去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体及其应用的制作方法

本发明涉及改性化合物，具体是一种治疗心衰传统药物去乙酰西地兰化学改性得到新化合物，并经脂质体剂型改造后在抗癌中的应用，即将去乙酰西地兰化学改性成去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物(2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰西地兰)并制备成肝靶向脂质体在抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
：在全世界常见癌症中，肝癌发病率排名第七，中国的发病例超过全球总数的50％，尽管采取了包括肿瘤切除、肝脏移植,索拉非尼和局部治疗(射频消融术)等治疗方法，肝癌的死亡率仍未见下降，因此，研发高效低毒抗肝癌药物意义重大。强心苷是一类具有选择性强心作用的药物，其分子由一个醇基或醇样基团(配基、苷元或甙元)结合于数量不等的糖分子而构成。若配基中含固醇核(甾核)，其17位碳原子连以一个不饱和内酯环,其3位碳原子与糖分子相连，这种苷即为强心苷。其种类繁多，包括植物来源和脊椎动物来源。强心苷能与真核细胞膜钠钾atp酶特异性结合，用于治疗充血性心力衰竭与心律失常等疾病已有200多年历史。近年来，强心苷类化合物在预防与治疗肿瘤方面越来越被重视。更为乐观的是，目前许多研究证实了它具有对恶性肿瘤细胞优先选择性杀伤作用，即不影响正常细胞的增殖。鉴于这点，使强心苷成为一种靶向治疗肿瘤的新型药物变为可能。体外实验发现强心苷对啮齿类动物肿瘤细胞无效。同样，一直以来很难证明同基因的这些动物体内是如何对这些强心苷类化合物发挥作用的。然而，越来越多的研究证实了强心苷对人类肿瘤细胞株极其敏感。比如哇巴因和布法林。hanke-qi等建立人类肝癌细胞株(bel-7402)原位移植裸鼠模型，并给予布法林腹腔治疗。他们发现这种蟾蜍衍生物的强心苷使肿瘤体积明显减少，并且延长动物寿命，初步病理研究也未发现心、肺、脑、和肾脏的损伤。关于半合成烯内酯unbs-1450治疗原位移植性非小细胞肺癌(a549)动物是一项有趣的报告。unbs-1450是以非洲植物大牛角瓜提取物为原料通过半人工合成的强心苷类化合物。mijatovict等对移植性非小细胞肺癌动物模型进行长期口服unbs-1450,疗效显著。此外，体外实验证明了地高辛抑制人类神经纤维瘤细胞生长。并且在体内动物实验中，也成功减小移植到小鼠的肿块。研究发现强心苷能通过复杂的细胞信号转导机制用于恶性疾病的预防或治疗。mijatovict等对强心苷进行了化学结构上的修饰，成功去除了强心苷对心肌的作用，发现无强心活性的这些化合物引发t淋巴母细胞呈时间依赖性凋亡。强化了抗肿瘤细胞活性。但对于外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmc)影响甚微。使强心苷有望被改造为无心脏毒性的特异性抗肿瘤药物成为现实。作为传统强心药物的强心苷和已知的的化疗药物如紫杉醇、卡铂、阿霉素、长春新碱和环磷酰胺等具有不同的抗癌机制，如果能与这些化疗药物合用可能产生协同、减轻不良反应甚至抵抗细胞耐药的效果。即使目前尚处于体外或动物实验阶段，但其今后，用于肿瘤的治疗前景毋庸置疑的乐观。近期研究发现，西地兰与肿瘤坏死因子合用有抗脑胶质母细胞瘤作用，在体外有抗肝癌作用与抑癌基因pten状态及通过蛋白激酶cδ引起细胞凋亡有关，我们早期研究工作中发现，强心苷类药物去乙酰西地兰(英文名：deslanoside，又名：去乙酰毛花苷,去乙酰毛花苷丙)在体外有较强选择性的抗肝癌作用，对smmc-7721人肝癌细胞(半数抑制浓度)ic50为0.18μg/ml,对人正常人肝细胞系lo2的ic50为75.70μg/ml，相差420倍。但是去乙酰西地兰(西地兰)在体内可经水解失去葡萄糖和乙酸，而成几乎无抗肝癌作用的地高辛，使去乙酰西地兰的体内抗癌活性效价降低及维持作用时间(时效)缩短。此外，由于强心苷类化合物普遍存在的心脏毒性导致其抗癌应用风险较大。技术实现要素：本发明的目的是针对去乙酰西地兰在体内可经水解失去葡萄糖和乙酸，成为几乎无抗肝癌作用的地高辛的不足，而提供一种去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体及其应用。通过合成去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物(2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰西地兰等)，以加强此类化合物的抗癌作用，提高效价强度，延长半衰期，同时将改性化合物制备成脂质体，提高其肝靶向作用，减少心脏毒性。本发明的目的之一是：公开一种去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物(2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰西地兰等)的合成方法。本发明的目的之二是：公开去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体制剂的制备方法。本发明的目的之三是：公开去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体制剂在抗肝癌药物中的应用。本发明所述去乙酰西地兰的结构式为：由于去乙酰西地兰的葡萄糖基容易被酶水解掉，水解成地高辛从而失去相关活性，并且地高辛剧毒，所以维持葡萄糖基的稳定变得很重要。由于去乙酰西地兰的活性和分子结构密切相关，设想在保持分子主体结构不变的情况下进行部分结构的修饰改造，从而达到维持葡萄糖基稳定存在以保持或者提高分子活性为目的。我们主要从葡萄糖基进行改造，以葡萄糖和2-氨基葡萄糖为原料进行分子的部分修饰再与地高辛的末端3-位羟基相连接生成去乙酰西地兰的葡萄糖基改性产物，在活性导向下选择合乎要求的分子。本发明，去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物的合成，以2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰西地兰的合成为例进行具体说明：(1)2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰西地兰的结构式为：(2)合成路线如下：(3)具体合成步骤如下：①化合物1的合成：冰浴下，在一装有干燥管的干燥反应瓶中加入甲醇140毫升，乙酰氯2.4毫升，搅拌5分钟后自然搅拌升温至室温搅拌20分钟，加入葡萄糖10克(54.6mmol)，加热至回流反应2小时。冷却反应液至室温，加入无水碳酸钾中和至中性，过滤，浓缩得到化合物1(1-o-甲基糖苷)的粗产品；②化合物2的合成：将所得的化合物1粗产品溶解于34毫升dmf中，滴加苯甲缩醛16毫升(105.2mmol)，迅速加入对甲苯磺酸1.72克(9mmol)，50℃反应过夜，tlc显示反应完全，将反应物倒入100毫升冰水与140毫升石油醚的混合液中，剧烈震荡，乳白色固体析出，抽滤，无水乙醇重结晶得到化合物2；③化合物3的合成：将得到的化合物2、bu2sno14克(44.8mmol)和甲苯180毫升加入装有分水器的圆底烧瓶中，回流反应3-4小时至无水分出为止，浓缩反应液至60毫升，加入无水dmf30毫升，滴加7毫升(58.4mmol)溴化苄，100-110℃反应5-6小时，tlc检测反应完毕，反应物用乙酸乙酯100毫升稀释，依次用适量水，饱和盐水，各洗涤2-3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，经硅胶柱层析纯化(石油醚和乙酸乙酯混合洗脱)，得到化合物3；④化合物5的合成：将所得化合物3，浓硫酸0.3克，醋酸90毫升，醋酸酐30毫升室温搅拌反应30分钟-1小时，tlc监控反应完毕，得到化合物4；再加入溴乙酰11毫升，甲醇7毫升，避光反应2小时；反应混合物用二氯甲烷200毫升稀释，依次用适量水，饱和碳酸氢钠溶液，饱和盐水各洗涤2-3次，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到化合物5粗品；⑤化合物7的合成：将0.97克(5mmol)地高辛化合物6，0.17克(5mmol)二苯基氯化锡溶解于100毫升乙腈中，室温避光搅拌反应10分钟；加入1.74克(7.5mmol)氧化银，0.7克(3.75mmol)55'-二甲基-2,2’-联吡啶，称重3克(7.5mmol)步骤④得到的化合物5一起加入反应体系，35℃激烈搅拌24小时，反应混合物冷却至室温，用1毫升饱和氯化铵水溶液淬灭反应体系，氯仿:丙酮＝1:1稀释,过滤掉不溶解的盐类残余物，溶液减压浓缩，残余物经过柱层析得到化合物7的乙酰物，将乙酰物溶解于140ml甲醇中，加入40g甲醇钠室温处理得到化合物7。本发明，去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体注射剂的制备，包括(1)去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体微囊制备采用反向滴定法制备胶囊，称取100mg的改性化合物7与18mg/ml浓度的海藻酸钠溶液20ml混合均质，用容器抽取，逐滴滴入40ml含有37mg/ml的cacl2溶液的烧杯中，20分钟后抽滤，洗涤，冷冻干燥后得到补体抗体微囊，最大胶囊包封率达到70％。中试及工业生产时按比例放大。(2)改性化合物脂质体微囊注射剂的制备将改性药物脂质体微囊加10％乙醇溶解，配成0.1mg/1ml浓度，过滤除菌，按每支1ml手工或机械灌装，封盖，遮光，密闭保存。本发明的优点在于：1、在体外实验中，去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物与西地兰对肝癌细胞毒性相当，但比常用药物5氟尿嘧啶的效价强度高100倍以上，而对正常细胞毒性较低；2、在体内动物实验中，去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物与西地兰比较，对肝癌的抑制率明显增强；因为去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物不易在肝脏被酶水解成没有抗癌作用的地高辛，从而明显延长抗癌时效。3、在心脏毒性评价体内动物实验中，去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物制备成脂质体后，与去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物比较，提高了对肝脏的靶向性，降低强心苷类化合物的心脏毒性，减少心律失常的发生，显著提高药物的治疗指数。通过实验，证明去乙酰西地兰葡萄糖基改性化合物将是一种较理想的高效低毒的抗肝癌药物。附图说明图1为实施例2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰脂质体心脏毒性实验，小鼠给药后单位时间内心率变化与心律失常发生情况心电图；图中，a：a组心电图；b：b组心电图；c：c组心电图。具体实施方式下面通过建立体外细胞培养及体内动物模型开展上述药物体内外抗癌实验，实验方法包括如下步骤：①进行癌细胞与正常细胞的培养；②进行去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物及西地兰体外抗癌及对正常细胞的毒性比较实验；③建立肝癌裸鼠动物模型，开展去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体与西地兰脂质体的体内抗癌比较实验；④乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物脂质体与西地兰心脏毒性评价。1.体外抗癌实验将人肿瘤细胞株培养于dmem培养基(含10％灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，人正常肝细胞系hl-7702培养于rpmi1640培养基(含20％灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。六种细胞株均置于37℃、5％的co2饱和湿度培养箱中培养，两到三天换液并传代一次，取对数生长期细胞用于实验。mtt法检测抗癌药物对肿瘤细胞增殖活性的效应。取对数生长期的细胞，以1×104/k孔的密度接种于96孔板，每孔180μl。试验设阴性对照组(pbs)、阳性对照组(5-fu)(终浓度为10-1mmol/l)、不同浓度(2×10-2，4×10-3，8×10-4，1.6×10-4，3.2×10-5mmol/l)的药物组，每组设5个复孔，37℃、5％co2饱和湿度孵箱内培养过夜，分别加入药物溶液20μl(终浓度为2×10-2，4×10-3，8×10-4，1.6×10-4，3.2×10-5mmol/l)，加入药物后培养48h，每孔加入mtt液(5mg/ml)20μl，培养4h后，吸弃培养液，每孔加入150μldmso，轻度振荡10min，溶解结晶，置酶标仪490nm波长处测od值，按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(％)＝[1-(药物处理组/阴性对照组)]×100％。药物处理组：含有细胞的培养基、mtt、药物；阴性对照组：含有细胞的培养基、mtt、pbs；空白组：不含细胞和药物的培养基、mtt；实验重复3次。2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰及去乙酰化西地兰体外抗人肝癌细胞(hepg2)及对正常肝细胞的作用结果见表1，表2：表1.2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰(a)及去乙酰化西地兰(b)体外抗人肝癌细胞(hepg2)作用结果(n＝5)注：*p<0.05，与pbs对照组比较；#p>0.05，a组与b组比较。表2.2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰(a)及去乙酰化西地兰(b)体外对人正常肝细胞(hl-7702)作用结果(n＝5)注：*p>0.05，a组、b组与pbs对照组比较；#p>0.05，a组与b组比较。2.体内抗肿瘤实验将人肝癌细胞(hcclm3)常规培养48小时，用pbs配成5×106备用。18～20g裸鼠(balb/c-nu广东实验动物中心提供)，无菌条件饲养一周，采用5×106hcclm3细胞裸鼠背部0.1ml/只皮下接种造模，待瘤块长至0.5cm左右开始分组给药，动物分为3组；对照组(pbs组)、2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰西地兰组(a)(1.0mg/kg)，及西地兰组(b)(1.0mg/kg)腹腔给药，每天进行腹腔给药1次，给药9次，于实验第10天麻醉处死动物，取出肿块电子天枰称重。统计方法：末次给药后次日处死小鼠，称取体重后，剥瘤称重，计算抑瘤率(inhibitionrate,ir)，ir(％)＝(对照组均瘤重－给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。应用spss17.0软件对所有数据进行统计学处理，结果以均数±标准差表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，p＜0.05为有显著性差异。数据分析：肿瘤平均体积以±s表示，结果见表3：表3.2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰(a)及去乙酰化西地兰体(b)对小鼠皮下种植性肝癌细胞肿瘤的影响组别剂量(mg/kg)动物数量(n)肿瘤重量(g)抑瘤率(％)pbs组--100.34±0.23--a1.0100.11±0,0267.64*#b1.0100.19±0.0544.10*注：*p<0.05与pbs组相比较；#p<0.05与b组相比较。说明：在体内动物实验中，去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物(a)与去乙酰化西地兰(b)对肿瘤均有抑制作用，而(a)对肝癌抑制率明显强于(b)。其原因是：在体内，去乙酰化西地兰的葡萄糖基容易被酶水解掉，生成地高辛从而失去相关抗癌活性，而去乙酰化西地兰葡萄糖基改性化合物(a)通过改性，得以维持葡萄糖基的稳定而保持其抗癌活性的稳定性。3.2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰脂质体心脏毒性实验选spf级18-20g昆明种小鼠30只，雌雄兼用(桂林医学院spf动物室提供)，分为三组，正常对照组(a)；2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰脂质体给药组(b组)，2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰组(c组)，每组10只,于安静、室温22-26℃实验室条件下，戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉，取小鼠仰位固定，待小鼠安定后腹腔注射给药2mg/kg，给药后10分钟开始用心电图仪(单导程ecc-11a型、频响范围0～90hz；纸速为50mmps,标准ii导联)记录小鼠心电图10分钟，计算心律失常出现次数，结果以均数±标准差表示，两组间均数比较用t检验，结果见表4，图1；表4.小鼠给药后单位时间内(10分钟)心率变化与心律失常发生情况注：*p<0.05，b组与c组相比较，说明，将2-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖苷-去乙酰化西地兰制成脂质体后，提高了其肝脏靶向性，减少了心脏毒性。图1中，图a：a组心电图；图b：b组心电图，心率略为减慢，节律正常，未发现心律失常；图c：c组心电图，心率明显减慢，图中所见有房室传导阻滞，p-q间期延长，qrs-t波消失，有明显房室传导阻滞性心律失常。当前第1页12