一种DNA与RNA同时定量的试剂盒、方法及质控方法与流程

本发明涉及一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法，属于分子生物学领域。
背景技术：
：下一代测序(ngs)技术在过去的十年里彻底改变了基因组学领域。每次ngs运行通常生成关于每次测序运行的并行数十万到数十亿个dna模板的数千兆序列信息。目前用于人类基因组测序的成本已经达到1000美元的基准。ngs技术的低成本和高通量使得人们能够使用核酸测序作为临床工具。然而，要达到ngs临床应用所需的期望成本、速度、分析灵敏度和准确度，仍然存在许多挑战。临床样本，诸如活检样本和福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样本，仅提供了少量的起始材料。ngs建库可以使用dna或rna做为起始模版，分别适用于不同的基因突变类型的检测。临床样本中的核酸往往由于长期在室温存放，其中的核酸特别是rna大量降解，使rna模版建库变得困难。临床常用的对样本进行福尔马林固定的处理过程使核酸产生交联或破坏，使得ngs建库效率下降并使检测结果背景增高。因此，在耗费大量时间和成本构建ngs文库前快速方便地对dna和rna模版进行含量和质量评估是必要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于dna与rna同时定量的试剂盒、方法与试剂盒以及dna与rna的品质控制方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：第一方面，本发明提供了一种对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的试剂盒，其中，所述核酸包含管家基因，所述管家基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，两个所述外显子分别为第一外显子和第二外显子；所述试剂盒包含能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物、可与第一内含子杂交的第一杂交探针以及可与第一外显子或第二外显子杂交的第二杂交探针，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有不同的标记物。优选地，所述试剂盒还包含pcr反应液和反转录反应液。优选地，所述pcr反应液包括dna聚合酶、脱氧核苷酸、无机盐和ph缓冲液；所述反转录反应液包括反转录酶、脱氧核苷酸、无机盐和ph缓冲液。优选地，所述试剂盒还包括随机引物或与mrnapolya尾互补的poly-dt多聚核苷酸引物。优选地，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有发光波长不同的发光基团。优选地，所述发光基团为fam、rox、hex、cy5、tet或vic。优选地，如下(a)～(e)中的任一种：(a)所述核酸包含基因组dna或其片段；(b)所述核酸包含rna；(c)所述核酸包含cdna或其片段,优选地，所述cdna通过逆转录总rna、mrna、mirna或其他非编码rna获得；(d)所述核酸包含基因组dna和rna；(e)所述核酸包含基因组dna和cdna。优选地，所述样本来源于血液样本、细胞样本、组织样本、食物样本、环境样本或生物样本。优选地，所述试剂盒还包括试剂盒的使用说明书。第二方面，本发明提供了一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的方法，其包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的rna转化为cdna；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行pcr扩增，得到扩增子；(3)检测第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中dna与rna进行定量，定量的方法为：分别记录第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的ct值，通过ct值的绝对值以及差值分析样本中dna与rna的品质；其中，所述ct值为标记物所产生信号达到设定检测阈值时对应的扩增循环数。第三方面，本发明提供了另一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的方法，其包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的rna转化为cdna；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行pcr扩增，得到扩增子；(3)以所述核酸为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行pcr扩增；(4)分别检测步骤(2)与步骤(3)中第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中dna与rna进行定量，定量的方法为：分别记录步骤(2)与步骤(3)中第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的ct值，通过步骤(3)中第一杂交探针和/或第二杂交探针上标记物的ct值分析样本中dna的品质，通过步骤(2)中第一杂交探针上标记物的ct值与步骤(3)中第一杂交探针上标记物的ct值之差分析样本中rna的品质；其中，所述ct值为标记物所产生信号达到设定检测阈值时对应的扩增循环数。第四方面，本发明提供了一种对含有核酸的样本中dna与rna进行质控的方法，其包括以下步骤:从核酸中选取一个内参基因，所述内参基因包含碱基数小于300的第一内含子、碱基数大于300的第二内含子、与所述第一内含子相邻的两个外显子和与所述第二内含子相邻的两个外显子；或者从核酸中选取两个内参基因，其中一个内参基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，另一个内参基因包含碱基数大于300的第二内含子和与所述第二内含子相邻的两个外显子；其中，与第一内含子相邻的两个外显子分别为第一外显子和第二外显子，与第二内含子相邻的两个外显子分别为第三外显子和第四外显子；以含有第一内含子的内参基因作为管家基因，采用权利要求10～13任一项所述方法对含有核酸的样本中dna与rna同时定量；第三外显子边缘的一条建库引物用于以所述核酸为模版的rna单端锚定建库；以第二内含子与第三外显子交界区的碱基测序读数计量内参基因的dna扩增产物，以第四外显子的测序读数计量内参基因的rna扩增产物，以两个测序读数的比例判断ngs文库的rna建库质量；根据dna与rna同时定量的结果以及判断ngs文库的rna建库质量的结果，综合分析样本中dna与rna的品质。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种用于dna与rna同时定量的方法与试剂盒，采用该试剂盒与方法可同时分析dna与rna。并且，本发明还将dna与rna同时定量的测量值与高通量测序检测值进行质控比较，提供了dna与rna品质的双质控方法，该方法适用于快速方便地评估样本品质是否适合进行操作及成本都要求较高的高通量测序基因检测。附图说明图1为本发明对含有核酸的样本中dna与rna进行质控的方法示意图；图2为本发明实施例3中将反转录定量pcr的外显子探针与内含子探针的ct差值与ngs测序内参基因rna对dna读数比例作图的结果图；图3为本发明实施例3中将反转录定量pcr与无反转录定量pcr的外显子探针的ct差值与ngs测序内参基因rna对dna读数比例作图的结果图；图4为本发明实施例3中将使用qubit定量的rna与dna浓度的比例与ngs测序内参基因rna对dna读数比例作图的结果图；图5为本发明实施例3中将使用qubit定量的rna浓度与ngs测序内参基因rna对dna读数比例作图的结果图。具体实施方式在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。术语：“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或者可以通过dna或rna聚合酶而掺入聚合物中的任何底物。如本文所用的“扩增”通常是指产生期望序列的两个或更多个拷贝的过程。扩增反应的组分可以包括但不限于，例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dntp等。“聚合酶链反应扩增”或“pcr扩增”是指以几何级数扩增目标双链dna的特定片段或亚序列的方法。pcr是本领域技术人员所熟知的；参见，例如美国专利no.4,683,195和4,683,202；和innis等人1990年编辑的“pcrprotocols:aguidetomethods”。pcr扩增导致靶核苷酸序列的数量呈指数增加。“扩增产物”或“扩增子”是指由pcr扩增反应产生的寡核苷酸，其为特定靶模板核酸链和/或其互补序列的一部分的拷贝，其在核苷酸序列中对应于模板核酸序列和/或其互补序列。扩增产物还可以包含对引物具有特异性的序列，并且该序列侧接靶核酸的序列和/或其互补序列。如本文所述的扩增子通常是双链dna，虽然可以参考其单个链。“管家基因”，又称持家基因是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。本发明中“内参基因”相当于“管家基因”。内参基因与管家基因的表达在各类样本的来源组织中相对丰富且稳定，表达量不受生物条件调控。术语“外显子”是指在成熟mrna中被保留下的部分，即成熟mrna对应于基因中的部分。内含子是在mrna加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mrna中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。“引物”通常是较短的单链多核苷酸，通常具有游离的3'-oh基团，其通过与靶序列杂交而结合至所关注的靶标，然后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。本文可互换使用的“杂交”和“退火”是指这样的反应：其中一个或多个多核苷酸反应以形成凭借核苷酸基团的碱基之间的氢键来稳定的复合物。氢键可以通过watson-crick碱基配对、hoogstein结合或通过任何其他序列特异性方式而出现。如本文所用，术语“特异性退火”是指核酸与互补序列的核酸杂交。如本文所用，核酸分子的一部分可以与另一核酸分子上的互补序列特异性地杂交。也就是说，核酸序列的整个长度不一定需要与此类序列的一部分杂交以“与另一个分子特异性地杂交”，例如，在分子的5'末端可以存在一段未杂交的核苷酸，而同一分子的3'末端的一段序列与另一分子特异性地杂交。“杂交探针”是一小段单链dna片段(十几到几百个碱基)，用于检测与其互补的核酸序列。杂交探针的核酸分子上带有可能被检测的信号分子，如同位素或荧光标记的核酸分子。当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸(dna或rna)序列通过氢键紧密相连。在本发明中，“第一杂交探针”、“第二杂交探针”、“第一外显子”、“第二外显子”、“第三外显子”、“第四外显子”、“第一内含子”、“第二内含子”等中的“第一”、“第二”等仅是为了对杂交探针、外显子、内含子等进行区别，而并非对其数量进行限定。“反转录”是以rna为模板，通过反转录酶，合成dna的过程。是dna生物合成的一种特殊方式。反转录是进行基因工程过程中，以rna为模板提取出dna遗传信息的过程。"随机引物"是指当特定mrna由于含有使逆转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体这一非特异的引物来拷贝全长mrna。“反应体系”是组分(例如一种或多种多肽、核酸和/或引物)的组合，其在合适的条件下进行特定的反应，例如引物延伸反应或pcr扩增反应。“文库”是指核酸序列的集合。术语“确定”、“检测”、“测量”、“评价”、“评估”、“验定”和“分析”在本文中可互换地使用以指代任何形式的测量，并且包括确定某一元素存在与否。这些术语包括定量确定和/或定性确定。应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“由…组成”和/或“基本由…组成”方面和实施方案。如本文所使用的，除非另外指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。如本领域技术人员所理解的那样，本文提及“约”的值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，关于“约x”的描述包括对“x”的描述。在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值，以及在该范围内的任何其他规定值或中间值都包括在本公开的范围内。在所规定的范围包括上限或下限的情况下，排除那些所包括的界限中的任一个的范围，也包括在本公开中。除非另有说明，否则本发明是使用如下参考文献所述的标准程序来进行的，例如sambrook等人的“molecularcloning:alaboratorymanual(第3版)”(美国纽约冷泉港出版社，2001年)；和davis等人的“basicmethodsinmolecularbiology”(美国纽约elsevierscience出版公司，1995年)。为了考察含有核酸的样本中dna与rna的品质，以提高后续高通量测序的效率，在本发明的一个实施例中，本发明提供了一种对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的试剂盒，其中，所述核酸包含管家基因，所述管家基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，两个所述外显子分别为第一外显子和第二外显子；所述试剂盒包含能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物、可与第一内含子杂交的第一杂交探针以及可与第一外显子或第二外显子杂交的第二杂交探针，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有不同的标记物。在本发明的上述试剂盒中，第一内含子的长度较短，其长度较短是指其与相邻的两个外显子的部分所构成的扩增单元长度适合高效扩增。第一内含子的碱基数需小于300，若其碱基数大于300可能造成pcr扩增不平衡，如第一内含子可为75碱基。上述能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物分别位于一个基因的不同外显子上，可对gdna和cdna模版进行扩增，产生的扩增子的片段大小在定量pcr反应的高效扩增范围内。上述第一杂交探针和第二杂交探针均位于正反扩增引物所界定的扩增子范围内。在反转录定量pcr过程中，第一杂交探针作用于基因的内含子序列，仅可探测gdna信号，第二杂交探针作用于基因的外显子序列，可探测gdna与cdna信号总和(记述为rt_vic)。通过本发明试剂盒中的一对扩增引物和两个特定的探针，可采用反转录定量pcr同时测定gdna信号和gdna与cdna信号总和，以实现对dna与cdna的同时定量。作为本发明试剂盒的一个实施例的优选方式，本发明试剂盒还包含pcr反应液和反转录反应液。更优选地，所述pcr反应液包括dna聚合酶、脱氧核苷酸、无机盐和ph缓冲液；所述反转录反应液包括反转录酶、脱氧核苷酸、无机盐和ph缓冲液。进一步地，所述试剂盒还包括随机引物或与mrnapolya尾互补的poly-dt多聚核苷酸引物。上述反转录酶一种依赖rna为模版dna聚合酶。反转录过程中，采用的反应试剂为上述反转录反应液和寡核苷酸引物。寡核苷酸引物可以是基因特异性引物，例如能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物中的一条，也可以是或随机引物，或与mrnapolya尾互补的poly-dt多聚核苷酸引物。上述pcr反应液中的ph缓冲液用于调节pcr反应体系的ph值，反转录反应液ph缓冲液用于调节反转录体系的ph值。本领域的技术人员可根据常规知识选择合适的ph缓冲液和无机盐，例如ph缓冲液选用包括三羟甲基氨基甲烷(tris)的缓冲溶液，如tris-hcl等；无机盐选用氯化镁等。pcr反应体系和反转录体系的所有成分均可从生物试剂厂家处购买或合成获得。在本发明的试剂盒中，杂交探针上的标记物为可能被检测的信号分子，其可以是荧光标记，也可以是其他的标记物，例如放射性同位素(通常用磷-32)等。为了便于荧光定量分析，本发明选用的标记物为发光基团，即荧光标记。为了使得两个探针分别产生不同的信号，以便两个信号可被能探测多个波长的荧光定量pcr仪同时探测，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有发光波长不同的发光基团。优选地，所述发光基团为fam、rox、hex、cy5、tet或vic。更优选地，第一杂交探针上带有的标记物为fam，第二杂交探针上带有的标记物为vic。fam探针和vic探针可从生物试剂厂家处，如thermofisher,订购合成。优选地，如下(a)～(e)中的任一种：(a)所述核酸包含基因组dna或其片段；(b)所述核酸包含rna；(c)所述核酸包含cdna或其片段,优选地，所述cdna通过逆转录总rna、mrna、mirna或其他非编码rna获得；(d)所述核酸包含基因组dna和rna；(e)所述核酸包含基因组dna和cdna。本发明所述的试剂盒可用于样本中的各种核酸。在一些实施方案中，核酸包含rna。在一些实施方案中，核酸包含基因组dna和rna的混合物。在一些实施方案中，核酸模板来源(诸如，片段化)于长度超过ngs方法或平台的最佳读段长度的核酸，诸如全长染色体dna或全长mrna。在一些实施方案中，核酸包含cdna或其片段。在一些实施方案中，通过逆转录总rna或其部分(诸如，mrna、mirna或其他非编码rna)来获得cdna。在一些实施方案中，cdna是单链的，例如cdna的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者或更多是单链的。在一些实施方案中，核酸包含双链cdna。在一些实施方案中，核酸包含gdna或其片段。在一些实施方案中，gdna是单链的，例如gdna的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％中的任一者或更多是单链的。在一些实施方案中，核酸包含双链gdna。在一些实施方案中，核酸包含cdna和gdna的混合物。在一些实施方案中，cdna与gdna之间的重量比为超过约1:10、1:5、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、5:1、10:1中的任一者或更大。在一些实施方案中，核酸包含不超过约1000ng、500ng、200ng、100ng、50ng、40ng、30ng、25ng、20ng、15ng、10ng、5ng、4ng、3ng、2ng、1ng中的任一者或更少的核酸模板(诸如cdna、gdna、rna、它们的组合或总核酸)。优选地，所述样本来源于血液样本、细胞样本、组织样本、食物样本、环境样本或生物样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于细胞或组织样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于细胞系样本或来源于培养细胞。在一些实施方案中，本发明样本来源于基因工程细胞系。在一些实施方案中，本发明样本来源于肿瘤细胞。在一些实施方案中，本发明样本从食物样本、环境样本或生物样本中获得。在一些实施方案中，本发明样本来源于来自个体的生物样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于需要疾病(诸如癌症)治疗的生物样本。在一些实施方案中，本发明样本是从个体中获得的诊断样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于来自健康个体的生物样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于基因工程动物(诸如小鼠、大鼠或非人灵长类)。在一些实施方案中，生物样本还包含蛋白质、细胞、流体、生物流体、防腐剂和/或其他物质。作为非限制性示例，样本可以是脸颊拭子、血液、血清、血浆、痰、脑脊液、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊肿液、肿瘤组织、组织、活体组织、唾液、抽吸物或它们的组合。在一些实施方案中，生物样本通过切除或活检获得。在一些实施方案中，本发明样本来源于个体的血液样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于个体的外周血单核细胞(pmbc)样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于个体血液样本中的免疫细胞(诸如t细胞、nk细胞或b细胞)的一部分。在一些实施方案中，核酸模板是无细胞dna。在一些实施方案中，核酸模板是来源于个体血液样本的无细胞dna。在一些实施方案中，核酸模板是循环肿瘤dna(即ctdna)。在一些实施方案中，核酸模板来源于个体血液样本的循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，本发明样本来源于个体活检样本。在一些实施方案中，本发明样本来源于肿瘤活检，诸如未治疗的活检组织或治疗后的活检组织。在一些实施方案中，本发明样本来源于个体的福尔马林固定和/或石蜡包埋的活检组织。在一些实施方案中，生物样本从需要治疗与遗传改变相关联的疾病(诸如，癌症或遗传性疾病)的个体中获得。在一些实施方案中，已知靶序列存在于疾病相关的基因中。在一些实施方案中，生物样本从需要治疗癌症的个体中获得。在一些实施方案中，生物样本包含个体中一个或多个肿瘤部位的肿瘤细胞。在一些实施方案中，生物样本从个体中新鲜收集。在一些实施方案中，生物样本在用于本文所述的方法中之前被储存一段时间，诸如至少约1天、1周、1个月、3个月、6个月、1年中的任一者或更久。在一些实施方案中，生物样本是福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样本。在一些实施方案中，生物样本直接用作本文所述方法中的核酸样本。在一些实施方案中，生物样本通过在溶液中稀释和/或悬浮来进行预处理。在一些实施方案中，生物样本从受试者中获得并且在用于本文所述的方法中之前被保存或加工。例如，生物样本可被包埋在石蜡中、被冷藏或冷冻。冷冻的生物样本可在使用前解冻。生物样本的其他示例性处理或加工包括但不限于离心、过滤、超声处理、均化、加热、冻融、与防腐剂(例如，抗凝剂或核酸酶抑制剂)接触以及它们的任何组合。在一些实施方案中，生物样本用化学和/或生物学试剂处理。化学和/或生物学试剂可用于在处理和/或储存期间保护和/或维持包含在其中的生物样本或核酸模板的稳定性。在一些实施方案中，化学和/或生物学试剂可用于从生物样本的其他组分中释放核酸模板。作为非限制性示例，血液样本可在用于获得用于本文所述的方法中的核酸样本之前用抗凝剂处理。技术人员非常清楚用于加工、保存或处理生物样本的方法和过程，以及从生物样本或细胞样本中分离核酸以进行核酸分析的方法。在一些实施方案中，生物样本或核酸样本中的核酸模板可在用于本文所述的方法中之前被分离、富集或纯化。可使用从样本中分离、富集或纯化核酸的合适方法。为了方便使用本发明的试剂盒，所述试剂盒还包括试剂盒的使用说明书。本发明的试剂盒还可包含一种或多种附加组成部分诸如容器、辅因子，或者附加试剂诸如变性剂。试剂盒组分可被包装在一起。在本发明的一个实施例中，本发明提供了一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的方法，其包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的rna转化为cdna；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行pcr扩增，得到扩增子；(3)检测第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中dna与rna进行定量，定量的方法为：分别记录第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的ct值，通过ct值的绝对值以及差值分析样本中dna与rna的品质；其中，所述ct值为标记物所产生信号达到设定检测阈值时对应的扩增循环数。本发明上述方法的步骤(1)中，含有基因组dna(gdna)与rna的混合核酸被反转录，反转录反应由结合与rna模版的寡核苷酸处引发，通过反转录酶催化，以脱氧核苷酸为反应底物，复制出互补序列的dna，即其中的rna转化为互补dna(cdna)，得到的反转录后的产物即为基因组dna与cdna的混合物。gdna与cdna的区别在于gdna含有外显子与内含子序列，而cdna仅含有外显子序列。其中，反转录可选用如下条件：将反转录体系的组分与待定量核酸混合，置于一定的温度下(如42至55摄氏度)，温育一定时间(如5分钟至两小时)，即可获得rna模版的互补dna(cdna)。随后，采用一对扩增引物和两个不同标记的探针(如fam探针和vic探针)进行定量扩增反应(如qpcr)。定量扩增反应过程中，一对正反扩增引物分别位于一个基因的不同外显子上，反应由结合于dna模版(包括gdna和cdna模版)的扩增引物处引发，通过dna聚合酶酶催化，以脱氧核苷酸为反应底物，复制出新的dna链。新的dna链又成为下一轮反应的模版，使得反应产物以几何级数方式扩增目标双链dna的特定片段，产生的扩增子的片段大小在定量pcr反应的高效扩增范围内。其中，第一杂交探针作用于内含子，仅探测gdna信号，第二杂交探针作用于外显子，探测gdna与cdna信号总和(rt_vic)。在一些实施方案中，可在反转录完成后，再添加定量pcr体系的试剂(即pcr反应液、扩增引物、第一杂交探针和第二杂交探针)。在另一些实施方案中，也可在反转录体系中预先混合定量pcr体系的组分(即pcr反应液、扩增引物、第一杂交探针和第二杂交探针)，称为“一步法反转录pcr”，是本领域技术人员所熟知的。将“一步法反转录pcr”体系先置于适合反转录的温度及时间条件下，如42至55摄氏度，5分钟至两小时，获得rna模版的互补dna(cdna)。这一条件下，用于定量pcr的耐热dna聚合酶不发生作用。随后将体系加热进入pcr循环，循环条件下的热解链温度(如80至100摄氏度)可使反转录酶失活，终止反转录反应。在理想的定量pcr情况下，ct值与dna含量的以2为底的对数成反比，即dna量每翻倍则ct值降低1。在实际应用中，探针对模版的结合效率、不同荧光基团的光强度、扩增的效率、偶发因素等都会对ct值造成影响。一般地，通过比较ct值仍可判断两个核酸的相对含量。此处用语的“ct值低”等同“信号强”，反之亦然。在本发明对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的方法中，第一杂交探针的信号可评估样本中gdn，第二杂交探针的信号与第一杂交探针的信号之差可评估样本中rna。例如，若使用fam基团标记第一杂交探针，vic基团标记第二杂交探针，则通过反转录定量pcr获得两个ct值，记述为rt_fam和rt_vic。rt_fam反映dna模版产生的信号，rt_vic与rt_fam的差值反映rna产生的信号。信号的绝对值及差值的阈值判断，可通过数据积累及经验设定：在一些样本中，rt_fam信号强，且rt_vic值明显低于rt_fam，说明dna与rna品质皆好；在一些样本中，rt_fam信号强，而rt_vic与rt_fam的差值不明显，说明dna品质好，而rna品质差；在一些样本中，rt_fam信号弱，且rt_vic与rt_fam的差值不明显，说明dna与rna品质皆差；在一些样本中，rt_fam信号弱，而rt_vic值明显低于rt_fam，说明rna质量好；对于未受到主动干预(如经受dna核酸酶的降解处理，或仅提取rna)的核酸样本，因rna的稳定性低于dna，若rna良好即可推断样本的dna良好，而rt_fam信号弱是由于受强烈的rna竞争性抑制所导致的。在本发明的一个实施例中，本发明提供了另一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的方法，其包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的rna转化为cdna；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行pcr扩增，得到扩增子；(3)以所述核酸为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行pcr扩增；(4)分别检测步骤(2)与步骤(3)中第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中dna与rna进行定量，定量的方法为：分别记录步骤(2)与步骤(3)中第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的ct值，通过步骤(3)中第一杂交探针和/或第二杂交探针上标记物的ct值分析样本中dna的品质，通过步骤(2)中第一杂交探针上标记物的ct值与步骤(3)中第一杂交探针上标记物的ct值之差分析样本中rna的品质；其中，所述ct值为标记物所产生信号达到设定检测阈值时对应的扩增循环数。上述步骤(3)，是一个无反转录的定量pcr反应体系。此步骤可仅加入定量pcr体系的试剂(即pcr反应液、扩增引物、第一杂交探针和第二杂交探针)，也可以同时加入pcr体系的试剂与部分或全部反转录所需的试剂。当同时加入反转录所需的试剂时，可通过省略反转录酶或改变其它必要组分或省略反转录温育步骤直接加热进入pcr循环而达到，使得rna不被反转录。步骤(3)无反转录的定量pcr所获得的信号值均来自gdna，可用于评估样本中gdna；步骤(1)和(2)反转录定量pcr的gdna与cdna信号总和与步骤(3)无反转录反应管相同探针的gdna值的差值可评估样本中rna。在本发明提供的另一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的优选方法中，若使用fam基团标记第一杂交探针，vic基团标记第二杂交探针，通过步骤(1)和步骤(2)反转录定量pcr获得两个ct值，记述为rt_fam和rt_vic，通过步骤(3)无反转录的的定量pcr可获得两个额外的ct值，记述为nr_fam和nr_vic，则：可用nr_fam和/或nr_vic测量样本中的dna，较低的ct值说明dna品质好。此信号不受rna的抑制干扰。可用rt_vic与nr_vic的差值判断样本中的rna，若rt_vic值明显低于nr_vic则rna品质好。rna品质可用rt_fam与nr_fam的差值进行辅助判断。较好的rna其rt_vic会对rt_fam造成抑制，导致其读数高于nr_fam。在扩增反应中，反转录的rna对dna信号形成竞争型抑制，故rt_vic信号的增强会伴随rt_fam的减弱，可通过rt_fam与nr_fam的相对减弱辅助评估样本中的rna质量。同步使用反转录定量pcr和无反转录定量pcr可获得更多的数据点，但需要付出更多的试剂成本和操作成本，在一些情况下可能是不必要的。第四方面，本发明提供了一种对含有核酸的样本中dna与rna进行质控的方法，其包括以下步骤:从核酸中选取一个内参基因，所述内参基因包含碱基数小于300的第一内含子、碱基数大于300的第二内含子、与所述第一内含子相邻的两个外显子和与所述第二内含子相邻的两个外显子；或者从核酸中选取两个内参基因，其中一个内参基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，另一个内参基因包含碱基数大于300的第二内含子和与所述第二内含子相邻的两个外显子；其中，与第一内含子相邻的两个外显子分别为第一外显子和第二外显子，与第二内含子相邻的两个外显子分别为第三外显子和第四外显子；以含有第一内含子的内参基因作为管家基因，采用权利要求10～13任一项所述方法对含有核酸的样本中dna与rna同时定量；第三外显子边缘的一条建库引物用于以所述核酸为模版的rna单端锚定建库；以第二内含子与第三外显子交界区的碱基测序读数计量内参基因的dna扩增产物，以第四外显子的测序读数计量内参基因的rna扩增产物，以两个测序读数的比例判断ngs文库的rna建库质量；根据dna与rna同时定量的结果以及判断ngs文库的rna建库质量的结果，综合分析样本中dna与rna的品质。在上述对含有核酸的样本中dna与rna进行质控的方法中，第一内含子为较短内含子，第二内含子为较长内含子。第一内含子为较短内含子是指其与相邻的两个外显子的部分所构成的扩增单元长度适合高效扩增，第一内含子的碱基数需小于300，若其碱基数大于300可能造成pcr扩增不平衡，如第一内含子可为75碱基。第二内含子为较长内含子是指其长度超过二代测序的核酸平均片段化长度，如超过300碱基，具体可为1608碱基，第二内含子若短于300碱基可能无法区分大片段dna读数和rna读数。第一内含子与第二内含子若位于同一个基因上，它们可相邻或不相邻。本发明对含有核酸的样本中dna与rna进行质控的方法中，定量pcr与ngs测序读数分别成为相关联的先导预测点与后续分析点，共同构成rna文库构建的质控方式。本发明进行质控的方法可用于对样本进行基因检测(如基因测序或各类pcr)前进行核酸的质控评估。此类基因检测一般涉及核酸模版的复制，对核酸含量及品质均有要求，而使用分光计的核酸定量方法仅可确定核酸含量但不能评估核酸质量。本发明进行质控的方法则需对核酸进行复制扩增，如果核酸含量高且完整性好，则扩增效果好。如在二代测序(ngs)建库中的应用为：a)扩增子的片段大小范围是适用于高通量测序的，因而可用于对ngs文库构建的起始核酸做dna和/或rna的质控。b)如果样本的dna信号好，说明核酸完整，则适合以dna为模版构建ngs文库。c)如果样本较新鲜所提取的rna含量高且较完整，则适合以rna为模版的ngs建库；反之rna含量低或已降解，不适合建库。需要注意的是，本发明对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的结果与ngs等基因检测结果的质量具有强相关性，但并不表示两者完全吻合。本发明进行质控的方法判断为低品质的核酸仍有可能获得良好的检测结果，反之亦然，因此，本发明进行质控的方法适用于快速方便地评估样本品质是否适合进行操作及成本都要求较高的高通量测序基因检测。本发明对含有核酸的样本中dna与rna进行质控的方法如图1所示。实施例1本实施例描述了本发明对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的试剂盒的试剂盒。其中，选取的管家基因为人类chmp2a基因，基因编号为nm_014453，选取chmp2a基因中较短内含子为3号内含子(碱基数为75)，较长内含子为2号内含子(碱基数为1608)。本发明的试剂盒的组成如表1所示，本发明的试剂盒中的扩增引物与探针序列如表2所示。其中，扩增引物1和扩增引物2能够退火至与chmp2a基因中3号内含子相邻的两个外显子的核酸序列。表1试剂盒的组成。表2扩增引物与探针的序列实施例2本实施例描述了采用实施例1所述试剂盒对含有核酸的样本中dna与rna同时定量的方法，即实施例1所述试剂盒的使用方法。本实施例所述方法采用的设备为荧光定量pcr仪，具体步骤如下：首次使用前的试剂预处理：将2管50×primer&probemix分别加入2×preqcdna与2×preqcrna中混匀，标记为2×preqcdnamix与2×preqcrnamix。1)根据下表3和4，配制并混匀试剂：表3无反转录的定量pcr体系组分体积2×preqcdnamix5.0μl无核酸酶去离子水4μl待检核酸样本1μl总体积10.0μl表4反转录定量pcr体系组分体积2×preqcrnamix5.0μl无核酸酶去离子水4μl待检核酸样本1μl总体积10.0μl2)瞬时离心，上机程序如下表5表53)参数设置：以quantstudio3仪器为例，fam的阈值设置为20000，vic的阈值设置为10000。实施例3本实施例描述了对一批临床肿瘤组织样本的核酸进行质量评估过程：样本为244个肿瘤组织提取的总核酸，分别用实施例1所述试剂盒测量定量pcr值，及使用thermofisher公司生产的qubit定量dna及rna。核酸被用于以rna及dna为模版的单端锚定法靶向ngs建库，其检测范围包括一个在各类型组织中含量丰富且表达稳定的基因做为内参。该基因的扩增子从一个外显子的边缘区开始，用毗连内含子的测序读数测量来自dna模版的信号，用位于内含子另一端的外显子的测序读数测量来自rna模版的信号，以两个信号的比值衡量ngs建库的rna检测质量。将反转录定量pcr的外显子探针与内含子探针的ct差值(x轴,rt_vic-rt_fam)与ngs测序内参基因rna对dna读数比例(y轴,ngs:rna2dna)作图，结果如图2所示。数据采集自244个临床样本的ngs文库并排除数据不齐的样本。图2中，ngs内参基因rna对dna读数比例在0.3以上(纵实线右侧)可认为rna的检测质量较好。由图2可见，当rt_vic与rt_fam差值低于-0.5时(横虚线下方)大部分样本落在纵实线右侧，且ngs内参基因完全无rna读数的样本点(图中椭圆虚线圈出)全部位于横虚线的上方或边界而被判断为核酸不合格，说明其可做为ngs检测质量的先导质控指标。将反转录定量pcr与无反转录定量pcr的外显子探针的ct差值(x轴,rt_vic-nr_vic)与ngs测序内参基因rna对dna读数比例(y轴,ngs:rna2dna)作图，结果如图3所示。数据采集自244个临床样本的ngs文库并排除数据不齐的样本。ngs内参基因rna对dna读数比例在0.3以上(纵实线右侧)可认为rna的检测质量较好。由图3可见，当rt_vic与nr_vic差值低于-0.5时(横虚线下方)大部分样本落在纵实线右侧，且ngs内参基因完全无rna读数的样本点(图中椭圆虚线圈出)全部位于横虚线的上方或边界而被判断为核酸不合格，说明其可做为ngs检测质量的先导质控指标。将使用qubit定量的rna与dna浓度的比例(x轴,qubit:rna/dna)与ngs测序内参基因rna对dna读数比例(y轴,ngs:rna2dna)作图，结果如图4所示。数据采集自244个临床样本的ngs文库并排除数据不齐的样本。ngs内参基因rna对dna读数比例在0.3以上(纵实线右侧)可认为rna的检测质量较好。由图4图可见，图中无法作出一条横线使得其上方的大部分样本相对下方的大部分样本落于纵实线右侧，且ngs内参基因完全无rna读数的样本点(图中椭圆虚线圈出)散布于y轴向而不能判断核酸是否合格，说明仅靠rna与dna浓度的比例定量而不考虑核酸质量无法做为ngs检测质量的先导质控指标。将使用qubit定量的rna浓度(x轴,qubit:rna(ng/ul))与ngs测序内参基因rna对dna读数比例(y轴,ngs:rna2dna)作图，结果如图5所示。数据采集自244个临床样本的ngs文库并排除数据不齐的样本。ngs内参基因rna对dna读数比例在0.3以上(纵实线右侧)可认为rna的检测质量较好。由图5可见，图中可见无法作出一条横线使得其下方的大部分样本落于纵实线右侧，且ngs内参基因完全无rna读数的样本点(图中椭圆虚线圈出)散布于y轴向而不能判断核酸是否合格，说明仅靠rna浓度定量而不考虑核酸质量无法做为ngsrna检测质量的先导质控指标。对选取的三个样本进行分析，结果如表6所示。由表6可见，三个样本的qubit定量均正常：qubit:rna/dna>1,qubit:dna>10ng/ul,qubit:rna>10ng/ul。然而前两个文库l18-00149t与l18-00152t的ngsrna检测效果良好(ngs:rna/dna>1),第三个文库l18-00194t的ngsrna检测效果不佳(ngs:rna/dna＝0.14)，说明ngs与qubit定量不吻合，而与本方法测量结果吻合：前两个文库的rt_vic-rt_fam与rt_vic-nr_vic值均低于设定的阈值(-0.5)，第三个文库的rt_vic-rt_fam与rt_vic-nr_vic值均高于-0.5。表6最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>深圳恒特基因有限公司<120>一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成<400>1cactcaagtccaacaactcga21<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2gccgctcaaactccatcatg20<210>3<211>21<212>dna<213>人工合成<400>3tcccccttcccactcccacga21<210>4<211>25<212>dna<213>人工合成<400>4ccatggccttggtgacacccttcat25当前第1页12