活性型GcMAF的制备方法与流程

本发明涉及活性型gcmaf的制备方法。
背景技术：
：维生素d结合蛋白质(vdbp；vitamindbindingprotein)是在肝脏中合成并分泌到血液中的糖蛋白质之一。vdbp与维生素d结合，承担着作为血液中的移送载体的功能。另外，还已知具有与从破坏的细胞中漏出的g-肌动蛋白结合而抑制肌动蛋白聚合物使血管腔变窄而堵塞血管腔的功能。上述vdbp也被称为gc球蛋白，存在一部分的氨基酸不同而糖链结构不同的三种亚型(vdbp1f、vdbp1s、vdbp2)。其中，在vdbp1f(gc1f)中，在第418(420)个苏氨酸上结合有由在n-乙酰半乳糖胺(galnac)上结合唾液酸和半乳糖而成的三糖构成的o型糖链。结合有由该三糖构成的o型糖链的vdbp是不具有激活巨噬细胞的功能的非活性型，但是若通过在t细胞以及b细胞各自的细胞表面上表达的唾液酸酶以及β半乳糖苷酶的作用去除唾液酸和半乳糖而仅残留galnac-o-t418(420)，则成为作为活性型的gc蛋白衍生的巨噬细胞活化因子(gcprotein-derivedmacrophageactivatingfactor，gcmaf，以下有时也表述为“活性型gcmaf”)。)，能够激活巨噬细胞(参照非专利文献1以及非专利文献2)。还已知作为该活性型的gcmaf不仅能激活巨噬细胞，还表现出经由血管新生抑制作用的抗肿瘤活性(参照专利文献1)。另一方面，如图1示意性地表示的那样，从非活性型的vdbp向作为活性型的gcmaf的转换工序复杂，在其制备方法中，一般是从血清、血浆中纯化作为非活性型的vdbp并利用唾液酸酶、β半乳糖苷酶进行处理而去除唾液酸和半乳糖从而形成仅残留有galnac的作为活性型的gcmaf的方法。但是，这样的以往的方法需要从血清、血浆中纯化非活性型的vdbp的工序、对所得到的vdbp进行酶处理的工序等复杂的多个工序，因此要求更简便且容易的制备方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2003-532682号公报非专利文献非专利文献1：proc.natl.acad.sci.usa1991,88,8539-8543非专利文献2：anticancerresearch,2005.25,3689-3696技术实现要素：发明所要解决的问题在这样的状况下，本发明的目的在于提供一种更简便且收率高的活性型gcmaf的制备方法。用于解决问题的手段本发明的发明人为了解决上述问题进行了深入研究的结果是，发现通过在无血清培养基中对导入非活性型vdbp的表达载体后的宿主细胞进行培养，即使不经过用于切断糖链的酶处理工序，也能够高效地制备在第418(420)个苏氨酸(thr)上仅结合有galnac的活性型gcmaf，从而完成了本发明。即，本发明的主旨如下所述。[1]一种活性型gcmaf的制备方法，其是活性型的gc蛋白衍生的巨噬细胞活化因子的制备方法，其中，所述制备方法包括在无血清培养基中对导入维生素d结合蛋白质表达载体后的宿主细胞进行培养的工序。[2]根据[1]所述的活性型gcmaf的制备方法，其中，所述培养为浮游培养。[3]根据[1]或[2]所述的活性型gcmaf的制备方法，其中，所述制备方法不包括用于切断糖链的酶处理工序。[4]根据[1]至[3]中任一项所述的活性型gcmaf的制备方法，其中，所述制备方法包括利用维生素d亲和柱的纯化工序。发明效果根据本发明的活性型gcmaf的制备方法，通过采用使培养细胞表达vdbp的方法，不需要收集血清、血浆等，也容易进行大量制备。另外，也不需要从血清、血浆等中纯化vdbp的工序，进一步地也不需要用于切断糖链的酶处理工序，因此能够以较少的步骤高效且简便地制备活性型gcmaf。根据本发明，由于能够容易地大量生产迄今为止难以大量生产的活性型gcmaf，因此能够适宜地使用于以活性型gcmaf为有效成分的医药品、健康食品等领域。附图说明图1是示意性地表示从非活性型的vdbp向活性型gcmaf的转换工序的图。图2是表示使用本发明的方法(cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型gcmaf的免疫印迹的结果的图。图3是表示使用本发明的方法(cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型gcmaf(维生素d亲和柱纯化后)的sds-page(cbb染色)和免疫印迹的结果的图。图4是表示对活性型gcmaf合成中的galant3(n-乙酰半乳糖胺基转移酶3，n-acetylgalactosaminyltransferase3)表达的影响进行研究的结果的图。图5是表示使用本发明的方法(cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型gcmaf的巨噬细胞激活能力的图。图6是表示使用本发明的方法(cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型gcmaf的免疫印迹的结果的图。图7是表示使用本发明的方法(hek293细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型gcmaf的免疫印迹的结果的图。图8是表示使用本发明的方法(cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型gcmaf(维生素d亲和柱纯化后)的sds-page(cbb染色)的结果的图。具体实施方式以下，对本发明的活性型gcmaf的制备方法进行详细说明。此外，在本说明书中，dna、载体的制备等的分子生物学方法，只要没有特别说明，可以通过本领域技术人员公知的一般实验书籍中记载的方法或以其为基准的方法来进行。另外，在本说明书中使用的术语，只要没有特别提及，则以在该
技术领域：
中通常使用的意思来进行解释。<活性型gcmaf的制备方法>本发明的活性型gcmaf的制备方法的特征在于，包括在无血清培养基中对导入vdbp表达载体后的细胞进行培养的工序，不需要用于切断非活性型vdbp的糖链的酶处理工序。本发明的活性型gcmaf的制备方法不是从血浆、血清中对gc球蛋白进行纯化来制备活性型gcmaf，而是通过在无血清培养基中对导入vdbp表达载体后的细胞进行培养，不需要多个工序就能够简便地制备活性型gcmaf的方法。在本发明中，vdbp为维生素d结合蛋白质(vdbp；vitamindbindingprotein)，也被称为gc球蛋白、gc蛋白质，包括糖链结构不同的三种亚型(1f、1s、2)。在vdbp中的任一种亚型中，均具有在作为糖链的中心的n-乙酰半乳糖胺上o-糖苷与半乳糖结合的共通的结构。在1f型亚型中，以o型链结合有在galnac上结合半乳糖和唾液酸而成的三糖(参照图1)，在1s型亚型中，以o型链结合有在galnac上结合半乳糖和α-甘露糖而成的三糖，在2型亚型中，以o型链结合有在galnac上结合半乳糖而成的二糖，上述vdbp包含在本发明中。另外，本发明中的vdbp来源于动物，优选为来源于哺乳类，例如可列举为来源于人、马、牛、羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠等的vdbp，其中更优选为来源于人的vdbp。本发明中的vdbp表达载体是将使用基因重组技术人工地对vdbp进行编码的核酸组入到适当的表达载体中的载体。根据本发明的活性型gcmaf的制备方法，通过使上述表达载体在适当的宿主细胞中表达，并在适当的培养条件下进行培养，可以不进行用于切断作为非活性型的vdbp的糖链的酶处理而高效地制备活性型gcmaf。此外，vdbp的氨基酸序列、核酸序列是公知的，可以利用在genbank等数据库中登记的序列信息。作为本发明中的vdbp表达载体，可以是组入有对vdbp1f、vdbp1s、vdbp2中的任一种亚型进行编码的核酸的表达载体，其中，优选为组入有对vdbp1f进行编码的核酸的vdbp1f表达载体以及组入有对vdbp1s进行编码的核酸的vdbp1s表达载体，更优选为vdbp1f表达载体。将对vdbp1f、vdbp1s、vdbp2进行编码的核酸的序列分别作为序列编号1、序列编号2、序列编号3记载在序列表中。另外，将vdbp1f、vdbp1s、vdbp2各自的氨基酸序列记载为序列编号4、序列编号5、序列编号6。进一步地，作为组入vdbp表达载体中的核酸序列，优选为对翻译活性进行了优化的序列，将vdbp1f的优化核酸序列记载为序列编号7，将与该序列对应的氨基酸序列记载为序列编号8。将vdbp1s的优化核酸序列记载为序列编号10，将与该序列对应的氨基酸序列记载为序列编号11。将vdbp2的优化核酸序列记载为序列编号12，将与该序列对应的氨基酸序列记载为序列编号13。另外，将赋予了his标签的vdbp1f的优化核酸序列记载为序列编号9，将赋予了his标签的vdbp1s的优化核酸序列记载为序列编号14，将赋予了his标签的vdbp2的优化核酸序列记载为序列编号15。本发明中的vdbp表达载体为了容易从表达的细胞的培养液中回收vdbp，也可以进一步含有his标签、ha标签、flaf标签等标签序列。例如，作为优选的例子，可列举为在人gcmaf的亚型gc1f或gc1s的序列上连结有his-tag(组氨酸标签)的hsgcmaf-gc1f-histag的序列(序列编号9)或hsgcmaf-gc1s-histag的序列(序列编号14)等。vdbp表达载体，可以通过本领域技术人员以往公知的方法来构建并在适当的宿主细胞中表达，具体的方法没有特别限定。另外，组入vdbp表达载体的宿主细胞只要是能够高效地表达vdbp的细胞即可，没有特别限定，例如可列举为cho细胞、hek293细胞等，其中优选为cho细胞。特别优选为expicho(商标)(gibco(商标))细胞。在本发明中，在无血清培养基中对导入vdbp表达载体后的细胞进行培养。作为上述无血清培养基，只要是不含有血清的培养基即可，没有特别限定，例如可列举为imdm培养基、medium199培养基、eagle’sminimumessentialmedium(emem)培养基、αmem培养基、dulbecco’smodifiedeagle’smedium(dmem)培养基、ham’sf12培养基、rpmi1640培养基、fischer’s培养基、mcdb201培养基、expicho(商标)expressionmedium(gibco(商标))以及它们的混合培养基等。其中，优选为expicho(商标)expressionmedium(gibco(商标))。在上述无血清培养基中，可以根据需要作为血清替代物而添加白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫醇甘油等的一个以上的血清替代物。在上述培养基中，还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。在本发明中，作为对导入vdbp表达载体后的细胞进行培养的方法，优选为在上述无血清培养基中，在37℃、8％co2、120rpm的条件下对导入vdbp表达载体后的细胞进行浮游培养。此时的细胞浓度为1×103细胞/ml～1×107细胞/ml，优选为1×104细胞/ml～1×106细胞/ml，更优选为1×105细胞/ml～1×106细胞/ml。培养天数为2天～14天，优选为3天～10天，更优选5天～8天。该培养天数可以一边观察细胞的成活率一边适当进行调节。通过在这样的条件下对导入vdbp表达载体后的细胞进行培养，在培养液中，尽管没有进行酶处理，也能够得到将需要脱糖的糖链切断的活性型gcmaf。本发明的活性型gcmaf的制备方法的主要特征之一在于，不需要用于切断糖链的酶处理工序。作为从上述得到的培养液中回收活性型gcmaf的方法，可以采用通过利用了能够特异性回收具有上述his标签等标签的蛋白质的树脂的亲和柱而进行回收的方法。例如，在回收his标签蛋白质的情况下，可以利用配位结合有镍离子的金属螯合亲和柱进行高纯度地纯化。在与柱结合之后，通过添加咪唑等，使his标签从镍柱中解离，从而能够使具有his标签的活性型gcmaf溶出。作为从上述得到的培养液中回收活性型gcmaf的其他方法，可列举为使用维生素d亲和柱(也称为“vit.d亲和柱”。)、例如25(oh)d3sepharosecl-6b柱的方法。即，将上述得到的培养液添加在hiprepsephacryls300柱中，并将所得到的样品添加在vit.d亲和柱(25(oh)d3sepharosecl-6b)中对vdbp进行纯化。作为结合缓冲液，可以使用50mm的tris-hcl、15mm的edta、150mm的nacl、0.1％的tritonx100(ph为7.4)，作为溶出缓冲液，可以使用6m的盐酸胍。若对所得到的样品通过10mm的磷酸钠进行透析之后进行sds-page、cbb染色，可以确认vdbp被纯化为单一条带。根据该方法，还能够分离60kda附近的污染蛋白。通过本发明的方法得到的活性型gcmaf具有激活巨噬细胞的功能。在此，激活巨噬细胞的功能是指促进巨噬细胞的吞噬能力、尤其是经由fc受体的吞噬能力、活性氧产生能力、抗原呈递能力等的功能。为了对通过本发明的方法得到的活性型gcmaf进行评价，例如可以通过利用活性型gcmaf对小鼠等的巨噬细胞进行处理，确认经由fc受体的对srbc(羊红细胞)进行吞噬的能力以何种程度提高来进行评价。具体而言，可以使用在实施例的项目4中详细说明的实验方法。实施例通过以下的实施例对本发明具体地进行说明，但本发明不限于实施例。1、使用cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统的活性型gcmaf的一步法合成方法向expicho(商标)(gibco(商标))细胞中导入人vdbp1f表达载体(在pcdna3.4-topo(thermofisherscientific)的cmv启动子的下游结合有hsgcmaf-gclf-histag的载体；以下，也称为hsgcmaf-gc1f-histag载体)和galant3基因表达载体(16acjomp_galnt3_pcdna3.4-topo；invitrogen)，使用无血清培养基(expicho(商标)表达培养基，gibco(商标))以浮游系统进行培养。培养方法依据gibco(商标)expicho(商标)表达系统的操作流程，hsgcmaf-gc1f-histag载体量(μg)、galant3基因表达载体量(μg)、培养物体积(ml)如下述表1所示。表1hsgcmaf-gc1f-histag(μg)galant3(μg)培养物体积(ml)条件115230条件220225培养8天后，将细胞上清液添加到his-trap柱(gehealthcare公司制造)中，分离所捕获的蛋白质，使用50mm的磷酸钠(ph为7.0)缓冲液进行透析。通过sds-page对透析后的样品进行分离，将蛋白质转移至膜中，使用抗his抗体或抗dvbp抗体进行免疫印迹(westernblot)(图2中的a)。进一步地，对由条件1、条件2得到的5μg的vdbp进行1mu唾液酸酶(神经氨酸酶，neuraminidase)以及1mu半乳糖苷酶(β-d-galactosidase)处理(37℃，3h)。将上述酶处理样品和未经酶处理样品分开，添加到sds-page中，通过与galnac发生反应的凝集素印迹(生物素标记的hpa凝集素；生物素结合的hpa凝集素(biotinconjugatedhpalectin))对糖链结构进行分析。其结果是，由于上述未经酶处理的样品也与hpa凝集素发生反应，因此表明若使用本发明的无血清培养基/浮游系培养系统，则即使不进行上述酶处理，也能够得到活性型gcmaf。进一步地，由于即使进行酶处理与hpa凝集素发生反应的vdbp量也不会增加，因此表明若使用本发明的无血清培养基/浮游系培养系统，则能够得到几乎全部的vdbp作为活性型gcmaf(图2中的b)。在通过sds-page对上述vdbp样品进行分离并通过cbb进行染色时，确认到53kda附近的清晰的vdbp条带和60kda附近的条带。因此，为了将53kda附近的vdbp与60kda附近的条带分离，添加到hiprepsephacryls300柱中，并将所得到的样品添加在vit.d亲和柱(25(oh)d3sepharosecl-6b)中对vdbp进行纯化。作为结合缓冲液，使用50mm的tris-hcl、15mm的edta、150mm的nacl、0.1％的triton(注册商标)x100(ph为7.4)，作为溶出缓冲液，使用6m的盐酸胍。对所得到的样品通过10mm的磷酸钠进行透析之后进行sds-page并进行cbb染色。表明通过vit.d亲和柱纯化，vdbp被纯化为单一条带，即，能够与60kda附近的条带分离(图3中的a)。另外，通过免疫印迹，由抗vdbp抗体识别(图3中的b)。如上所述，可知若使用cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统合成vdbp，则能够以一步法合成活性型gcmaf，但同时存在60kda左右的污染蛋白。而且，确认到gcmaf和60kda的污染蛋白可以通过vit.d亲和柱分离纯化。该结果表示，若使用本发明的cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统合成vdbp，则能够以一步法合成仅结合有galnac的活性型gcmaf。另外，能够通过vit.d亲和柱高效地与60kda左右的污染蛋白分离。进一步地，根据本发明的方法，gcmaf的表达水平也较高(3-5mg/20ml培养物)，本发明的方法在目前已知的范围内可以说是最佳的活性型gcmaf的一步法合成法。2、对gcmaf合成施加的galant3表达诱导的研究对galnac与vdbp的第418/420个苏氨酸结合的效率是否受galant3等糖链加成酶的共表达影响进行分析。向expicho(商标)(gibco(商标))细胞中导入人vdbp1f表达载体和galant3基因表达载体，使用无血清培养基(expicho(商标)表达培养基，gibco(商标))以浮游系统进行培养。培养方法依据gibco(商标)expicho(商标)表达系统的操作流程，hsgcmaf-gc1f-histag载体量(μg)、galant3基因表达载体量(μg)、培养物体积(ml)如下述表2所示。表2hsgcmaf-gc1f-histag(μg)galant3(μg)培养物体积(ml)条件1201025条件220425条件320025培养7天后(37℃，8％co2，120rpm)，将细胞上清液添加到his-trap柱(gehealthcare公司制造)中，分离所捕获的蛋白质，使用50mm的磷酸钠(ph为7.0)缓冲液进行透析。通过sds-page对所得到的样品进行分离，将蛋白质转移至膜中，使用抗vdbp抗体进行免疫印迹(westernblot)(图4中的a)。进一步地，通过与galnac发生反应的生物素标记的hpa凝集素(biotinconjugatedhpalectin)对糖链结构进行分析(图4中的b)。由于即便在没有galant3的条件(条件3)下，也与hpa凝集素发生反应，因此表明galant3的共表达对vdbp的表达量、galnac加成效率不产生影响。该结果显示，糖链加成酶galant3的共表达对vdbp的表达量、galnac加成效率不产生影响。可考虑到在cho细胞中糖链加成酶原本就表达出充分的量的可能性。即，也可以说，在使用本发明的cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统的活性型gcmaf的一步法合成法中，expicho(商标)(gibco(商标))细胞中的galant3的共表达不是必须的。3、通过本发明的活性型gcmaf的一步法合成法得到的活性型gcmaf的巨噬细胞吞噬能力活性的测定从日本slc购入7周龄的icr小鼠(雌性)。颈椎脱位后剥离外皮，向icr小鼠的腹腔中注入5ml的冷dpbs，揉捏腹部，取出含有腹腔细胞的腹腔液。将腹腔液以4℃、1,000rpm离心15分钟后，去除上清液，加入适量的rpmi1640培养基(thermoficherscientific)，进行台盼蓝染色，对细胞数进行计数。在rpmi1640培养基中调整为1.0×106细胞/ml，在预先浸没有盖玻片的板上以5.0×105细胞/孔的方式各播种500μl。进一步地，加入500μl的rpmi1640培养基，以37.5℃预培养1小时，使巨噬细胞固定在盖玻片上。去除上清液，对附着的巨噬细胞层进行洗涤，加入rpmi1640培养基，以37℃培养过夜。去除上清液，加入990μl的rpmi1640培养基，添加1ng上述纯化得到的活性型gcmaf(10μl，最终浓度为1ng/ml)，作为阳性对照加入1μg的脂多糖(lps，sigma公司)(10μl，最终浓度为1μg/ml)，在37℃、5％co2的条件下培养3小时。去除上清液，使抗绵羊红细胞基质抗体(abcam公司，ab50674)反应，加入通过igg调理素化后的0.5％srbc(cedarlane公司，cld68)，使巨噬细胞吞噬90分钟。将盖玻片从孔中取出，在室温下干燥，通过甲醇使巨噬细胞固定。用干燥机干燥后，利用以dpbs稀释20倍后的吉姆萨染色液染色1小时。用自来水对盖玻片进行洗涤之后，在室温下干燥过夜。将盖玻片粘贴在载玻片上，进行显微镜观察(400倍)。对被吞噬的srbc进行计数，通过下式计算吞噬指数(ingestionindex)而对巨噬细胞的吞噬活性进行评价。将结果示于图5。[数1]如图5所示，可知通过本发明的cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统得到的gcmaf具有促进巨噬细胞的吞噬能力的效果(巨噬细胞激活效果)。另外，通过本发明的cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统得到的gcmaf以1ng/ml这样的低剂量，起到了与作为阳性对照使用的lps的1μg/ml相当的巨噬细胞激活效果。因而，可以说，根据本发明的方法，能够高效地获得比活性较高的活性型gcmaf。4、使用cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统的活性型gcmaf亚型(1f、1s、2型)的一步法合成方法向expicho(商标)(gibco(商标))细胞中导入人vdbp1f、vdbp1s或vdbp2表达载体，使用无血清培养基(expicho(商标)表达培养基，gibco(商标))以浮游系统进行培养。培养方法依据gibco(商标)expicho(商标)表达系统的操作流程，使用15μg的hsgcmaf-gc1s或hsgcmaf-gc2-histag。培养8天后，将细胞上清液添加到his-trap柱(gehealthcare公司制造)中，分离所捕获的蛋白质，使用50mm的磷酸钠(ph为7.0)缓冲液进行透析。通过sds-page对透析后的样品进行分离。对5μg的vdbp进行1mu唾液酸酶(neuraminidase)以及1mu半乳糖苷酶(β-d-galactosidase)处理(37℃，3h)。将上述酶处理样品和未经酶处理样品分开，添加到sds-page中，通过与抗vdbp抗体、galnac发生反应的凝集素印迹(生物素标记的hpa凝集素；biotinconjugatedhpalectin)对糖链结构进行分析。此外，1f型使用通过“2、使用cho细胞/无血清培养基/浮游系培养系统的活性型gcmaf的一步法合成方法”中记载的方法进行合成，并使用了经vit.d亲和柱(25(oh)d3sepharosecl-6b)处理后的样品。其结果是，在1s型、1f型中未经酶处理的样品也与hpa凝集素发生反应，因此表明若使用本发明的无血清培养基/浮游系培养系统，则即使不进行上述酶处理，也能够得到活性型gcmaf。进一步地，由于即使进行酶处理与hpa凝集素发生反应的vdbp量也不会增加，因此表明若使用本发明的无血清培养基/浮游系培养系统，则能够得到几乎全部的vdbp作为活性型gcmaf(图6)。另外，将上述透析后的vdbp样品添加在hiprepsephacryls300柱中，并将所得到的样品添加在vit.d亲和柱(25(oh)d3sepharosecl-6b)中对vdbp进行纯化。作为结合缓冲液，使用50mm的tris-hcl、15mm的edta、150mm的nacl、0.1％的triton(注册商标)x100(ph为7.4)，作为溶出缓冲液，使用6m的盐酸胍。对所得到的样品通过10mm的磷酸钠进行透析之后进行sds-page、cbb染色，表明通过vit.d亲和柱纯化vdbp被纯化为单一条带，即，表明能够与60kda附近的条带分离(图8)。5、使用hek293/无血清培养基/浮系培养系统的活性型gcmaf的一步法合成方法向expi293(商标)(gibco(商标))细胞中导入人vdbp1f表达载体，使用无血清培养基(expicho(商标)表达培养基，gibco(商标))以浮游系统进行培养。培养方法依据gibco(商标)expi293表达系统的操作流程，使用20μg的vdbp1f表达载体(hsgcmaf-gc1f-histag载体)。培养8天后，将细胞上清液添加到his-trap柱(gehealthcare公司制造)中，分离所捕获的蛋白质，使用50mm的磷酸钠(ph为7.0)缓冲液进行透析。对5μg的vdbp进行1mu唾液酸酶(neuraminidase)以及1mu半乳糖苷酶(β-d-galactosidase)处理(37℃，3h)。将上述酶处理样品和未经酶处理样品分开，添加到sds-page中，通过与galnac发生反应的凝集素印迹(生物素标记的hpa凝集素；biotinconjugatedhpalectin)对糖链结构进行分析。其结果是，由于未经酶处理的样品也与hpa凝集素发生反应，因此表明在将hek293细胞作为宿主细胞的情况下，也与cho细胞的情况下相同，即使不进行上述酶处理，也能够得到活性型gcmaf(图7)。如上所述，可知根据本发明的使用宿主细胞/无血清培养基/浮游系培养系统的活性型gcmaf的制备方法，不需要用于切断糖链的酶处理工序，能够通过一步法高效地合成活性型gcmaf。产业上的可利用性根据本发明的活性型gcmaf的制备方法，通过采用使培养细胞表达vdbp的方法，不需要收集血清、血浆等，也容易进行大量制备。另外，也不需要从血清、血浆等中纯化vdbp的工序，进一步地也不需要用于切断糖链的酶处理工序，因此能够以较少的步骤高效且简便地制备活性型gcmaf。根据本发明，由于能够容易地大量生产迄今为止难以大量生产的活性型gcmaf，因此能够适宜地使用于以活性型gcmaf为有效成分的医药品、健康食品等中。序列表<110>锅岛阳一（nabeshima,yoichi）<120>活性型gcmaf的制备方法<130>yu2068103jpp<150>jp2017-241109<151>2017-12-15<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1425<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1atgaagagggtcctggtactactgcttgctgtggcatttggacatgctttagagagaggc60cgggattatgaaaagaataaagtctgcaaggaattctcccatctgggaaaggaggacttc120acatctctgtcactagtcctgtacagtagaaaatttcccagtggcacgtttgaacaggtc180agccaacttgtgaaggaagttgtctccttgaccgaagcctgctgtgcggaaggggctgac240cctgactgctatgacaccaggacctcagcactgtctgccaagtcctgtgaaagtaattct300ccattccccgttcacccaggcactgctgagtgctgcaccaaagagggcctggaacgaaag360ctctgcatggctgctctgaaacaccagccacaggaattccctacctacgtggaacccaca420aatgatgaaatctgtgaggcgttcaggaaagatccaaaggaatatgctaatcaatttatg480tgggaatattccactaattacgaacaagctcctctgtcacttttagtcagttacaccaag540agttatctttctatggtagggtcctgctgtacctctgcaagcccaactgtatgctttttg600aaagagagactccagcttaaacatttatcacttctcaccactctgtcaaatagagtctgc660tcacaatatgctgcttatggggagaagaaatcaaggctcagcaatctcataaagttagcc720caaaaagtgcctactgctgatctggaggatgttttgccactagctgaagatattactaac780atcctctccaaatgctgtgagtctgcctctgaagattgcatggccaaagagctgcctgaa840cacacagtaaaactctgtgacaatttatccacaaagaattctaagtttgaagactgttgt900caagaaaaaacagccatggacgtttttgtgtgcacttacttcatgccagctgcccaactc960cccgagcttccagatgtaagattgcccacaaacaaagatgtgtgtgatccaggaaacacc1020aaagtcatggataagtatacatttgaactaagcagaaggactcatcttccggaagtattc1080ctcagtaaggtacttg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