不限于hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14，氨基酸；图17a)。

-gii.2_e80s+a90lvp1(gii.2_e80x，其中x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酸和丙氨酸已分别突变成例如丝氨酸和亮氨酸(gii.2_e80s+a90l；seqidno：43，图30e)；或展现与mutgii.2_e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.2vp1蛋白可与gii.2_e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：43，图30e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.2vp1的序列可从任何gii.2毒株获得，例如但不限于hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14，氨基酸；图17a)。

-gii.2_a39v+e80s+a90lvp1(gii.2_a39x，其中x＝v、l、i或m+e80x，其中x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、84和94的丙氨酸、谷氨酸和丙氨酸已分别突变成例如缬氨酸、丝氨酸和亮氨酸(gii.2_a39v+e80s+a90l；seqidno：182，图30g)；或展现与gii.2_a39v+e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.2vp1蛋白可与gii.2_a39v+e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：182，图30g)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43、84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为v、l、i或m(例如缬氨酸)、s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.2vp1的序列可从任何gii.2毒株获得，例如但不限于hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14，氨基酸；图17a)。

-gii.2r53i+e80s+a90lvp1(gii.2_r53x，其中x＝i、l、m、v或a+e80x，其中x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57、84和94的精氨酸、谷氨酸和丙氨酸已分别突变成例如异亮氨酸、丝氨酸和亮氨酸(gii.2_m53i+e80s+a90l；seqidno：184，图30i)；或展现与gii.2_m53i+e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.2vp1蛋白可与gii.2_m53i+e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：184，图30i)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57、84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为i、l、m、v或a(例如异亮氨酸)、s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.2vp1的序列可从任何gii.2毒株获得，例如但不限于hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14，氨基酸；图17a)。

-gii.2a39v+r53i+e80s+a90lvp1(gii.2_a39x，其中x＝v、i、l或m+r53x，其中x＝i、l、m、a或v+e80x，其中x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57、84和94的谷氨酸和丙氨酸已分别突变成例如缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和亮氨酸(gii.2_a39v+r53i+e80s+a90l；seqidno：186，图30k)；或展现与gii.2_a39v+r53i+e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.2vp1蛋白可与gii.2_a39v+r53i+e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：186，图30k)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43、57、84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为v、i、l或m(例如缬氨酸)、i、l、m、v或a(例如异亮氨酸)、s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.2vp1的序列可从任何gii.2毒株获得，例如但不限于hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(seqidno：14，氨基酸；图17a)。

-gii.3_e80svp1(gii.3_e80x，其中x＝s、n、c或t，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的谷氨酸已突变成例如丝氨酸(gii.3_e80s；seqidno：46，图31a)；或展现与mutgii.3_e80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.3vp1蛋白可与gii.3_e80svp1蛋白(seqidno：46，图31a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t，例如丝氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.3vp1的序列可从任何gii.3毒株获得，例如但不限于gii.3/jingzhou/2013402/chn(seqidno：15，氨基酸；图18a)。

-gii.3_a90lvp1(gii.3_a90x，其中x＝l、i、m或v)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丙氨酸已突变成例如亮氨酸(gii.3_a90l；seqidno：48，图31c)；或展现与gii.3_a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.3vp1蛋白可与gii.3_a90lvp1蛋白(seqidno：48，图31c)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m或v，例如亮氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.3vp1的序列可从任何gii.3毒株获得，例如但不限于gii.3/jingzhou/2013402/chn(seqidno：15，氨基酸；图18a)。

-gii.3_e80s+a90lvp1(gii.3_e80x，x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酸和丙氨酸已分别突变成例如丝氨酸和亮氨酸(gii.3_e80s+a90l；seqidno：50，图31e)；或展现与gii.3_e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.3vp1蛋白可与gii.3_e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：50，图31e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.3vp1的序列可从任何gii.3毒株获得，例如但不限于gii.3/jingzhou/2013402/chn(seqidno：15，氨基酸；图18a)。

-gii.4_a39xvp1，其中x＝v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h，其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43的丙氨酸已突变成例如缬氨酸(gii.4_a39v；seqidno：53，图32a)、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸；或展现与gii.4_a39xvp1(其中x＝v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h)的vp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例且不被视为限制性的，gii.4vp1可与gii.4_a39vvp1蛋白(seqidno：53，图32a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43的位置处的取代、修饰或突变保持为v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h，例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸，且前提是在向受试者施用时，gii.4_a39xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_v47pvp1(gii.4_v47x，其中x＝p或g，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸51的缬氨酸已突变成例如脯氨酸(gii.4_v47p；seqidno：55，图32c)；或展现与gii.4_v47pvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_v47pvp1蛋白(seqidno：55，图32c)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸51的位置处的取代、修饰或突变保持为p或g，例如脯氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_r53ivp1(gii.4_r53i，其中x＝i、l、v、a或m，vp1)：例如其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57的精氨酸已突变成异亮氨酸(gii.4_r53i；seqidno：57，图32e)；或展现与gii.4_r53ivp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_r53ivp1蛋白(seqidno：57，图32e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57的位置处的取代、修饰或突变保持为i、l、v、a或m，例如异亮氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_p80xvp1，其中x＝s、n、c、t、a、k或h，其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的脯氨酸已突变成例如丝氨酸(gii.4_p80s；seqidno：59，图32g)、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸；或展现与gii.4_p80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_p80svp1蛋白(seqidno：59，图32g)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c、t、a、k或h，例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸，且前提是在向受试者施用时，gii.4_p80xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_s90lvp1(gii.4_s90x，其中x＝l、i、m、a或v，vp1)：例如其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丝氨酸已突变成亮氨酸(gii.4_s90l；seqidno：61，图32i)；或展现与gii.4_s90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_s90lvp1蛋白(seqidno：61，图32i)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m、a或v，例如亮氨酸，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_δ35-42vp1：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的39至46位的氨基酸已缺失(gii.4_δ35-42；seqidno：63，图32k)；或展现与gii.4_δ35-42vp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_δ35-42vp1蛋白(seqidno：63，图32k)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的39至46位的氨基酸保持缺失，且在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_sstavatavp1：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的39至46位的氨基酸已突变成肽序列sstavata(seqidno：168；gii.4_sstavata；seqidno：65，图32m)；或展现与mutgii.4_sstavatavp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_sstavatavp1蛋白(seqidno：65，图32m)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸39至46的位置保持为肽序列sstavata，且前提是在向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_a39x+r53xvp1，其中x＝v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h，且x＝i、l、m、a或v，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43和57的丙氨酸和精氨酸已分别突变成例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸以及异亮氨酸(例如gii.4_a39v+r53i；seqidno：188，图32aa)；或展现与gii.4_a39v+r53ivp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_a39v+r53ivp1蛋白(seqidno：188，图32aa)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43和57的位置处的取代、修饰或突变分别保持为v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h(例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸)以及i、l、m、v或a(例如异亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gii.4_a39x+r53xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_a39x+p80xvp1，其中x＝v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h，且x＝s、n、c、t、a、k或h，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43和84的丙氨酸和脯氨酸已分别取代或突变成例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸以及丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸(例如gii.4_a39v+p80s；seqidno：67，图32o)；或展现与gii.4_a39x+p80xvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_a39v+p80svp1蛋白(seqidno：67，图32o)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43和84的位置处的取代、修饰或突变分别保持为v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h(例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸)以及s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gii.4_a39x+p80xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_v47p+p80svp1(gii.4_v47x，其中x＝p或g+p80x，其中x＝s、n、c、t、a、k或hvp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸51和84的缬氨酸和脯氨酸已分别取代或突变成例如脯氨酸以及丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸(例如gii.4_v47p+p80s；seqidno：69，图32q)；或展现与gii.4_v47p+p80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_v47p+p80svp1蛋白(seqidno：69，图32q)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸51和84的位置处的取代、修饰或突变分别保持为p或g(例如脯氨酸)以及s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gii.4_v47x+p80xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_r53i+p80svp1(gii.4_r53x，其中x＝i、l、v、a或m+p80x，其中x＝s、n、c、t、a、k或h，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57和84的精氨酸和脯氨酸已分别突变成例如异亮氨酸以及丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸(例如gii.4_r53i+p80s；seqidno：71，图32s)；或展现与gii.4_r53i+p80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_r53i+p80svp1蛋白(seqidno：71，图32s)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57和84的位置处的取代、修饰或突变分别保持为i、l、v、a或m(例如异亮氨酸)以及s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gii.4_r53x+p80xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_p80s+s90lvp1(gii.4_p80x，其中x＝s、n、c、t、a、k或h+s90x，其中x＝l、i、m、a或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的脯氨酸和丝氨酸已分别突变成例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸以及亮氨酸(例如gii.4_p80s+s90l；seqidno：73，图32u)；或展现与gii.4_p80s+s90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_p80s+s90lvp1蛋白(seqidno：73，图32u)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)以及l、i、m、a或v(例如亮氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gii.4_p80x+s90xvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_a39x+r53x+p80zvp1，其中x＝v、i、l、m、g、s、ｅ、d、n、q、k或h，其中x＝i、l、m、a或v，且z＝s、n、c、t、a、k或h，其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57和84的丙氨酸和精氨酸已分别在39位取代或突变成例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸，在53位取代或突变成异亮氨酸，且在80位取代或突变成丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸(例如gii.4_a39v+r53i+p80s；seqidno：190，图32cc)；或展现与gii.4_a39v+r53i+p80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_a39v+r53i+p80svp1蛋白(seqidno：190，图32cc)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43、57和84的位置处的取代、修饰或突变分别保持为v、i、l、m、g、s、e、d、n、q、k或h(例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸)、i、l、m、a或v(例如异亮氨酸)以及s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)，且前提是在向受试者施用时，gii.4_a39x+r53x+p80zvp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_p80s+δ35-42vp1(gii.4_p80x，其中x＝s、n、c、t、a、k或h，+δ35-42，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的84位的脯氨酸已突变成例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸，且对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的39至46位的氨基酸已缺失(gii.4_p80s+δ35-42；seqidno：75，图32w)；或展现与gii.4_p80s+δ35-42vp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_p80s+δ35-42vp1蛋白(seqidno：75，图32w)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)且对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的39至46位的氨基酸保持缺失，且当向受试者施用时，gii.4_p80x+δ35-42vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.4_p80s+sstavatavp1(gii.4_p80x，其中x＝ss、n、c、t、a、k或h+sstavata，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的84位的脯氨酸已突变成例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸，且对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的39至46位的氨基酸已突变成肽序列sstavata(seqidno：168；gii.4_p80s+sstavata；seqidno：77，图32y)；或展现与mutgii.4_p80s+sstavatavp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.4vp1蛋白可与gii.4_p80s+sstavatavp1蛋白(seqidno：77，图32y)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置保持为s、n、c、t、a、k或h(例如丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸)且对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸39至46的位置保持为肽序列sstavata，且当向受试者施用时，gii.4_p80x+sstavatavp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.4vp1的序列可从任何gii.4毒株获得，例如但不限于gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(seqidno：16，氨基酸；seqidno：52，核苷酸；图19a和19b)。

-gii.6_e80svp1(gii.6_e80x，其中x＝s、n、c或t，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的谷氨酸已突变成例如丝氨酸(gii.6_e80s；seqidno：79，图33a)；或展现与gii.6_e80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.6vp1蛋白可与gii.6_e80svp1蛋白(seqidno：79，图33a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.6vp1的序列可从任何gii.6毒株获得，例如但不限于gii.6/ohio/490/2012/usa(seqidno：20，氨基酸；seqidno：21，核苷酸；图21a和21b)。

-gii.6_s90lvp1(gii.6_s90x，其中x＝l、i、m、a或v，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丝氨酸已突变成例如亮氨酸(gii.6_s90l；seqidno：81，图33c)；或展现与gii.6_s90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.6vp1蛋白可与gii.6_s90lvp1蛋白(seqidno：81，图33c)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m、a或v(例如亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.6vp1的序列可从任何gii.6毒株获得，例如但不限于gii.6/ohio/490/2012/usa(seqidno：20，氨基酸；seqidno：21，核苷酸；图21a和21b)。

-gii.6_e80s+s90lvp1(gii.6_e80x，其中x＝s、n、c或t+s90x，其中x＝l、i、m、a或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酸和丝氨酸已分别突变成例如丝氨酸和亮氨酸(gii.6_e80s+s90l；seqidno：83，图33e)；或展现与gii.6_e80s+s90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.6vp1蛋白可与gii.6_e80s+s90lvp1蛋白(seqidno：83，图33e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m、a或v(例如亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.6vp1的序列可从任何gii.6毒株获得，例如但不限于gii.6/ohio/490/2012/usa(seqidno：20，氨基酸；seqidno：21，核苷酸；图21a和21b)。

-gii.12_e80svp1(gii.12_e80x，其中x＝s、n、c或t，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84的谷氨酸已突变成例如丝氨酸(gii.12_e80s；seqidno：88，图34a)；或展现与gii.12_e80svp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.12vp1蛋白可与gii.12_e80svp1蛋白(seqidno：88，图34a)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84的位置处的取代、修饰或突变保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.12vp1的序列可从任何gii.12毒株获得，例如但不限于gii.12/hs206/2010/usa(seqidno：19，氨基酸；图23a)。

-gii.12_a90lvp1(gii.12_a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丙氨酸已突变成例如亮氨酸(gii.12_a90l；seqidno：90，图34c)；或展现与gii.12_a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.12vp1蛋白可与gii.12_a90lvp1蛋白(seqidno：90，图34c)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.12vp1的序列可从任何gii.12毒株获得，例如但不限于gii.12/hs206/2010/usa(seqidno：19，氨基酸；图23a)。

-gii.12_e80s+a90lvp1(gii.12_e80x，其中x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酸和丙氨酸已分别突变成例如丝氨酸和亮氨酸(gii.12_e80s+a90l；seqidno：92，图34e)；或展现与gii.12_e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.12vp1蛋白可与gii.12_e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：92，图34e)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.12vp1的序列可从任何gii.12毒株获得，例如但不限于gii.12/hs206/2010/usa(seqidno：19，氨基酸；图23a)。

-gii.17_a39vvp1(gii.17_a39x，其中x＝v、i、l或m，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43的丙氨酸已突变成例如缬氨酸(gii.17_a39v；seqidno：192，图34g)；或展现与gii.17_a39vvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.17vp1蛋白可与gii.17_a39vvp1蛋白(seqidno：192，图34g)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43的位置处的取代、修饰或突变保持为v、i、l或m(例如缬氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.17vp1的序列可从任何gii.17毒株获得，例如但不限于hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(seqidno：24，氨基酸；seqidno：25，核苷酸；图26a和26b)。

-gii.17r53ivp1(gii.17_r53i，其中x＝i、l、v、a或m，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸57的精氨酸已突变成例如异亮氨酸(gii.17_r53i；seqidno：194，图34i)；或展现与gii.17_r53ivp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.17vp1蛋白可与gii.17_r53ivp1蛋白(seqidno：194，图34i)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸57的位置处的取代、修饰或突变保持为i、l、v、a或m(例如异亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.17vp1的序列可从任何gii.17毒株获得，例如但不限于hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(seqidno：24，氨基酸；seqidno：25，核苷酸；图26a和26b)。

-gii.17_a90lvp1(gii.4_a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸94的丝氨酸已突变成例如亮氨酸(gii.17_a90l；seqidno：196，图34k)；或展现与gii.17_a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.17vp1蛋白可与gii.17_a90lvp1蛋白(seqidno：196，图34k)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间的任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸94的位置处的取代、修饰或突变保持为l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.17vp1的序列可从任何gii.17毒株获得，例如但不限于hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(seqidno：24，氨基酸；seqidno：25，核苷酸；图26a和26b)。

-gii.17_a39v+r53ivp1(gii.17_a39x，其中x＝v、i、l或m+r53x，其中x＝i、l、m、a或v，vp1)：例如其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43和57的丙氨酸和精氨酸已分别突变成缬氨酸和异亮氨酸(gii.17_a39v+r53i；seqidno：198，图34m)；或展现与gii.17_a39v+r53ivp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间的任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.17vp1蛋白可与gii.17_a39v+r53ivp1蛋白(seqidno：198，图34m)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸43和57的位置处的取代、修饰或突变分别保持为v、i、l或m(例如缬氨酸)以及i、l、m、a或v(例如异亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.17vp1的序列可从任何gii.17毒株获得，例如但不限于hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(seqidno：24，氨基酸；seqidno：25，核苷酸；图26a和26b)。

-gii.17_e80s+a90lvp1(gii.4_e80x，其中x＝s、n、c或t+a90x，其中x＝l、i、m或v，vp1)：其中分别对应于诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸84和94的谷氨酸和丙氨酸已分别突变成丝氨酸和亮氨酸(gii.17_e80s+a90l；seqidno：200，图34o)；或展现与gii.17_e80s+a90lvp1蛋白的氨基酸序列约80％至100％或其间任何量的序列相似性的序列。举例来说，gii.17vp1蛋白可与gii.17_e80s+a90lvp1蛋白(seqidno：200，图34o)的氨基酸序列具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的序列相似性，前提是在对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸84和94的位置处的取代、修饰或突变分别保持为s、n、c或t(例如丝氨酸)以及l、i、m或v(例如亮氨酸)，且前提是当向受试者施用时，所述vp1蛋白诱导对诺如病毒的免疫。编码gii.17vp1的序列可从任何gii.17毒株获得，例如但不限于hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(seqidno：24，氨基酸；seqidno：25，核苷酸；图26a和26b)。

vlp产量

参考图5b展示可与包括gi.3vp1蛋白的vlp的产量比较而观察的vp1的已改进特性的实例(参见实例3)。修饰后诺如病毒vp1蛋白gi.3_s94x(其中x＝l、v、i、m、t、e、d、n、q、k或h)(参见图5f)、gi.3_m57i+s94l(参见图5d)和gi.3_q84s+s94l(参见图5b)在植物中的表达得到与野生型gi.3vp1的产量相比相似或更高的vlp产量。此外，修饰后诺如病毒vp1蛋白gi.7_m57x(其中x＝i、l、g、s、t、n、q、k或h)(参见图6f)在植物中的表达得到与野生型gi.7vp1的产量相比相似或更高的vlp产量。

参考图9a至9e和9h展示增加的vlp产量的相似改进特性。包括诺如病毒修饰后vp1蛋白gii.4_r53i(图9d)、gii.4_p80x(其中x＝s、a、n、k或h)(图9b和9h)、gii.4_p80s+r53i(图9d)、gii.4_p80s+a39x(其中x＝v、i、m、t、e、d、n、q、k或h)(图9c和9i)、gii.4_p80s+s90l(图9b)、gii.4_p80s+δ35-42(图9c)、gii.4_p80s+sstavata(图9f)以及gii.4_a39v+r53i_p80s(图9g)的vlp展现在植物中的提高vlp产量；而gii.4_a39v和gii.4_v47p展现与包括野生型gii.4vp1的vlp相比稍稍增加的蛋白质产量。

在表达gii.6_s90lvp1的植物浸提物中也观察到与野生型相比增加的vlp产量(图10a和10b)。

与包括对应野生型(天然)vp1蛋白的vlp的产量相比，包括在84位(gi毒株)或80位(gii毒株，与gi.1vp1的84位对应或比对)处具有氨基酸取代的修饰后vp1蛋白的vlp展现相同(gi.3_q84s；gi.5_q84s，同样参见图6b；gii.3_e80s，同样参见图8a)或增加(gi.7_r84s；gi.7_m57i+r84s；同样参见图6d；gii.4_p80s，同样参见图9b至9f；gii.12_e80s)的vlp产量。

针对所检测的所有修饰后vp1蛋白(gi.3_s94x，其中x＝l、v、i、m、t、e、d、n、q、k或h(图5b和5f)；gi.5_a94l(参见图6b)；gii.2_a90l(参见图7b)；gii.4_s90l(参见图9b)；gii.6_s90l(参见图10a)；gii.12_a90l(参见图11b)；以及gii.17_a90l(参见图11d))，与包括对应野生型或天然vp1蛋白的vlp的产量相比，包括在94位(gi毒株)或在90位(gii毒株，与gi.1vp1的94位对应或比对)处具有氨基酸取代的修饰后vp1蛋白的vlp展现相同或增加的vlp产量。

类似地，针对所检测的所有修饰后vp1蛋白(gi.3_q84s+s94l，同样参见图5b；gi.5_q84s+a94l，同样参见图6b；gii.2_e80s+a90l，同样参见图7b和7c；gii.4_p80s+s90l，同样参见9b；以及gii.12_e80s+a90l，同样参见11b)，与包括对应野生型或天然vp1蛋白的vlp的产量相比，包括在84和94位(gi毒株)或80和90位(gii毒株，与gi.1vp1的84和94位对应或比对)处具有氨基酸取代的修饰后vp1蛋白的vlp展现增加的vlp产量。

还观察到其它修饰增加vlp产量。这些修饰包含gi.3_m57i+s94l(图5d)、gi.7_m57i(图6d)、gi.7_m57i+r84s(图6d)、gii.2_a39v+e80s+a90l(图7c)、gii.2_r53i+e80s+a90l(图7c)、gii.4_r53i(图9d)、gii.4_a39v+p80x(其中x＝s、a、n、k或h)(图9c和9i)、gii.4_r53i+p80s(图9d)、gii.4_v47p+p80s(图9e)、gii.4_δ35-42+p80s(图9c)以及gii.4_a39v+r53i+p80s(图9g)。

vlp的大小、密度、稳定性和质量

如图5b所示，与野生型诺如病毒gi.3vp1相比，突变诺如病毒vp1蛋白gi.3_s94l和gi.3_q84s+s94l展现vlp具有较大密度(通过蛋白质浸提物的碘克沙醇密度梯度级分的考马斯染色sdspage测量)的改进特性，使得在级分1(f1)中观察到vlp且在级分f2到f6中观察到峰。这些结果指示，天然gi.3vlp的组装可能不如gi.3_s94lvlp稳定，且天然gi.3vlp可能对更容易受急性衣壳颗粒影响并产生片段化产物。因此，包括gi.3_s94lvp1、gi.3_m57i+s94l和gi.3_q84s+s94lvp1的vlp展现比野生型gi.3vp1更好的结构完整性。还观察到，与野生型相比，包括gi.3_s94lvp1、gi.3_m57i+s94l和gi.3_q84s+s94lvp1的vlp包括更大的38nm直径vlp对23nm直径vlp相对比例，如使用透射电子显微法(tem)所确定(图5c和5e)。

与野生型诺如病毒gi.5vp1相比，包括gi.5_q84svp1、gi.5_a94lvp1或gi.5_q84s+a94lvp1蛋白的vlp展现产量的增加，且gi.5_q84s+a94lvp1还展现更大的密度、稳定性和结构完整性(以类似于上文关于使用修饰后gi.3vp1产生的vlp所描述的方式)(图6b)。如图6c所示，所得vlp具有与野生型相比更少的受损vlp颗粒以及更大的38nm直径颗粒对23nm直径vlp相对比例。

还观察到包括gi.7_r84s、gi.7_m57i、gi.7_m57i+r84svp1蛋白的vlp展现与野生型诺如病毒gi.7vp1相比相同或更大的密度(图6d)。如图6e所示，修饰后vlp具有与野生型相比更少的受损vlp颗粒以及更大的38nm直径颗粒对23nm直径vlp相对比例。

包括gii.2_e80s+a90l、gii.2_a39v+e80s+a90lvp1蛋白的vlp展现与野生型诺如病毒gii.2vp1相比更大的密度、稳定性和结构完整性(以类似于上文所描述的方式)(图7c)。如图7c所示，修饰后vlp具有与野生型相比更少的受损vlp颗粒以及更大的38nm直径颗粒对23nm直径vlp相对比例。

gii.3_e80s在植物中的表达产生具有38nm直径颗粒的vlp(图8b)。然而，vp1蛋白的产量(通过sds-page确定)仍然低。

如图9b、9c、9d和9g所示，修饰后vp1蛋白gii.4_a39v、gii.4_v47p、gii.4_r53i、gii.4_p80s、gii.4_s90l、gii.4_a39v+p80s、gii.4_r53i+p80s、gii.4_p80s+s90l、gii.4_p80s+δ35-42和gii.4_a39v+r53i+p80s全部展现与包括野生型gii.4vp1蛋白的vlp相比具有更大密度、稳定性和结构完整性的vlp。此外，包括gii.4_a39v+p80s、gii.4_r53i+p80s、gii.4_p80s+s90l、gii.4_p80s+δ35-42和gii.4_a39v+r53i+p80s的vlp全部具有改进的病毒衣壳完整性和较少的受损颗粒，如通过tem所见(图9b、9c、9d和9e)。还观察到包括gii.4_a39v+p80s和gii.4_p80s+δ35-42的vlp与野生型gii.4vlp相比具有更大的38nm直径颗粒对23nm直径颗粒比例(图9b和9c)。vlp也可由gii.4_v47p、gii.4_v47p+p80s、gii.4_sstavata、gii.4_p80s+sstavata产生(图9e和9f)。

如图10a和10b所示，修饰后诺如病毒vp1蛋白gii.6_s90l的表达产生38nm直径vlp，如使用透射电子显微法(tem)所确定。

包括gii.12_e80s、gii.12_a90l和gii.12_e80s+a90l的vlp还展现与包括野生型gii.12vp1的vlp相比具有更大密度的38nm直径vlp的改进特性(图11c)，如使用透射电子显微法(tem)所确定。

包括gii.17_a39v、gii.17_a90l和gii.17_r53i的vlp还展现与包括野生型gii.17vp1的vlp相比具有更大密度的38nm直径vlp的改进特性(图11d)，如使用透射电子显微法(tem)所确定。

对诺如病毒感染的免疫的诱导

“免疫应答”通常指代受试者的适应性免疫系统的应答。适应性免疫系统通常包括体液应答和细胞介导的应答。体液应答是由在b淋巴细胞系的细胞(b细胞)产生的分泌抗体介导的免疫方面。分泌的抗体与入侵微生物(例如病毒或细菌)表面上的抗原结合，这标志着所述微生物的破坏。体液免疫通常用于指代抗体产生和其伴随的过程以及抗体的效应功能，包含th2细胞活化和细胞因子产生、记忆细胞产生、吞噬作用的调理素促进、病原体清除等。术语“调节(modulate或modulation)”等指代特定应答或参数的增大或减小，如通过通常已知或使用的几种测定中的任一个确定，本文中例示所述测定中的一些。

细胞介导应答是不涉及抗体而是涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞、抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的活化以及响应于抗原的各种细胞因子的释放的免疫应答。细胞介导的免疫通常用于指代某些th细胞活化、tc细胞活化和t细胞介导的应答。细胞介导的免疫可能在对病毒感染作出响应方面尤其重要。

举例来说，可使用elispot测定测量抗原特异性cd8阳性t淋巴细胞的诱导；可使用增殖测定测量cd4阳性t淋巴细胞的刺激。可使用elisa测定来对抗诺如病毒抗体滴度进行定量；还可使用抗同型抗体(例如抗igg、iga、ige或igm)来测量抗原特异性或交叉反应性抗体的同型。用于进行这些测定的方法和技术是本领域中已知的。

还可对细胞因子的存在或含量进行定量。举例来说，t辅助细胞应答(th1/th2)将通过使用elisa(例如bdbiosciencesopteia试剂盒)测量ifn-γ和il-4分泌细胞来表征。可培养从受试者获得的外周血单核细胞(pbmc)或脾细胞，并分析上清液。还可使用标记物特异性荧光标记和本领域已知的方法通过荧光激活细胞分选(facs)对t淋巴细胞进行定量。

还可以进行微量中和测定以表征受试者的免疫应答，参见例如rowe等人，1973的方法。可以用多种方式对病毒中和滴度进行定量，包含：细胞的结晶紫固定/着色之后的溶菌斑枚举(噬斑试验)；体外培养中的细胞溶解的显微观察；以及2)诺如病毒的elisa和分光光度检测。

如本文所用的术语“表位”指代抗原的与抗体特异性结合的结构部分。

使用balb/c小鼠进行对植物产生野生型诺如病毒天然gi.1(seqidno：1)vlp施用的免疫应答(实例4)。还可以对小鼠施用使用以下物质产生的植物产生修饰后vp1蛋白或包括修饰后vp1蛋白的vlp：gi.3_q84s(构建体4140；seqidno：167)、gi.3_s94l(构建体4141；seqidno：9)、gi.3_a43v+s94l(构建体4179；seqidno：169)、gi.3_m57i+s94l(构建体4180；seqidno：171)、gi.3_p84s+s94l(构建体4142；seqidno：11)、gi.3_a43v+m57i+s94l(构建体4181；seqidno：173)、gi.5_q84s(构建体4130；seqidno：35)、gi.5_a94l(构建体4131；seqidno：37)、gi.5_q84s+a94l(构建体4132；seqidno：39)、gi.7_r84s(构建体4210；seqidno：176)、gi.7_m57i(构建体4217；seqidno：178)、gi.7_m57i+r84s(构建体4218；seqidno：180)、gii.2_e80s(构建体4143；seqidno：86)、gii.2_a90l(构建体4144；seqidno：42)、gii.2_q80s+a90l(构建体4145；seqidno：44)、gii.2_a39v+q80s+a90l(构建体4182；seqidno：183)、gii.2_r53i+q80s+a90l(构建体4183；seqidno：185)、gii.2_a39v+r53i+q80s+a90l(构建体4184；seqidno：187)、gii.3_e80s(构建体4146；seqidno：47)、gii.3_a90l(构建体4147；seqidno：49)、gii.3_e80s+a90l(构建体4148；seqidno：51)、gii.4_a39v(构建体4155；seqidno：54)、gii.4_v47p(构建体4156；seqidno：56)、gii.4_r53i(构建体4157；seqidno：58)、gii.4_p80s(构建体4133；seqidno：60)、gii.4_s90l(构建体4134；seqidno：62)、gii.4_δ35-42(构建体4158；seqidno：64)、gii.4_sstavata(构建体4159；seqidno：66)、gii.4_a39v+r53i(构建体4185；seqidno：189)、gii.4_a39v+p80s(构建体4165；seqidno：68)、gii.4_v47p+p80s(构建体4166；seqidno：70)、gii.4_r53i+p80s(构建体4167；seqidno：72)、gii.4_p80s+s90l(构建体4135；seqidno：74)、gii.4_δ35-42+p80s(构建体4168；seqidno：76)、gii.4_p80s+sstavata(构建体4169；seqidno：78)、gii.4_a39v+r53i+p80s(构建体4186；seqidno：191)、gii.6_e80s(构建体4149；seqidno：80)、gii.6_s90l(构建体4150；seqidno：82)、gii.6_e80s+s90l(构建体4151；seqidno：84)、gii.12_e80s(构建体4136；seqidno：89)、gii.12_a90l(构建体4137；seqidno：91)、gii.12_e80s+a90l(构建体4138；seqidno：93)、gii.17_a39v(构建体4234；seqidno：193)、gii.17_r53i(构建体4235；seqidno：195)、gii.17_a90l(构建体4232；seqidno：197)、gii.17_a39v+r53i(构建体4236；seqidno：199)、gii.17_e80s+a90l(构建体4233；seqidno：201)或其组合。针对gi.1vlp特异性总igg和iga抗体使用gi.1vlp涂布培养板通过elisa分析来自从动物采集的血液的血清样本。参考图3d，对于每一个处理组，用来自gi.1基因型的植物诺如病毒天然vp1vlp免疫的小鼠在血清中展现gi.1vlp特异性igg抗体滴度。由每一次处理诱导的igg滴度水平在统计学上高于针对安慰剂组定量的滴度(p＜0.05)。igg滴度水平以剂量依赖方式提高(在调配有alhydrogel或无alhydrogel的1μg与10μg处理之间检测到明显差异；p＜0.05)。针对每一个处理组，还在第21天与第42天之间检测到igg滴度水平的明显提高(p＜0.05)。这些结果共同证实植物产生的诺如病毒天然vp1vlp在小鼠中引发稳固免疫应答的能力。

因此，本文提供一种产生抗体或抗体片段的方法，其包括向受试者或宿主动物施用修饰后诺如病毒vp1蛋白或包括一种或一种以上修饰后vp1蛋白的诺如病毒vlp，从而产生抗体或抗体片段。修饰后诺如病毒vp1蛋白(givp1蛋白或giivp1蛋白)包括：在选自与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的位置的氨基酸残基处的一个或一个以上取代、修饰或突变；与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失；对应于诺如病毒vp1基因型gi.1的氨基酸残基39至46的突变成序列sstavata的氨基酸；或其组合，且核苷酸序列不来源于基因型gi.1诺如病毒vp1。vlp可进一步包括诺如病毒vp2蛋白。

还提供一种用于诱导免疫应答的组合物，其包括有效剂量的包括修饰后诺如病毒vp1蛋白的vlp以及药学上可接受的载剂、佐剂、媒剂或赋形剂。

植物表达

可使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微量注射、电穿孔等将本发明的构建体引入植物细胞中。对于这些技术的综述，参见例如weissbach和weissbach，植物分子生物学方法(methodsforplantmolecularbiology)，academypress出版社，纽约viii，第421-463页(1988)；geierson和corey，植物分子生物学，第2版(1988)；以及miki和iyer，植物基因转移基础(fundamentalsofgenetransferinplants)，植物代谢(plantmetabolism)，第2版dt.dennis、dhturpin、ddlefebrvre、dblayzell(编)，addisonwesly出版社，伦敦langmansltd.公司，第561-579页(1997)。其它方法包含直接dna摄取、使用脂质体、电穿孔、例如使用原生质体、微量注射、微粒或晶须以及真空浸渗。参见例如bilang等人(1991，基因(gene)100：247-250)、scheid等人(1991，分子遗传学和普通遗传学(mol.gen.genet.)228：104-112)、guerche等人(1987，植物科学(plantscience)52：111-116)、neuhause等人(1987，理论与应用遗传学(theor.applgenet.)75：30-36)、klein等人(2987，自然327：70-73)、freeman等人(1984，植物细胞生理学(plantcellphysiol.)29：1353)、howell等人(1980，科学208：1265)、horsch等人(1985，科学227：1229-1231)、deblock等人(1989，植物生理学91：694-701)、植物分子生物学方法(weissbach和weissbach编，academicpressinc.公司，1988)、植物分子生物学(schuler和zielinski编，academicpressinc.公司，1989)、wo92/09696、wo94/00583、ep331083、ep175966、liu和lomonossoff(2002，病毒学方法杂志(jvirolmeth)，105：343-348)、ep290395、wo8706614、美国专利第4,945,050号、第5,036,006号和第5,100,792号、1995年5月10日提交的美国专利申请第08/438,666号以及1992年9月25日提交的美国专利申请第07/951,715号(全部参考文献在此以引用的方式并入)。

瞬时表达方法可用于表达本发明的构建体(参见d’aoust等人，2009，分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)，第483卷，第41-50页；liu和lomonossoff，2002，病毒学方法杂志，105：343-348；以引用的方式并入本文)。或者，可使用基于真空的瞬时表达方法，如kapila等人(1997，植物科学122，101-108；以引用方式并入本文)或wo00/063400、wo00/037663(以引用方式并入本文)中所描述。例如这些方法可包含但不限于农杆菌接种(agro-inoculation)或农杆菌浸渗、注射器浸渗方法，但也可使用其它瞬时方法，如上文所提出。对于农杆菌接种、农杆菌浸渗或注射器浸渗，包括所需核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶片、植物的气生部分(包含茎、叶片和花)、植物的其它部分(茎、根、花)或整个植物)的细胞间隙。穿过表皮后，农杆菌感染t-dna拷贝并将其转移到细胞中。t-dna游离转录，且mrna转译，引起被感染细胞中所关注蛋白质的产生，但是t-dna在细胞核内部的穿行是瞬时的。

可用作适用于本文所描述的瞬时蛋白质表达的平台植物的含有本发明的基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子也被认为是本发明的部分。本领域中还已知从植物细胞再生植物整体的方法(例如参见guerineau和mullineaux(1993，植物转化和表达载体(planttransformationandexpressionvectors)。呈现于：牛津植物分子生物学实验(plantmolecularbiologylabfax)(croyrrd编)，bios科学出版社，第121-148页)。一般来说，在适当的培养基中培养已转化的植物细胞，所述培养基可含有选择剂，例如抗生素，其中可选标记物用于帮助鉴别已转化植物细胞。一旦形成愈伤组织，即可通过根据已知方法采用适当植物激素促进成芽，且将芽转移到用于再生植物的生根培养基中。随后可将植物用于从种子产生或使用无性繁殖技术形成重复后代。还可在不进行组织培养的情况下产生转基因植物。本领域中已建立用于稳定转化和再生这些生物体的方法，并且这些方法为本领域技术人员已知。可用的技术综述于vasil等人(植物细胞培养与体细胞遗传学(cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants)，第i、ii和iii卷，实验室程序与其应用(laboratoryproceduresandtheirapplications)，academicpress出版社，1984)，以及weissbach和weissbach(植物分子生物学方法，学术出版社，1989)中。获得转化和再生植物的方法并不是本发明的关键。

如果植物、植物部分或植物细胞将通过两个或多个核酸构建体转化，那么可在单一转染事件中将核酸构建体引入到农杆菌中，使得核酸汇集在一起，并且细菌细胞被转染。或者，可连续地引入构建体。在这种情况下，如所描述的将第一构建体引入到农杆菌中，在仅单一转化的细菌可生长的选择性条件下(例如在存在抗生素的情况下)生长细胞。在这个第一选择步骤之后，如所描述的将第二核酸构建体引入到农杆菌，并且在仅双重转化细菌可生长的双重选择性条件下生长细胞。随后将双重转化细菌用于如本文所描述转化植物、植物部分或植物细胞，或可使其经历另一个转化步骤，从而供应第三核酸构建体。

或者，如果植物、植物部分或植物细胞将通过两个或更多个核酸构建体转化或共转化，那么可通过共浸渗农杆菌细胞与植物、植物部分或植物细胞的混合物来将核酸构建体引入到植物中，每一农杆菌细胞可包括一个或多个要引入到植物中的构建体。为了改变构建体内的所关注核苷酸序列在植物、植物部分或植物细胞内的相对表达水平，在浸渗步骤期间，可改变包括所需构建体的各种农杆菌群的浓度。

因此，本文提供一种植物、植物的部分、植物细胞或植物浸提物，其包括一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白，或包括一种或一种以上修饰后vp1蛋白的诺如病毒vlp。所述一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白包括：在选自与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的氨基酸残基的位置处的一个或一个以上取代、修饰或突变；与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失；或其组合；且核苷酸序列并不是来源于基因型gi.1诺如病毒vp1。vlp可进一步包括诺如病毒vp2蛋白。

本文还提供一种植物、植物的部分、植物细胞或植物浸提物，其包括编码一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白的多核苷酸序列。所述一种或一种以上修饰后诺如病毒vp1蛋白包括：在选自与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的氨基酸残基的位置处的一个或一个以上取代、修饰或突变；与诺如病毒vp1基因型gi.1(seqidno：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失；或其组合；且核苷酸序列并不是来源于基因型gi.1诺如病毒vp1。

在表3中提供诺如病毒株和构建体的列表。

表3：诺如病毒株和构建体。

将在以下实例中进一步说明本发明。

实例1：诺如病毒vp1构建体

用于vp1和vp2的候选序列可在genbank中获得(参见图2a和2b)。这些序列的非限制性实例为：

hu/gi.2/leuven/2003/bel(gi.2；seqidno：4；图13a)；

hu/gi.3/s29/2008/lillaedet/sweden(gi.3；seqidno：6；图14a)；

hu/gi.5/siklos/hun5407/2013/hun(gi.5；seqidno：12；图15a)；

hu/gi.7/usa/2014/ga5043(gi.7，seqidno：101，图16a)

hu/gii.1/ascension208/2010/usa(gii.1；seqidno：13；图16c)；

hu/gii.2/cgmh47/2011/tw(gii.2；seqidno：14；图17a)；

hu/gii.3/jingzhou/2013402/chn(gii.3；seqidno：15；图18a)；

hu/gii.4/sydney/nsw0514/2012/au(gii.4；seqidno：16；图19a)；

us96/gii.4/dresden174/1997/de_ay741811(gii.4；seqidno：27；图19c)；

fh02/gii.4/farmingtonhills/2002/us_ay502023(gii.4；seqidno：28；图19d)；

hnt04：gii.4/hunter-nsw504d/2004/au_dq078814(gii.4；seqidno：29；图19e)；

2006b：gii.4/shellharbour-nsw696t/2006/au_ef684915(gii.4；seqidno：30；图19f)；

no09：gii.4/orange-nsw001p/2008/au_gq845367(gii.4；seqidno：31；图19g)；

gii.14_saga_2008_jpn_ade28701nativevp1(gii.14；seqidno：32；图25)；

hu/gii.5/albertaei390/2013/ca(gii.5；seqidno：17；图20)；

hu/gii.6/ohio/490/2012/usa(gii.6；seqidno：20；图21a)；

g11.7/musa/2010/all73774(gii.7；seqidno：18；图22)；

hu/gii.12/hs206/2010/usa(gii.12；seqidno：19；图23a)；

gii.13/va173/2010/h9awu4(gii.13；seqidno：22；图24a)；

hu/gii.17/kawasaki323/2014/jp(gii.17；seqidno：24；图26a)；

hu/gii.21/salisbury150/2011/usa(gii.21；seqidno：26；图27)。

表4中所列的引物可用于制备下文描述的构建体。

表4：用于制备下文定义的构建体的引物。

wtgi.1诺如病毒vp1：a2x35s/cpmv160/wtvp1gi.1/nos(构建体编号2724)

使用以下基于pcr的方法将来自诺如病毒株gi.1/norwalk/1968/us的编码vp1的人类密码子优化序列克隆到2x35s/cpmv160/nos表达系统中。使用引物if-nov(us68)vp1(orf2)(hcod).c(seqidno：102)和if-nov(us68)vp1(orf2)(hcod).r(seqidno：103)，使用人类密码子优化gi.1vp1基因序列(seqidno：3)作为模板，扩增含有gi.1vp1编码序列的片段。为了序列优化，针对人类密码子使用、gc含量和mrna结构对gi.1/norwalk/1968/usvp1蛋白序列(genbank登录号np_056821)进行反转译(backtranslate)和优化。使用in-fusion克隆系统(加利福利亚州山景城clontech公司)将pcr产物克隆于2x35s/cpmv160/nos表达系统中。用sacii和stui限制性内切酶消化构建体编号1190(seqidno：162；图38a和48)，并且将线性化质粒用于无缝(in-fusion)组装反应。构建体编号1190为打算用于基于2x35s/cpmv160/nos的表达盒中的所关注基因的“无缝(infusion)”克隆的受体质粒。所述构建体还并入有用于在紫花苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子的控制下共表达tbsvp19静默抑制子的基因构建体。主链为pcambia二元质粒，且从左t-dna边界到右t-dna边界的序列呈现于seqidno：162中。所得构建体编号为2724(图38b；seqidno：163)。来自诺如病毒株gi.1/norwalk/1968/us的天然vp1的氨基酸序列呈现于seqidno：1中。质粒2724的图示呈现于图39a中。

2x35s/cpmv160/gii.4_p80s(hcod)/nos+mar(构建体编号4133)

使用以下基于pcr的方法将在s结构域中包括p80s取代的来自gii.4/sydney/nsw0514/2012/au的编码vp1的人类密码子优化序列克隆到2x35s/cpmv160/nos+mar表达系统中。在第一轮pcr中，使用引物if-gii.4syd12vp1.c(seqidno：130)和gii.4(p80s).r(seqidno：138)，使用人类密码子优化gii.4vp1基因序列(seqidno：52)作为模板扩增含有带突变p80s氨基酸的s结构域的片段。使用gii.4(p80s).c(seqidno：139)和if-gii.4syd12vp1.r(seqidno：131)，使用人类密码子优化gii.4vp1基因序列(seqidno：52)作为模板扩增含有p80s取代以及s和p结构域的剩余部分的第二片段。为了序列优化，针对人类密码子使用、gc含量和mrna结构对gii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1蛋白序列(genbank登陆号afv08795)进行反转译和优化。随后将来自两次扩增的pcr产物混合并用作使用if-gii.4syd12vp1.c(seqidno：130)和if-gii.4syd12vp1.r(seqidno：131)作为引物的第二轮扩增的模板。使用无缝克隆系统(加利福利亚山景城clontech公司)将最终pcr产物克隆在2x35s/cpmv160/nos+mar表达系统中。用sacii和stui限制性内切酶消化构建体编号3677(seqidno：164；图38c和49)，并且将线性化质粒用于无缝组装反应。构建体编号3677为打算用于基于2x35s/cpmv160/nos+mar的表达盒中的所关注基因的“无缝”克隆的受体质粒。所述构建体还并入有用于在紫花苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子的控制下共表达tbsvp19静默抑制子的基因构建体。主链为pcambia二元质粒，且从左t-dna边界到右t-dna边界的序列呈现于seqidno：164中。所得构建体编号为4133(图38d；seqidno：165)。突变gii.4_p80s的氨基酸序列呈现于seqidno：59中。质粒4133的图示呈现于图44e中。

2x35s/cpmv160/gii.4_p80s+s90l(hcod)/nos+mar(构建体编号4135)

使用以下基于pcr的方法将在s结构域中包括p80s和s90l取代的来自gii.4/sydney/nsw0514/2012/au的编码vp1的人类密码子优化序列克隆到2x35s/cpmv160/nos+mar表达系统中。在第一轮pcr中，使用引物if-gii.4syd12vp1.c(seqidno：130)和gii.4(s90l).r(seqidno：140)，使用人类密码子优化gii.4_p80svp1基因序列(seqidno：60)作为模板扩增含有带突变p80s和s90l氨基酸的s结构域的片段。使用gii.4(s90l).c(seqidno：141)和if-gii.4syd12vp1.r(seqidno：131)，使用人类密码子优化gii.4_p80svp1基因序列(seqidno：60)作为模板扩增含有s90l取代以及s和p结构域的剩余部分的第二片段。为了序列优化，针对人类密码子使用、gc含量和mrna结构对gii.4/sydney/nsw0514/2012/auvp1蛋白序列(genbank登陆号afv08795)进行反转译和优化。随后将来自两次扩增的pcr产物混合并用作使用if-gii.4syd12vp1.c(seqidno：130)和if-gii.4syd12vp1.r(seqidno：131)作为引物的第二轮扩增的模板。使用无缝克隆系统(加利福利亚山景城clontech公司)将最终pcr产物克隆在2x35s/cpmv160/nos+mar表达系统中。用sacii和stui限制性内切酶消化构建体编号3677(seqidno：164；图38c和49)，并且将线性化质粒用于无缝组装反应。构建体编号3677为打算用于基于2x35s/cpmv160/nos+mar的表达盒中的所关注基因的“无缝”克隆的受体质粒。所述构建体还并入有用于在紫花苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子的控制下共表达tbsvp19静默抑制子的基因构建体。主链为pcambia二元质粒，且从左t-dna边界到右t-dna边界的序列呈现于seqidno：164中。所得构建体编号为4135(seqidno：166)。突变gii.4_p80s+s90l的氨基酸序列呈现于seqidno：73中。质粒4135的图示呈现于图44l中。

在表3和表4中提供对野生型和突变vp1和vp2蛋白、引物、模板和产物的汇总。使用上文参考中用于单一修饰的构建体编号4133和用于双重、三重和四重修饰的构建体编号4135所描述的相同方法来构建具有单一、双重、三重和四重修饰、取代或突变的vp1蛋白。使用与关于构建体编号2724所描述的方法基本上相同的方法来组装vp2蛋白。

实例2：方法

根癌农杆菌转染

使用由d’aoust等人，2008(植物生物技术杂志(plantbiotech.j.)6：930-40)描述的方法通过用天然诺如病毒vp1、天然诺如病毒vp2或诺如病毒vp1突变蛋白表达载体进行电穿孔来转染根癌农杆菌菌株agl1。使转染后的农杆菌在补充有10mm2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)、20μm乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的yeb培养基(ph5.6)中生长至0.6与1.6之间的od600。在使用前将农杆菌悬浮液离心，并且再悬浮于浸渗培养基(10mmmgcl2和10mmmesph5.6)中。

植物生物量、接种体和农杆菌浸渗物的制备

在充满商用泥煤苔基质的浅箱中由种子生长本氏烟植株。使植株在温室中16/8光周期和白天25℃/晚上20℃的温度方案下生长。播种三周后，挑选出单个的小植株，移植到盆中，并让其在温室中在相同环境条件下再生长三周。

使由各天然诺如病毒vp1、天然诺如病毒vp2或诺如病毒vp1突变表达载体转染的农杆菌在补充有10mm2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)、20μm乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的yeb培养基(ph5.6)中生长，直至达到0.6与1.6之间的od600为止。在使用前将农杆菌悬浮液离心，并且再悬浮于浸渗培养基(10mmmgcl2和10mmmesph5.6)中，并在4℃下存储过夜。在浸渗当天，将各培养批次稀释为2.5个培养体积并在使用前使其升温。将整颗本氏烟植株倒置于20至40托真空下的气密不锈钢罐中的细菌悬浮液中，保持2分钟。将植株送回温室，持续6或9天的培育周期，直到收获为止。

叶片收获和总蛋白浸提

培育后，收获植物的气生部分，冷冻于-80℃下并且碎成小块。通过使冷冻破碎植物材料的每一个样本在2体积的冰冷100mm磷酸盐缓冲液ph7.2+150mmnacl、0.4μg/ml偏亚硫酸氢盐和1mm苯甲磺酰氯中均质化(polytron)来浸提总可溶蛋白。均质化后，在4℃下将10,000g浆液离心10分钟，并且保留这些澄清粗浸提物(上清液)以供分析。

使用牛血清白蛋白作为参考标准通过bradford测定(加利福利亚州赫拉克勒斯bio-radlaboratories公司)确定澄清粗浸提物的总蛋白含量。使用criterion^tmtgxstain-free^tm预制凝胶(加利福利亚州赫拉克勒斯bio-radlaboratories公司)在还原条件下通过sds-page分离蛋白质。通过用考马斯亮蓝对凝胶进行染色来使蛋白质可视化。或者，用geldoc^tmez成像系统(加利福利亚州赫拉克勒斯bio-radlaboratories公司)使蛋白质可视化，并电转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)薄膜(rochediagnosticscorporation公司，印第安纳州印第安纳波利斯)上以进行免疫检测。在免疫印迹之前，在4℃下用5％脱脂牛奶和含0.1％吐温-20的tris缓冲盐水(tbs-t)阻断薄膜16至18小时。

蛋白质分析和免疫印迹

用含2％脱脂牛奶的tbs-吐温200.1％中稀释成1/500的对来自gi和gii基因型的vp1具有特异性的一级mab242p抗体进行第一次培育，从而进行免疫印迹。将稀释成1/10000的过氧化物酶缀合山羊抗小鼠(jacksonimmunoresearch，cat编号115-035-146)用作用于化学发光检测的第二抗体，所述第二抗体在含2％脱脂牛奶的tbs-吐温200.1％中稀释。使用鲁米诺作为基质(rochediagnosticscorporation公司)通过化学发光来检测免疫反应复合物。通过使用ez-link活化过氧化物酶缀合试剂盒(伊利诺伊州罗克福德pierce公司)进行人类igg抗体的辣根过氧化物酶缀合。

vlp形成/碘克沙醇梯度的分析

用2体积的浸提缓冲液(100mm磷酸盐缓冲液ph7.2+150mmnacl)在搅拌机中通过机械浸提从冷冻生物质中浸提蛋白质。通过打孔尼龙过滤器过滤浆液以去除较大碎片，并在4℃下以5000g离心5分钟。收集上清液并以5000g再次离心30分钟(4℃)以去除其它碎片。随后将上清液加载到不连续碘克沙醇密度梯度上。如下进行分析性密度梯度离心：准备含有含不连续碘克沙醇密度梯度的醋酸盐缓冲液(1ml45％碘克沙醇、2ml35％碘克沙醇、2ml33％碘克沙醇、2ml31％碘克沙醇、2ml29％碘克沙醇和5ml25％碘克沙醇)的38ml试管，并覆盖含有病毒样颗粒的25ml浸提物。以175000g将梯度离心4小时(4℃)。离心后，从下到上收集1ml级分，并通过sds-page与蛋白质染色或蛋白质印迹法结合分析级分。

电子显微法

如上文所描述的在不连续碘克沙醇密度梯度上离心部分澄清植物浸提物之后，汇集含有样本的级分(1毫升/级分)，与100mmpbsph7.2+150mmnacl缓冲液混合以完全充满试管，并以100000g离心120分钟。取决于vp1量，将球粒再悬浮于300至1000μl缓冲液中。

通过使碳侧面向上放置于皮氏培养皿(petridish)中的whatman滤纸上，来使200nm筛目大小的碳涂布铜载网亲水，并在4℃下培育过夜。使将通过透射电子显微法(tem)观察到来自密度梯度离心的20μl汇集级分沉积于封口膜上，并且使载网以碳侧面向下的方式漂浮并在室温下培育5分钟。随后在20μl水滴上洗涤载网4次，且通过使whatman滤纸与载网侧面接触来排出最后一次洗涤的过量水。接着在20μl2％醋酸双氧铀水溶液液滴上培养载网1分钟。使载网在whatman滤纸上干燥5分钟。以10,000×至150,000×的放大率在透射电子显微镜下进行观察。

实例3：vp1蛋白和vlp在植物中的产生

如实例2中所描述，使用包括编码野生型诺如病毒vp1或突变诺如病毒vp1构建体的表达载体的根癌农杆菌真空浸渗本氏烟叶片以允许vp1序列的表达，并且针对vp1蛋白和/或vlp产生对叶片进行检查。浸渗后9天(dpi)后，通过sds-page分离由叶匀浆制备的总粗蛋白浸提物，并用考马斯染色(vp1产生)，或使用如上文实例2中所描述的不连续碘克沙醇密度梯度分离(vlp产生)。使用考马斯染色sds-page检查来自密度梯度的级分。在大约55至60kda谱带处出现诺如病毒vp1蛋白。密度梯度级分内vp1蛋白的出现指示密度梯度离心期间与vlp相称的级分。同样确定在密度梯度离心后从高峰级分获得的vlp产量。

来自植物的所浸提野生型诺如病毒vp1蛋白的产量或量根据所表达的诺如病毒vp1的基因型而不同。野生型gi.1vp1、gi.5vp1和gii.12vp1展现可容易检测的蛋白质产量，如使用sdspage所确定(图3a)。相比之下，野生型gii.4vp1在植物中的表达不足(图3a右图)，且对于野生型gii.2vp1、gii.3vp1和gii.6vp1，在表达后同样观察到低产量的vp1蛋白或不可检测量的vp1蛋白(使用sds-page)(表5)。

表5：在植物中产生的几种野生型(天然)诺如病毒株的vp1产量(在粗浸提物中确定)

gi.3vlp和包括修饰后gi.3vp1蛋白的vlp

在84位将谷氨酰胺取代为丝氨酸(q84s)的诺如病毒gi.3vp1构建体产生与野生型gi.3vp1相似的产量，而在94位将丝氨酸取代为亮氨酸(s94l)或具有包含s94l取代的取代组合诺如病毒gi.3vp1构建体展现包括vp1蛋白的vlp的较大产量，与包括野生型gi.3vp1的vlp相比增加1.9至3.8倍(s94l)、增加4.2倍(a43v+s94l)、增加1.8倍(q84s+s94l)以及增加10.2倍(a34v+m57i+q84s+s94l)。此外，在94位将丝氨酸取代为亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸的构建体(gi.3_s94x，其中x＝l、v、i、m、t、e、d、n、q、k或h)展现较大产量，与包括野生型gi.3vp1蛋白的vlp相比为约1.2至约2.75倍(图5f)。

如图5b和5d所示，在94位将丝氨酸取代为亮氨酸(s94l)或具有在84位将谷氨酰胺取代为丝氨酸(q84s)以及在94位将丝氨酸取代为亮氨酸(q84s+s94l)或在57位将蛋氨酸取代为异亮氨酸(m57i+s94l)的组合的诺如病毒gi.3构建体的表达引起与主要分离为较低密度级分(f8至f11；25％至29％碘克沙醇)的包括野生型gi.3vp1的vlp相比，vlp转变到较高密度级分(f2至f6；31％至35％碘克沙醇)。

与野生型gi.3vlp相比，包括具有s94l取代、q84s+s94l组合或m57i+s94l组合的修饰后gi.3vp1的vlp具有较少受损病毒颗粒和较大38nm颗粒比23nm颗粒比例(图5c和5e)。

gi.5vlp和包括修饰后gi.5vp1蛋白的vlp

与表达于植物中的野生型gi.5vp1蛋白的产量相比，在84位将丝氨酸取代为脯氨酸(q84s)、在94位将丙氨酸取代为亮氨酸(a94l)或具有这些取代的组合(q84s+a94l)的诺如病毒gi.5vp1构建体展现vp1蛋白在植物浸提物中的相似产量(图6a)。在梯度纯化、离心和再悬浮后，在94位将丙氨酸取代为亮氨酸(a94l)的诺如病毒gi.5构建体展现更高的产量，与野生型gi.5vp1相比增加1.5倍。

如图6b所示，具有在84位将谷氨酰胺取代为丝氨酸和在94位将丙氨酸取代为亮氨酸的组合(q84s+a94l)的gi.5vp1构建体展现与野生型gi.5vp1(主要在25％至29％碘克沙醇级分中发现)相比转变到更高密度碘克沙醇级分(29％至31％)。与野生型gi.5vlp相比，vlp制剂还包括较少受损病毒颗粒(图6c)。

gi.7vlp和包括修饰后gi.7vp1蛋白的vlp

与野生型gi.7vp1相比，在84位将精氨酸取代为丝氨酸(r84s)、在57位将蛋氨酸取代为异亮氨酸(m57i)或具有这些取代的组合(m57i+r84s)的诺如病毒gi.7vp1构建体在梯度纯化、离心和再悬浮之后展现vp1蛋白产量增加。此外，在57位将蛋氨酸取代为异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸的gi.7构建体(gi.7_m57x，其中x＝i、l、g、s、t、n、q、k或h)展现更高产量，为包括野生型gi.7vp1蛋白的vlp的约1.1至约1.95倍(图6f)。

如图6d所示，具有m57i、r84s或m57i+r84s取代的gi.7vp1构建体产生与野生型gi.7vp1相比展现到更高密度碘克沙醇级分(31％至35％)的转变的vp1蛋白。与野生型gi.7vlp相比，具有m57i、r84s或m57i+r84s取代的gi.7vlp制剂还包括相同或更少的受损病毒颗粒(图6e)。

gii.2vlp和包括修饰后gii.2vp1蛋白的vlp

修饰后诺如病毒vp1蛋白gii.2_a90l和gii.2_e80s+a90l在植物中的表达使得vp1蛋白产量与野生型gii.2vp1的产量相比更高(参见图7a)。

与野生型gii.2vp1相比，在84位将谷氨酸取代为丝氨酸且在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(e84s+a90l)的诺如病毒gii.2vp1构建体、在39位将丙氨酸取代为缬氨酸、在84位将谷氨酸取代为丝氨酸且在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(a39s+e84s+a90l)的诺如病毒gii.2vp1构建体、在53位将精氨酸取代为异亮氨酸、在84位将谷氨酸取代为丝氨酸且在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(r53i+e84s+a90l)的诺如病毒gii.2vp1构建体、在39位将丙氨酸取代为缬氨酸、在53位将精氨酸取代为异亮氨酸、在84位将谷氨酸取代为丝氨酸且在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(a39v+r53i+e84s+a90l)的诺如病毒gii.2vp1构建体都在梯度纯化、离心和再悬浮之后展示vp1蛋白产量增加。

在80位将谷氨酸取代为丝氨酸(e80s)、在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(a90l)或在80位将谷氨酸取代为丝氨酸且在80和90位将丙氨酸取代为亮氨酸(e80s+a90l)的gii.2vp1构建体的表达使得与野生型gii.2类似地产生vlp(图7b)。与野生型gii.2vlp相比，具有e80s+a90l或a39v+e80s+a90l取代的gii.2vlp制剂还包括相同或更少的受损病毒颗粒(图7c)。

gii.3vlp和包括修饰后gii.3vp1蛋白的vlp

与表达于植物中的野生型gii.3vp1蛋白的产量相比，在80位将谷氨酸替换为丝氨酸(e80s)的诺如病毒gii.3vp1构建体展现vp1蛋白在植物浸提物中的相似产量。包括野生型或修饰后vp1蛋白的vlp的产量通常较低。

在80位将谷氨酸取代为丝氨酸(e80s)的gii.3vp1构建体的表达使得与野生型gii.3类似地产生驻留在类似密度碘克沙醇级分(35％)中的vlp(图8b)。

gii.4vlp和包括修饰后gii.4vp1蛋白的vlp

参考图9a、9h和9i，与使用野生型gi.4的vp1产量相比，如下诺如病毒gii.4vp1构建体使得植物浸提之后的vp1蛋白产量更高：在53位将精氨酸取代为异亮氨酸(r53i)；在80位将脯氨酸取代为丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或组氨酸(p80x，其中x＝s、a、n、k或h)；在90位将丝氨酸取代为亮氨酸(s90l)；具有在39位将丙氨酸取代为缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸(a39x，其中x＝v、i、m、t、e、d、n、q、k或h)与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸的组合(a39v+p80s)；具有在53位将精氨酸取代为异亮氨酸与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸的组合(r53i+p80s)；具有在90位将丝氨酸取代为亮氨酸与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸的组合(p80s+s90l)；以及具有35至42位缺失(δ35-42)与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸的组合(δ35-42+p80s)。

对于所测试修饰后gii.4vp1蛋白中的每一个而言，包括各种修饰后gii.4vp1蛋白的vlp产量比包括野生型gii.4vp1蛋白的vlp高。在包括gii.4_a39vvp1的vlp中观察到vlp产量的十倍增加；在包括gii.4_p80x的vlp中观察到vlp产量的约1.4至约2.7倍增加，其中x＝s、a、n、k、h；在包括gii.4_s90lvp1或gii.4_δ35-42+p80svp1的vlp中观察到vlp产量的超过8倍的增加；在包括gii.4_p80s+p90lvp1的vlp中观察到vlp产量的14倍增加；在包括gii.4_a39x+p80svp1(其中x＝v、i、m、t、e、d、n、q、k或h)的vlp中观察到vlp产量的约1.3至约3.4倍增加，在包括gii.4_r53i+p80s的vlp中观察到21倍增加，或在包括gii.4_a39v+p80s+a90lvp1的vlp中观察到38.5倍增加；在包括gii.4_a39v+r53ivp1的vlp中观察到vlp产量的五倍增加；在包括gii.4_v47p+p80svp1的vlp中观察到vlp产量的四倍增加；且在包括gii.4_r53ivp1的vlp中观察到vlp产量的1.5倍增加。

包括修饰后gii.4蛋白的vlp的结果展示于图9b至9d和9g中。包括如下gii.4vp1的构建体使得产生驻留于较高密度碘克沙醇级分(29％至33％)中的vlp：在80位将脯氨酸取代为丝氨酸(p80s；图9b、9c、9d)；在90位将丝氨酸取代为亮氨酸(s90l；图9b)；具有在39位将丙氨酸取代为缬氨酸与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸的组合(a39v+p80s；图9c)；具有在53位将精氨酸取代为异亮氨酸与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸的组合(r53i+p80s；图9d)；具有在80位将脯氨酸取代为丝氨酸与在90位将丝氨酸取代为亮氨酸的组合(p80s+s90l；图9b)；具有在80位将脯氨酸取代为丝氨酸与35至42位缺失的组合(p80s+δ35-42；图9c)；以及具有在39位将丙氨酸取代为缬氨酸与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸并在90位将丝氨酸取代为亮氨酸的组合(gii.4_a39v+p80s+a90l；图9g)。

包括如下gii.4vp1的vlp与野生型gii.4vlp相比具有更少的受损病毒颗粒和/或更高的38nm颗粒比23nm颗粒比：具有p80s取代与s90l取代的组合(p80s+s90l；图9b)；具有a39v取代与p80s取代的组合(a39v+p80s；图9c)；具有p80s取代与35至42位的缺失的组合(δ35-42+p80s；图9c)；具有r53i取代与p80s取代的组合(r53i+p80s；图9d)；以及具有在39位将丙氨酸取代为缬氨酸与在80位将脯氨酸取代为丝氨酸并在90位将丝氨酸取代为亮氨酸的组合(gii.4_a39v+p80s+a90l；图9g)。

gii.6vlp和包括修饰后gii.6vp1蛋白的vlp

在表达gii.6_s90lvp1的植物浸提物中还观察到与野生型相比超过2.2倍的增加的vlp产量(在梯度纯化、离心和再悬浮之后确定)。

gii.12vlp和包括修饰后gii.12vp1蛋白的vlp

修饰后gii.12，例如包括在80位将谷氨酸取代为丝氨酸(e80s)、在90位将精氨酸取代为亮氨酸(a90l)或具有这些取代的组合(e80s+a90l)的gii.12的产量产生与野生型相比约1.2至1.4倍的增加(在梯度纯化、离心和再悬浮之后确定；图11a)。

在80位将谷氨酸取代为丝氨酸(e80s)、在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(a90l)以及具有所述取代的组合(e80s+a90l)的gii.12构建体引起表达与野生型gii.12vp1(31％至33％)相比驻留于更高密度碘克沙醇级分(33％至35％)的gii.12vp1蛋白。

gii.17vlp和包括修饰后gii.17vp1蛋白的vlp

修饰后gii.17，例如包括在39位将丙氨酸取代为缬氨酸(a39v)、在53位将精氨酸取代为异亮氨酸(r53i)或在90位将丙氨酸取代为亮氨酸(a90l)的gii.17的产量产生与野生型相比约1.1至3.4倍的增加(在梯度纯化、离心和再悬浮之后确定)。

在39位将丙氨酸取代为缬氨酸(a39v)、在53位将精氨酸取代为异亮氨酸(r53i)或在90为将丙氨酸取代为亮氨酸(a90l)的gii.17构建体引起表达与野生型gii.12vp1(31％至33％)相比驻留于更高密度碘克沙醇级分(33％至35％)的gii.17vp1蛋白。

总体地，上文所描述的结果表明，来自高密度碘克沙醇梯度级分的蛋白质组分展示，发现诺如病毒vp1蛋白和修饰后诺如病毒vp1蛋白都在植物中自组装成vlp。分离出的包括突变vp1蛋白的vlp展现类似于野生型诺如病毒病毒粒子的结构构造。

实例4：使用vp1的免疫应答

用6至8周大雌性balb/c小鼠(charlesriver实验室)进行对于对诺如病毒天然gi.1(seqidno：1)vlp施用的免疫应答的研究。将三十七只小鼠随机分为针对诺如病毒vlp疫苗的每组八个动物的四个组以及针对安慰剂的每组五个动物的一组。使用肌内免疫接种对所有组进行注射。所有组以两个剂量的方案免疫接种，在第一次免疫接种后3周施行加强免疫接种。

对于在后腿进行的肌内施用，用来自诺如病毒gi.1基因型疫苗的植物产生vlp天然vp1(1或10μg)对两组(八只动物)未麻醉的小鼠进行免疫接种。使用与利用疫苗缓冲液(pbs，ph6.0)的候选疫苗相同的途径和方案对安慰剂组(五只动物)进行免疫接种。

为了测量辅助剂的潜在益处，通过用1或10μg植物产生vlp诺如病毒疫苗加上一体积的alhydrogel2％(明矾，加拿大安大略省伯灵顿市cedarlanelaboratoriesltd.)在后腿对未麻醉的小鼠进行肌内施用来对两组动物(8只动物)进行免疫接种。根据初免-加免方案对所有组进行免疫接种，在第一次免疫接种后三周进行加强免疫接种。

如下在存活周期期间通过临床观察评估小鼠：每日监控死亡率和临床症状，每周详细检查，进行注射部位观察，以及进行体重测量。观察所有动物，并且在第42天安乐死以进行大体检查。在第0天投药之前、在第21天和第42天(每次免疫接种后21天)从所有动物采集血液。处理样本以分离血清以供进行特异性抗体应答分析。

使用gi.1vlp涂布培养板，针对gi.1vlp特异性总igg和iga抗体，通过elisa分别分析来自在第21天和第42天从所有动物采集的血液的血清样本。汇集处理组的所有动物采集的免疫前血清样本(第0天-给药前)，并且分析每一个集合体以确保其为阴性的(或低于分析试验的临界值)。

使用graphpadprism软件(第6.05版；美国加利福利亚州拉荷亚graphpadsoftware公司)进行描述性统计。以具有95％置信区间(ci)的几何平均滴度(gmt)形式报告每个组所测量的抗体滴度。检测限度的值的一半是归因于抗体滴度低于针对所测试抗体的方法的检测限度。因此，在这个研究中，如果动物针对特定条件的gmt值等于或高于方法的检测限度(loq＝100)，那么认为所述动物为积极应答者。使用单向anova，接着使用针对log10转换数据的图基检验(tukey’stest)进行处理组的igg滴度之间的统计比较。还可以使用单向anova，接着使用针对log10转换数据的事后邓尼特检验(posthocdunnett’stest)来进行安慰剂组与每个处理组之间的比较。

在用一个剂量(第21天)和两个剂量(第42天)的1μg或10μg各制剂进行im免疫接种之后，在来自所有动物的血清样本中测量gi.1vlp特异性总igg滴度。使用涂布gi.1vlp的培养板通过elisa测量总igg滴度(loq＝100)。结果呈现于图3d中。由具有95％置信区间的几何平均滴度(gmt)表示每个处理组(n＝8个动物/组)的总igg滴度。使用单向anova，接着使用针对log10转换数据的图基检验(tukey’stest)进行处理组的igg滴度之间的统计比较。还可以使用单向anova，接着使用针对log10转换数据的事后邓尼特检验来进行安慰剂组与每个处理组之间的比较。显著差异在图3d中以字母形式标注(相同字母指示处理组之间未检测到显著差异；p＞0.05)。

以类似方式，可在这个实例中所述的相同流程之后向小鼠施用本文所描述的植物产生修饰后vp1蛋白，所述修饰后vp1蛋白包含：例如使用gi.3_q84s(构建体4140；seqidno：167)、gi.3_s94l(构建体4141；seqidno：9)、gi.3_a43v+s94l(构建体4179；seqidno：169)、gi.3_m57i+s94l(构建体4180；seqidno：171)、gi.3_p84s+s94l(构建体4142；seqidno：11)、gi.3_a43v+m57i+s94l(构建体4181；seqidno：173)、gi.5_q84s(构建体4130；seqidno：35)、gi.5_a94l(构建体4131；seqidno：37)、gi.5_q84s+a94l(构建体4132；seqidno：39)、gi.7_r84s(构建体4210；seqidno：176)、gi.7_m57i(构建体4217；seqidno：178)、gi.7_m57i+r84s(构建体4218；seqidno：180)、gii.2_e80s(构建体4143；seqidno：86)、gii.2_a90l(构建体4144；seqidno：42)、gii.2_e80s+a90l(构建体4145；seqidno：44)、gii.2_a39v+e80s+a90l(构建体4182；seqidno：183)、gii.2_r53i+e80s+a90l(构建体4183；seqidno：185)、gii.2_a39v+r53i+e80s+a90l(构建体4184；seqidno：187)、gii.3_e80s(构建体4146；seqidno：47)、gii.3_a90l(构建体4147；seqidno：49)、gii.3_e80s+a90l(构建体4148；seqidno：51)、gii.4_a39v(构建体4155；seqidno：54)、gii.4_v47p(构建体4156；seqidno：56)、gii.4_r53i(构建体4157；seqidno：58)、gii.4_p80s(构建体4133；seqidno：60)、gii.4_s90l(构建体4134；seqidno：62)、gii.4_δ35-42(构建体4158；seqidno：64)、gii.4_sstavata(构建体4159；seqidno：66)、gii.4_a39v+r53i(构建体4185；seqidno：189)、gii.4_a39v+p80s(构建体4165；seqidno：68)、gii.4_v47p+p80s(构建体4166；seqidno：70)、gii.4_r53i+p80s(构建体4167；seqidno：72)、gii.4_p80s+s90l(构建体4135；seqidno：74)、gii.4_δ35-42+p80s(构建体4168；seqidno：76)、gii.4_p80s+sstavata(构建体4169；seqidno：78)、gii.4_a39v+r53i+p80s(构建体4186；seqidno：191)、gii.6_e80s(构建体4149；seqidno：80)、gii.6_s90l(构建体4150；seqidno：82)、gii.6_e80s+s90l(构建体4151；seqidno：84)、gii.12_e80s(构建体4136；seqidno：89)、gii.12_a90l(构建体4137；seqidno：91)、gii.12_e80s+a90l(构建体4138；seqidno：93)、gii.17_a39v(构建体4234；seqidno：193)、gii.17_r53i(构建体4235；seqidno：195)、gii.17_a90l(构建体4232；seqidno：197)、gii.17_a39v+r53i(构建体4236；seqidno：199)、gii.17_e80s+a90l(构建体4233；seqidno：201)或其组合产生的vp1蛋白。

小鼠对诺如病毒天然vp1vlp的免疫应答

如图3d中所展示，用来自gi.1基因型的植物产生诺如病毒天然vp1vlp免疫接种的小鼠在血清中显示gi.1vlp特异性igg抗体滴度，并且在第21天和第42天对每个处理组的小鼠进行检测。在第21天和第42天由每一次处理诱导的igg滴度水平在统计学上高于针对安慰剂组定量的滴度(p＜0.05)。每天，igg滴度水平以剂量依赖方式提高，由在调配有alhydrogel或无alhydrogel的1μg与10μg处理之间检测到明显差异(p＜0.05)证实，并且添加alhydrogel到novvlp疫苗显著增强了在1μg和10μg的剂量下的所诱导免疫应答(p＜0.05)。针对每一个处理组，还在第21天与第42天之间检测到igg滴度水平的明显提高(p＜0.05)。这些结果共同证实植物产生的诺如病毒天然vp1vlp在小鼠中引发稳固免疫应答的能力。

在与这个实例中所描述的相同流程之后施用包括修饰后vp1蛋白的vlp也可观察到相似结果，所述修饰后vp1蛋白包含：例如使用gi.3_q84s(构建体4140；seqidno：167)、gi.3_s94l(构建体4141；seqidno：9)、gi.3_a43v+s94l(构建体4179；seqidno：169)、gi.3_m57i+s94l(构建体4180；seqidno：171)、gi.3_p84s+s94l(构建体4142；seqidno：11)、gi.3_a43v+m57i+s94l(构建体4181；seqidno：173)、gi.5_q84s(构建体4130；seqidno：35)、gi.5_a94l(构建体4131；seqidno：37)、gi.5_q84s+a94l(构建体4132；seqidno：39)、gi.7_r84s(构建体4210；seqidno：176)、gi.7_m57i(构建体4217；seqidno：178)、gi.7_m57i+r84s(构建体4218；seqidno：180)、gii.2_e80s(构建体4143；seqidno：86)、gii.2_a90l(构建体4144；seqidno：42)、gii.2_e80s+a90l(构建体4145；seqidno：44)、gii.2_a39v+e80s+a90l(构建体4182；seqidno：183)、gii.2_r53i+e80s+a90l(构建体4183；seqidno：185)、gii.2_a39v+r53i+e80s+a90l(构建体4184；seqidno：187)、gii.3_e80s(构建体4146；seqidno：47)、gii.3_a90l(构建体4147；seqidno：49)、gii.3_e80s+a90l(构建体4148；seqidno：51)、gii.4_a39v(构建体4155；seqidno：54)、gii.4_v47p(构建体4156；seqidno：56)、gii.4_r53i(构建体4157；seqidno：58)、gii.4_p80s(构建体4133；seqidno：60)、gii.4_s90l(构建体4134；seqidno：62)、gii.4_δ35-42(构建体4158；seqidno：64)、gii.4_sstavata(构建体4159；seqidno：66)、gii.4_a39v+r53i(构建体4185；seqidno：189)、gii.4_a39v+p80s(构建体4165；seqidno：68)、gii.4_v47p+p80s(构建体4166；seqidno：70)、gii.4_r53i+p80s(构建体4167；seqidno：72)、gii.4_p80s+s90l(构建体4135；seqidno：74)、gii.4_δ35-42+p80s(构建体4168；seqidno：76)、gii.4_p80s+sstavata(构建体4169；seqidno：78)、gii.4_a39v+r53i+p80s(构建体4186；seqidno：191)、gii.6_e80s(构建体4149；seqidno：80)、gii.6_s90l(构建体4150；seqidno：82)、gii.6_e80s+s90l(构建体4151；seqidno：84)、gii.12_e80s(构建体4136；seqidno：89)、gii.12_a90l(构建体4137；seqidno：91)、gii.12_e80s+a90l(构建体4138；seqidno：93)、gii.17_a39v(构建体4234；seqidno：193)、gii.17_r53i(构建体4235；seqidno：195)、gii.17_a90l(构建体4232；seqidno：197)、gii.17_a39v+r53i(构建体4236；seqidno：199)、gii.17_e80s+a90l(构建体4233；seqidno：201)或其组合产生的vp1蛋白。

所有引文在此以引用方式并入。

本发明已关于一个或多个实施例进行了描述。但显而易见的是，本领域技术人员将可对所描述主题做出许多变化和修改。权利要求的范围不应受实例中所述的优选实施例限制，而是应总体地按照说明书以最宽泛的方式来解读。