本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是涉及一种黄曲霉毒素b1半抗原及其制备方法、人工抗原及其应用。
背景技术：
黄曲霉毒素b1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。黄曲霉毒素(b1、b2、g1、g2)是一群结构相似，由黄曲霉、寄生曲霉和a.nomius产生的剧毒化合物。以黄曲霉毒素b1的毒性最强。黄曲霉毒素可导致癌症，主要是引起肝脏、肠、肺和胸部的病变。这些真菌产生于热带和亚热带的食品、饲料以及他们的原料中，主要污染谷类、米、玉米、豆类、树坚果及花生等。
欧盟规定用于动物饲料或人类直接食用产品的黄曲霉毒素的最高残留限量为2μg/kg。对于儿童食品、婴幼儿加工谷物基础以及婴儿营养食品，最高残留限量设定为0.1μg/kg；我国在饲料领域的检测限在4-40μg/kg不等。
黄曲霉毒素b1的检测是农产品质量安全检测的一个重要指标，传统的黄曲霉毒素的主要检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱-荧光检测法(hplc-fd)，以及高效液相色谱-质谱检测法(hplc-ms)，上述方法均存在检测限太低，敏感性和特异性低，设备操作复杂等问题，再者，敏感性、特异性较低另外一个原因是传统的黄曲霉毒素b1人工半抗原在构建时，大多破坏了黄曲霉毒素b1的官能团的结构特征，后续无法发挥出人工抗原的最佳构效优势，很难得到特异性强的抗体。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种最大程度保留官能团结构特征的黄曲霉毒素b1半抗原。
一种黄曲霉毒素b1半抗原，所述黄曲霉毒素b1半抗原的化学结构式(ⅰ)如下：
上述黄曲霉毒素b1半抗原为人工构建的新型黄曲霉毒素b1半抗原，该抗原最大程度保留了黄曲霉毒素b1的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的黄曲霉毒素b1人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。
本发明还提供一种黄曲霉毒素b1半抗原的制备方法，其包括如下步骤：在避光条件下，将黄曲霉毒素b1与乙烯酸反应，得到所述黄曲霉毒素b1半抗原。
上述制备方法简单，在避光条件下，将乙烯酸加入黄曲霉毒素b1中反应制备人工半抗原，该方法不会对黄曲霉毒素b1分子抗原决定簇的结构造成不利影响，抗原决定簇的可以最大程度的外露，进而高效产生对应抗体。
其中一个实施例中，所述黄曲霉毒素b1与所述乙烯酸的质量比为3-4:1-2。
本发明还提供一种黄曲霉毒素b1人工抗原，所述人工抗原为本发明一实施例所述的黄曲霉毒素b1半抗原与第一载体蛋白的偶联物。
其中一个实施例中，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白。
本发明还提供一种黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒，其包括采用本发明一实施例所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。
其中一个实施例中，所述黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括包被有包被原的酶标板。
其中一个实施例中，所述包被原包括本发明所述的黄曲霉毒素b1半抗原与第二载体蛋白的偶联物。
其中一个实施例中，所述黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括黄曲霉毒素b1酶标二抗。
本发明还提供一种黄曲霉毒素b1的检测方法，其包括如下步骤：
将待测样本进行前处理；
用本发明任意实施例所述的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测；以及
分析检测结果。
本发明黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例提供了一种新型的黄曲霉毒素b1半抗原，所述黄曲霉毒素b1半抗原的化学结构式(ⅰ)如下：
黄曲霉毒素b1的相对分子质量为312.27，为小分子物质，小分子物质在免疫反应中，只具有反应原性不具备免疫原性，需要与大分子载体蛋白才具有免疫原性，才能刺激机体发生免疫应答，从而产生抗体。
上述黄曲霉毒素b1半抗原为人工构建的新型黄曲霉毒素b1半抗原，该抗原最大程度保留了黄曲霉毒素b1的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的黄曲霉毒素b1人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。
本发明一实施例还提供了一种黄曲霉毒素b1半抗原的制备方法，其包括如下步骤：在避光条件下，将黄曲霉毒素b1与乙烯酸反应，得到所述黄曲霉毒素b1半抗原。
在其中一个实施例中，所述黄曲霉毒素b1与所述乙烯酸的质量比为3-4:1-2。进一步地，所述黄曲霉毒素b1与所述乙烯酸的质量比为3.14:1.60。
在其中一个实施例中，黄曲霉毒素b1的制备方法包括如下步骤：称取黄曲霉毒素b1，溶于6ml乙腈中，然后加入1.60g的乙烯酸，室温避光反应2h，得到烯醇醚衍生物，即黄曲霉毒素b1半抗原，反应式如下：
上述黄曲霉毒素b1半抗原为人工构建的新型黄曲霉毒素b1半抗原，该抗原最大程度保留了黄曲霉毒素b1的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的黄曲霉毒素b1人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。
本发明一实施例还提供一种黄曲霉毒素b1人工抗原，所述人工抗原为本发明一实施例所述的黄曲霉毒素b1半抗原与第一载体蛋白结合的偶联物。
在其中一个实施例中，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白(cbsa)。
上述黄曲霉毒素b1人工抗原的抗原决定簇可以最大程度的外露，进而有利于高效得产生对应抗体。
在其中一个实施例中，人工抗原的制备方法如下：
s1、分别称取乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(edc)20.0mg、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)11.6mg，将两者溶解于0.5ml的水中，得到混合液a，取1ml黄曲霉毒素b1半抗原，逐滴加入到混合液a中，得到溶液b。
s2、制备活化牛血清白蛋白(cbsa)溶液：
将100μl10％的乙二胺、5mg的nhs和5mg的edc加入2ml溶有10mgbsa的0.02mol/lph7.4的pb中，室温搅拌6h。用0.02mol/lph7.4的pb完全透析，得到4ml的cbsa溶液。
s3、在cbsa溶液中，滴加溶液b，然后在4℃下缓慢搅拌反应20h，得到产物。
s4、将产物用0.01mol/l的pbs(ph7.2)溶液在4℃下透析72h，得到黄曲霉毒素b1人工抗原，即为免疫原。
其中，cbsa为蛋白bsa与乙二胺联结而得到。将乙二胺联结到载体蛋白bsa上，这样大大增加载体蛋白的游离氨基数目，该方法可以大幅度提高抗体的成功获取率。
本发明还提供一种黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒，其包括采用本发明所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。
所述抗体优选为一抗工作液，具体的，所述一抗工作液的制备方法包括：以所述黄曲霉毒素b1人工抗原为免疫原免疫动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到黄曲霉毒素b1单克隆抗体，再将单克隆抗体按照一定比例稀释成稀释液，即得到一抗工作液。优选地，免疫动物为balb/c小鼠。可以理解，本发明的一抗工作液采用本领域常规的单抗制备方法即可，将末次免疫后血清效价为1:10000以上的实验balb/c小鼠处死，分离血清，制备好后分装冻存。
本发明提供的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括：包被有包被原的酶标板。
在其中一个实施例中，所述包被原包括本发明一实施例所述的黄曲霉毒素b1半抗原与第二载体蛋白的偶联物。也即本发明的黄曲霉毒素b1半抗原与第二载体蛋白结合的偶联物。具体地：包被有包被原的酶标的制备方法为：用0.05mol/lph9.6的碳酸盐(cbs)缓冲液按照1:40000将包被原稀释，然后按照100ul/孔加入酶标板中，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗液300ul/l孔，洗板2次，30s/c次，然后加入0.5％牛血清白蛋白(bsa)封闭，150ul/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
在其中一个实施例中，所述第二载体蛋白为卵清蛋白。第一载体蛋白与第二载体蛋白的种类不同，有助于进一步地提高所述黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒反应的特异性。
可以理解的是，本发明提供的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括黄曲霉毒素b1酶标二抗，优选地，黄曲霉毒素b1酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液。
在其中一个实施例中，本发明提供的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括底物液a、底物液b、终止液。具体地，所述底物液a为含有0.5mmol/l的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液b为含有0.03％四甲基联苯二胺的柠檬酸溶液，所述终止液为2mol/l的硫酸溶液。
在其中一个实施例中，本发明提供的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括10×浓缩稀释液和10×浓缩洗涤液，10×浓缩稀释液为0.1mol/l的pbs，ph值范围为7.0-7.5；10×浓缩洗涤液为0.01mol/l的pbst，且含0.5％吐温-20，ph值范围为7.0-7.5。
进一步地，本发明提供的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒还包括黄曲霉毒素b1标准品，优选地，标准品的浓度分别为0μg/l、0.05μg/l、0.15μg/l、0.45μg/l、1.35μg/l、4.05μg/l。
本发明还提供一种黄曲霉毒素b1的检测方法，其包括如下步骤：
s1、将待测样本进行前处理。
待测样本可以为食用油、花生、谷物、酱油、醋或饲料。
s2、用本发明一实施例中所述的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测。
在其中一个实施例中，步骤s2中用黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测是指向包被了包被原的酶标板中加入标准品或待测样本(50μl)至对应的微孔中，再加入黄曲霉毒素b1酶标一抗工作液和黄曲霉毒素b1酶标二抗工作液，轻轻震荡均匀，之后盖板、洗板、加入底物液a，再加入底物液b、轻轻震荡均匀，用盖板膜盖板后，置室温避光环境中反应，加入终止液，测定每孔od值。
s3、分析检测结果。
百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即：
b-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
b0-0(μg/kg)标准溶液的平均吸光度值
标准曲线的绘制和计算方式如下：以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素b1标准品浓度(μg/kg)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素b1实际含量。
本发明黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒的检测基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理：在包被有包被原的酶标板上加入待测样本溶液，随后加入黄曲霉毒素b1酶标一抗工作液和黄曲霉毒素b1酶标二抗工作液，待测样本溶液中残留的黄曲霉毒素b1与酶标板上包被的包被原竞争一抗，与一抗结合的包被原所形成的抗原-抗体结合物再与酶标二抗工作液进一步结合反应后，加入底物液a、底物液b，酶标二抗上的辣根过氧化物酶与底物液a、b反应呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色，显色的深浅与样品或标准品中黄曲霉毒素b1的含量成负相关，再与标准曲线比较即可得出待测样本溶液中黄曲霉毒素b1的含量。该方法可直接用于检测饲料中黄曲霉毒素b1的含量。
本发明各实施例的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
试验设备：
┅┅微孔板酶标仪450/630nm
┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置
┅┅均质器
┅┅振荡器
┅┅离心机
┅┅涡旋仪
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅玻璃管：10ml
┅┅聚苯乙烯离心管：2ml、50ml
┅┅微量移液器：单道20～200ml、100～1000ml、多道250ml
试验试剂：
┅┅乙腈(分析纯)
┅┅甲醇(分析纯)
┅┅三氯甲烷(分析纯)
┅┅正己烷(分析纯)
┅┅去离子水
96孔酶标板×1块(包被有偶联抗原)
标准品溶液的制备
将黄曲霉毒素b1溶于ph7.2的0.01mol/l的磷酸盐缓冲溶液中，分别得到浓度为0.05μg/l、0.15μg/l、0.45μg/l、1.35μg/l、4.05μg/l的标准品溶液，将ph7.2的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液作为标准品溶液的阴性对照液，即为0μg/l黄曲霉毒素b1标准品溶液。
溶液的配置：
配液1：复溶工作液
浓缩复溶工作液配置：将0.2m的na2hpo4溶液81ml与0.2mnah2po4溶液19ml混合，再加入17.0gnaci，加蒸馏水至1000ml。
用去离子水将2×浓缩复溶工作液按1：1体积比进行稀释用于样本的复溶，即1份2×浓缩复溶液配1份去离子水以进行稀释，复溶工作液在4℃环境可保存一个月，得到复溶工作液。
配液2：洗涤液
用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释用于酶标板的洗涤，即1份20×浓缩洗涤液配19份去离子水以进行稀释，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
样本前处理：
(a)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
(b)实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
(c)移取离心后的上清液时，需将离心管稍微倾斜移取，避免取到杂质。
(d)花生样本移取上层液吹干时尽量避免取到油珠，以免对检测结果造成影响。
(e)黄豆粉样本复溶时会有一定的乳化现象，应避免剧烈涡动。
(f)处理后的样本不能长时间保存，应立即点样分析。
(一)食用油样本前处理方法，其中，食用油包括花生油、调和油、玉米油、豆油等。
移取200μl样本至2ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml复溶工作液，即上述配液1，加入0.5ml正己烷，用振荡器振荡5min，3000rpm室温离心5min，除去上层正己烷相，取下层50μl用于分析。其中，室温为20-25℃。
(二)花生样本前处理方法，其中，花生包括生花生、熟花生、盐花生等。
用均质器均质花生样本，称取2.0g均质后的花生样本至50ml聚苯乙烯离心管中，依次加入3ml乙腈和3ml去离子水，用振荡器振荡5min，3000rpm室温离心5min，其中，室温为20-25℃。移取3ml上层有机相至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4.5ml三氯甲烷，用振荡器振荡5min，3000g室温(20-25℃)离心5min，除去上层液体，取3ml下层有机相至10ml洁净干燥玻璃管中，于60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，加入1ml复溶工作液(见配液1)，用涡旋仪涡动30s，3000rpm室温(20-25℃)离心5min，除去上层正己烷相，取下层50μl用于分析。
(三)谷物样本(黄豆粉、大米粉、玉米粉、面粉等)前处理方法
用均质器均质谷物样本，称取2.0g均质后的谷物样本至50ml聚苯乙烯离心管中，依次加入4ml乙腈和2ml去离子水，用振荡器振荡5min，3000rpm室温离心5min，其中，室温为20-25℃。移取3ml上层清液至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml三氯甲烷，用振荡器振荡5min，3000rpm室温(20-25℃)离心5min，除去上层液体，取4ml下层有机相至10ml洁净干燥玻璃管中，于60℃水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，加入1ml复溶工作液(见配液1)涡动30s，3000rpm室温(20-25℃)离心5min，除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析。
(四)酱油样本前处理方法
移取500μl酱油样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4.5ml乙腈，用涡旋仪涡动1min，3000rpm室温离心5min，其中，室温为20-25℃。移取1ml上层有机相至10ml洁净干燥玻璃管中，于60℃水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥的残留物，再加入1ml复溶工作液(见配液1)，用涡旋仪涡动30s，混匀，转入2ml聚苯乙烯离心管中，3000rpm室温(20-25℃)离心5min，除去上层有机相，移取下层水相100μl至2ml聚苯乙烯离心管中，加入900μl复溶工作液(见配液1)，用涡旋仪涡动30s，取50μl用于分析。
(五)醋样本前处理方法
移取200μl醋样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml去离子水，用涡旋仪涡动1min，3000rpm室温离心5min，其中，室温为20-25℃。移取500μl至2ml聚苯乙烯离心管中，加入500μl复溶工作液(见配液1)，用涡旋仪涡动30s，取50μl用于分析。
(六)饲料(原料、配合料和浓缩料)样本前处理方法
称取2.0g饲料样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入20ml甲醇，用振荡器振荡5min，3000rpm室温离心5min，其中，室温为20-25℃。移取100ml上清液加入900ml复溶工作液(见配液1)，用振荡器振荡1min，混匀，取50μl用于分析。
黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒的检测方法：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20225℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的酶标板(含包被原)，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。该步骤中切勿冷冻。
3、洗涤液在使用前也需置于室温中平衡。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、分别加标准品、样本各50μl/孔到对应的微孔中，再加入黄曲霉毒素b1酶标一抗工作液和黄曲霉毒素b1酶标二抗工作液各50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液(配液2)250μl/孔，充分洗涤425次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；进一步地，拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破。
7、显色：加入底物液a液50μl/孔，再加底物液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15min。
8、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm/630nm双波长检测，在5min内读完数据，测定每孔od值。
9、定量分析
百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即：
b-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
b0-0(μg/kg)标准溶液的平均吸光度值
标准曲线的绘制和计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素b1标准品浓度(μg/kg)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素b1实际含量。
样本稀释倍数：
食用油样本稀释倍数：5倍
花生样本稀释倍数：2倍
谷物样本稀释倍数：2倍
酱油样本稀释倍数：100倍
醋样本稀释倍数：100倍
饲料(原料、配合料和浓缩料)样本稀释倍数：100倍
试剂盒灵敏度包括方法灵敏度及方法的检测限，方法灵敏度为0.02μg/kg，线性相关系数为0.9999，
样品最低检测限:
食用油…………………………………………………0.1μg/kg
花生……………………………………………………0.2μg/kg
谷物……………………………………………………0.05μg/kg
酱油………………………………………………………2.0μg/kg
醋…………………………………………………………2.0μg/kg
饲料(原料、配合料和浓缩料)………………………2.0μg/kg
平均准确度：
食用油………………………………………………90.0％
花生…………………………………………………90.0％
谷物………………………………………………90.0％
酱油…………………………………………………90.0％
醋……………………………………………………90.0％
饲料(原料、配合料和浓缩料)…………………90.0％
精密度：试剂盒变异系数均小于10.0％。
黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒的特异性是通过相应的物质交叉反应试验来确定，结果如下：
分别配置黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2的标准品，按照黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒的检测方法中的步骤进行，按照如下公式：
计算交叉反应率，结果如下。
黄曲霉毒素b1………………………………………100.0％
黄曲霉毒素b2………………………………………81.3％
黄曲霉毒素g1………………………………………62.0％
黄曲霉毒素g2………………………………………22.3％
本发明的黄曲霉毒素b1酶联免疫试剂盒检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强且交叉反应小，平均准确度可达到90.0％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。