一种含有总黄酮的护肝保健分子酒及其制备方法与流程

本发明属于保健分子酒领域，具体涉及一种含有黄酮成分的护肝保健分子酒。

背景技术：

黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有c6-c3-c6为骨架，属植物次级代谢产物。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。

黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一，具有抗氧化、保肝、抗炎、抗过敏、抗茵、抗突变、保护心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等广谱的生理活性。近年来随着研究方法及技术的不断提高，进一步又发现了许多黄酮类化合物新的种类和生理作用，特别是对自由基清除以及抗癌防癌的作用，使生物类黄酮的研究进入了一个新的阶段。此类化合物在医药、食品领域得到广泛的应用。

黄酮类化合物在防治心脑血管疾病方面已发挥了重要作用。自60年代起,国内外先后研制开发了以银杏叶提取物制成的各种银杏制剂，内含24％的黄酮(槲皮素、异鼠李素、山奈酚及其甙构成)，适用于脑功能障碍，智力功能衰退，末梢血管血流障碍伴随的肢体血流不畅。临床上用于治疗冠心病、心绞痛、脑血管疾病等均有良好的疗效。利用沙棘总黄酮开发的心达康片(5mg/片)是治疗心绞痛、预防动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑血栓的理想天然药物，对治疗心绞痛的总有效率达97.1％。其他类似药物还有:利用山楂叶中的槲皮素、芸香甙、牡荆素等提取总黄酮制成“益心酮”片,葛根总黄酮、毛冬青总黄酮、玄参总黄酮、苦参总黄酮以及单味成分葛根素(异黄酮碳甙)。

黄酮类化合物作为新兴的保健食品活性成分，以纯天然、见效快为、毒副作用低或无毒等特征，以人体补充黄酮的理论和严格的科学实验为基础，为食用者带来实实在在的健康体验。全球性的黄酮类化合物热正在兴起，黄酮类化合物保健品市场前景极为广阔。对于黄酮类化合物的保健作用的应用主要集中在其对心脑血管疾病，抗氧化等领域，还没有其在辅助治疗酒精性肝损伤领域产品及应用的研究。

大量饮酒可引起急性酒精中毒，长期酗酒可引起胃肠道反应、精神障碍和酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ald)等病症。ald是由于持续过度饮酒所引起的常见慢性肝病，在欧美国家，ald是全球发病率和死亡率的主要原因。疾病的范围从脂肪肝到肝脏炎症、坏死、进行性纤维化和肝细胞癌。肝炎，大约发生在10％至35％的慢性饮酒者，肝炎被认为可在ald的过程中发生可逆性的病变。到目前为止，临床上还没有理想的药物治疗ald。在我国，随着人们生活水平的提高，愈来愈多的人参与饮酒，同时ald的发病率也逐渐增加。因此，积极减轻酒精对人体的危害，防治酒精对人体引起的ald具有重要的经济意义及社会意义。

酵素化生物提取工艺是一种新型中草药提取工艺。该提取方式反应温和，提取率高，中间产物较少，主要是通过微生物及其酶的作用，去除或降解中草药植物中的纤维素、淀粉、蛋白质、果胶等大分子物质，同时转化提取富集得到维生素、黄酮类、三萜类、有机酸、氨基酸、矿物质等营养和活性功能小分子物质，易于后续纯化处理。其特点是在整过酵素化生物提取工艺中不使用有机溶剂。

传统的保健酒，是经过将富含活性成分的中草药植物直接加入到酒中经过长时间泡制而成，这种传统工艺的弊端在于只能小作坊产出，因成分复杂多样，质量可控性差，无法规模化生产；其次，传统泡制工艺提取时间长，活性成分提取率较低，导致资源浪费不能有效利用；再次是药味浓且颜色较深，不利于消费者接受。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种含有黄酮成分的护肝保健分子酒，具有辅助治疗或预防酒精性肝损伤作用，以解决传统保健酒泡制工艺提取时间长，活性成分提取率低，质量可控性差等问题。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末与白酒制成的分子酒。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒中，所述白酒的酒精度为40～52vol％。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒中，所述的总黄酮粉末中总黄酮的含量不低于75％。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒中，总黄酮粉末与白酒质量体积比为：

0.2～1.6g/500ml。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒中，所述的总黄酮粉末是一种富含黄酮类化合物的药食同源植物的酵素化提取物或多种富含黄酮类化合物的药食同源植物的酵素化提取物的组合物。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒中，所述的富含黄酮类化合物的药食同源植物包括藤茶、银杏叶、葛根、葛花、野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩、苦荞麦其中的一种或几种。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒中，所述的组合物中每种富含黄酮类化合物的药食同源植物的酵素化提取物的质量相同。

前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒的制备方法，按照所需配比取一种或多种总黄酮粉末与白酒配制成分子酒，均质，电磁老化陈酿后即得。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒的制备方法中，所述的每种总黄酮粉末的制备方法为：将每种富含黄酮类化合物的药食同源植物经粉碎并混合均匀后，按照以下质量份数：药食同源植物粉碎物1～5份，纯净水3～20份，葡萄糖0.5～1份，食盐0.3～0.5份，纤维素酶0.003～0.005份，酵母粉0.003～0.005份混合后，在25～35℃的条件下密封发酵得到酒精度为8～12vol％的发酵液，采用0.2μm～0.4μm的除菌过滤膜过滤，滤液经减压浓缩，在0～5℃条件下放置析出沉淀，收集沉淀并经反复重结晶后即得。

优选的，前述的含有总黄酮的护肝保健分子酒的制备方法中，所述药食同源植物粉碎后的大小为80～100目。

本发明有益效果是：提供了一种含有黄酮成分的护肝保健分子酒，突破传统的中医药方剂炮制或泡制方法，通过酵素化提取工艺对富含黄酮类化合物的药食同源植物进行富集提取得到总黄酮粗提物发酵液，过滤除渣后，减压浓缩，低温放置析出沉淀，收集沉淀并重结晶，得到总黄酮粉末，再将总黄酮粉末按比例与酒精度为40～52vol％的白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。本发明的分子酒具有辅助治疗或预防酒精性肝损伤作用，降低酒精性肝损伤动物肝脏组织上清液中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的含量，升高肝脏组织上清液中总抗氧化能力(t-aoc)的保健分子酒，解决传统保健酒泡制工艺提取时间长，活性成分提取率低，质量可控性差等问题，是一种便于规模化生产，同时富含功效物质黄酮成分，酒色淡黄，无沉淀，无异味，可在享受到喝酒愉悦的同时，又可避免或保护酒精对肝的损伤的保健分子酒产品；能够使人们在享受饮酒愉悦的同时，使肝脏免受或减轻酒精的伤害；与传统泡制酒相比，酒色浅淡，无异味，无沉淀杂质，长期饮用能增加机体抵抗酒精的能力以及对酒精的耐受力。

附图说明

图1为葛花总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织alt、ast和t-aoc的影响(n＝3)；

图2为藤茶总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织alt、ast和t-aoc的影响(n＝3)；

图3为葛花总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态学的影响(400×，n＝3)；

图4为葛花总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态学的影响(400×，n＝3)。

具体实施方式

实施例1

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和白酒制成的分子酒。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：按照所需配比取总黄酮粉末与白酒配制成分子酒，均质，电磁老化陈酿后即得。

实施例2

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和52vol％的白酒按照1.5g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是葛花的酵素化提取物。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将葛花经粉碎为80目，按照以下质量份数：葛花粉碎物1份，纯净水3份，葡萄糖1份，食盐0.3份，纤维素酶0.005份，酵母粉0.003份混合后在25℃的条件下密封发酵得到酒精度为8vol％的发酵液，然后采用0.4μm的除菌过滤膜过滤，将过滤后的发酵液减压浓缩，在0℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到葛花总黄酮粉末；最后，将葛花总黄酮粉末按比例1.5g/500ml的质量体积比与52vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

实施例3

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和52vol％的白酒按照1.5g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是藤茶的酵素化提取物，其中总黄酮的含量为75％。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将藤茶经粉碎为80目，按照以下质量份数：藤茶粉碎物3份，纯净水10份，葡萄糖0.7份，食盐0.4份，纤维素酶0.004份，酵母粉0.004份混合后在25℃的条件下密封发酵得到酒精度为10vol％的发酵液，然后采用0.2μm的除菌过滤膜过滤备用，将过滤后的发酵液减压浓缩，在0℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到藤茶总黄酮粉末；最后，将藤茶总黄酮粉末按比例1.6g/500ml的质量体积比与52vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

实施例4

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和40vol％的白酒按照0.2g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是刺梨、银杏叶和葛根的酵素化提取物，其中总黄酮的含量为95％。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将刺梨、银杏叶和葛根粉碎为100目并混合均匀，按照以下质量份数：刺梨、银杏叶和葛根粉碎物分别为1份、1份和3份，纯净水20份，葡萄糖0.5份，食盐0.5份，纤维素酶0.003份，酵母粉0.005份混合后在35℃的条件下密封发酵得到酒精度为12vol％的发酵液，然后采用0.3μm的除菌过滤膜过滤备用，将过滤后的发酵液减压浓缩，在5℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到刺梨、银杏叶和葛根总黄酮粉末；最后，将刺梨、银杏叶和葛根总黄酮粉末按比例0.2g/500ml的质量体积比与40vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

实施例5

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和45vol％的白酒按照0.6g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦的酵素化提取物，其中总黄酮的含量为85％。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦粉碎为90目并混合均匀，按照以下质量份数：野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦粉碎物各1份，纯净水15份，葡萄糖0.8份，食盐0.4份，纤维素酶0.005份，酵母粉0.004份混合后在30℃的条件下密封发酵得到酒精度为10vol％的发酵液，然后采用0.2μm的除菌过滤膜过滤备用，将过滤后的发酵液减压浓缩，在2℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末；最后，将野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末按比例0.6g/500ml的质量体积比与45vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

实施例6

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和50vol％的白酒按照0.8g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是藤茶、葛根、黄芩和苦荞麦的酵素化提取物，其中总黄酮的含量为80％。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将藤茶、葛根、黄芩和苦荞麦粉碎为80目并混合均匀，按照以下质量份数：藤茶、葛根、黄芩和苦荞麦粉碎物分别为0.5份、1份、0.3份和0,2份，纯净水7份，葡萄糖0.6份，食盐0.5份，纤维素酶0.003份，酵母粉0.005份混合后在25℃的条件下密封发酵得到酒精度为8vol％的发酵液，然后采用0.4μm的除菌过滤膜过滤备用，将过滤后的发酵液减压浓缩，在3℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到藤茶、葛根、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末；最后，将藤茶、葛根、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末按比例0.8g/500ml的质量体积比与50vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

实施例6

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和42vol％的白酒按照1g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是银杏叶、葛花、野木瓜、构树叶、黄芩和苦荞麦的酵素化提取物，其中总黄酮的含量为90％。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将银杏叶、葛花、野木瓜、构树叶、黄芩和苦荞麦经粉碎为100目并混合均匀，按照以下质量份数：银杏叶、葛花、野木瓜、构树叶、黄芩和苦荞麦粉碎物各0.5份，纯净水5份，葡萄糖0.8份，食盐0.3份，纤维素酶0.005份，酵母粉0.003份混合后在35℃的条件下密封发酵得到酒精度为12vol％的发酵液，然后采用0.2μm的除菌过滤膜过滤备用，将过滤后的发酵液减压浓缩，在5℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到银杏叶、葛花、野木瓜、构树叶、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末；最后，将银杏叶、葛花、野木瓜、构树叶、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末按比例1g/500ml的质量体积比与42vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

实施例7

一种含有总黄酮的护肝保健分子酒，是由总黄酮粉末和52vol％的白酒按照1.2g/500ml的配比制成的分子酒，其中总黄酮粉末是藤茶、刺梨、银杏叶、葛根、葛花、野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦的酵素化提取物，其中总黄酮的含量为75％。

上述护肝保健分子酒的制备方法为：

将藤茶、刺梨、银杏叶、葛根、葛花、野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦粉碎为80目并混合均匀，按照以下质量份数：藤茶、刺梨、银杏叶、葛根、葛花、野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦粉碎物各0.5份，纯净水18份，葡萄糖1份，食盐0.5份，纤维素酶0.004份，酵母粉0.005份混合后在25℃的条件下密封发酵得到酒精度为12vol％的发酵液，然后采用0.2μm的除菌过滤膜过滤备用，将过滤后的发酵液减压浓缩，在0℃放置析出沉淀，收集沉淀并反复重结晶，得到藤茶、刺梨、银杏叶、葛根、葛花、野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末；最后，将藤茶、刺梨、银杏叶、葛根、葛花、野木瓜、沙棘、构树叶、黄芩和苦荞麦总黄酮粉末按比例1.2g/500ml的质量体积比与52vol％白酒配制成分子酒，均质，分析检验，灌装，电磁老化陈酿后得到分子酒。

为了进一步验证本发明的目的及有益效果，发明人进行了如下实验：

1.实验动物

雄性昆明种小鼠，体重18～22g，由重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供(合格证号scxk(军)2012-0011)。动物自由饮水、进食，饲养环境温度23±2℃，湿度60±10％，颗粒饲料由重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供。

2.实验药物及试剂

含总黄酮的分子酒：采用上述实施例2和实施例3制得的葛花总黄酮分子酒和藤茶总黄酮分子酒。

习酒：购买于贵阳沃尔玛超市(批号为：750813602s)，酒精度为52度。

bca蛋白浓度测定试剂盒：江苏碧云天生物技术研究所；t-aoc：南京建成生物工程研究所；alt：南京建成生物工程研究所；ast：南京建成生物工程研究所。

3.实验分组及给药

将昆明种小鼠随机分为5组(每组10只)，空白对照组；模型组(0.15ml/20g)及黄酮分子酒低、中、高(1.0mg/0.15ml/20g、1.5mg/0.15ml/20g和2.0mg/0.15ml/20g)，每天灌胃1次，连续21天。试验过程中按常规每周称一次体重。

4.he染色

于末次灌胃的小鼠进行颈椎脱臼处死，取小鼠右叶肝脏组织切成1×1cm，放入4％的多聚甲醛固定24h，石蜡包埋后4μm连续切片，进行he染色，将上述切好的片放于60℃烘箱中烤干，然后进行以下的实验操作。(1)二甲苯脱蜡：二甲苯(i)10分钟→二甲苯(ii)10分钟→100％乙醇5分钟→95％乙醇5分钟→80％乙醇5分钟→蒸馏水洗5分钟；(2)苏木素、伊红染色：脱蜡结束后→苏木素溶液染色5分钟→蒸馏水洗10秒→盐酸乙醇分化2秒→自来水冲洗10分钟→蒸馏水浸泡2分钟→伊红染色3分钟→自来水冲洗3分钟→蒸馏水浸泡10秒；(3)脱水、透明、封片：80％乙醇30秒→95％乙醇30秒→100％乙醇(i)1分钟→100％乙醇(ii)1分钟→二甲苯(i)2分钟→二甲苯(ii)2分钟→中性树胶封片；(4)bx43正置显微镜观察肝脏组织的病理情况，并拍照记录。

5.肝脏组织t-aoc、alt及ast的测定

灌胃给药结束后的小鼠进行颈椎脱臼处死，取肝脏组织称取重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10min，取上清液待测。

6.统计学方法应用spss13.0统计软件进行分析，结果以均数表示，组间均数比较采用t检验。

7.结果

7.1葛花总黄酮分子酒和藤茶总黄酮分子酒分别对酒精性肝损伤小鼠一般状态的影响

空白组：小鼠毛发发亮，饮水、进食和大便正常，活动灵敏，无死亡；

模型组：小鼠在灌服习酒后均出现出气困难，体面呆滞，精神萎靡，食欲减退，喝水量减少，嗜睡及活动迟缓等现象，灌服习酒后30min左右进入嗜睡状态，4小时左右苏醒，6小时左右完全清醒，并表现为毛发光泽度差，大便伴有稀烂。

葛花总黄酮分子酒和藤茶总黄酮分子酒给药组(低、中及高剂量)：小鼠的食欲比模型组好，醒酒时间比模型组早。

7.2葛花总黄酮分子酒和藤茶总黄酮分子酒分别对酒精性肝损伤小鼠死亡率的影响

实验过程中，空白组无小鼠死亡。前期预实验为找出合适的给酒剂量为(0.15ml/20g)，葛花总黄酮分子酒模型组死亡率分别为50％；在给药低剂量组(d)有5只死亡，中剂量组(z)有4只死亡，高剂量(g)有2只死亡，死亡率分别为50％、40％和20％。藤茶总黄酮分子酒模型组死亡率分别为60％；在给药低剂量组(d)有5只死亡，中剂量组(z)有3只死亡，高剂量(g)有2只死亡，死亡率分别为50％、30％和20％。死亡的小鼠均为灌胃后第二天发现，解剖并未发现胸腔有淤血或者胃穿孔的现象，但发现胃里面有大量的液体且大肠内有大量气体而没有食物存在。死前均表现步履蹒跚，抽搐，烦躁及肚子胀气等现象。表1指葛花总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠死亡率的影响；表2指藤茶总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠死亡率的影响。

表1葛花总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠死亡率的影响

注：k：空白对照组；m：习酒剂量0.15ml/20g组；d：1.0mg/0.15ml/20g；

z：1.5mg/0.15ml/20g组；g：2.0mg/0.15ml/20g。

表2藤茶总黄酮分子酒对酒精性肝损伤小鼠死亡率的影响

注：k：空白对照组；m：习酒剂量0.15ml/20g组；d：1.0mg/0.15ml/20g；

z：1.5mg/0.15ml/20g组；g：2.0mg/0.15ml/20g。

7.3葛花总黄酮和藤茶总黄酮分子酒分别对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织alt、ast和t-aoc的影响

如图1和图2所示，与空白对照组(k)相比，模型组肝脏组织中alt和ast的水平显著增加及t-aoc的能力明显减弱(*p﹤0.05)。与模型组相比，总黄酮分子酒各剂量组肝脏组织中alt和ast的水平减弱及t-aoc的能力增加，且具有统计学差异(#p﹤0.05)。说明葛花总黄酮分子酒及藤茶总黄酮分子酒具有降低肝脏组织转氨酶及增加总抗氧化能力的作用。

7.4葛花总黄酮和藤茶总黄酮分子酒分别对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态学的影响

如图3及图4所示，空白对照组小鼠肝组织结构正常，肝细胞排列整齐、结构清晰，无水肿现象及炎性细胞。与空白对照组相比，模型组小鼠肝组织结构及肝细胞排列紊乱，多数肝细胞呈现水肿现象，肝组织中炎症细胞浸润，肝细胞纤维化，肝组织中有大小不一的脂肪滴空泡。与模型组相比，分子酒给药组病变症状减轻。低剂量和中剂量给药组小鼠肝组织结构和肝细胞排列尚整齐，肝细胞水肿现象、肝组织内炎性细胞及脂肪滴空泡较模型组减轻。高剂量给药组小鼠肝组织结构清晰，肝细胞排列整齐、大小均一，炎性细胞及脂肪滴空泡与模型组组相比，症状显著减轻。

本实验的结果表明葛花总黄酮和藤茶总黄酮分子酒能够降低酒精性肝损伤动物的死亡率，降低肝脏组织中alt和ast的水平及增加t-aoc的活力。病理切片结果中看到含有总黄酮的分子酒能使肝组织结构清晰，肝细胞排列整齐、大小均一，炎性细胞减少。