虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用。

背景技术：

虎(pantheratigris)是世界上公认的最濒危物种，被列为《华盛顿公约》cites附录ⅰ级保护动物，而在现存虎的6个亚种中，东北虎(pantheratigrisaltaica)分布于俄罗斯远东地区、中国东北东部林区和朝鲜北部，华南虎野外已功能性灭绝，现存的华南虎仅分布于中国动物园及一些圈养保育机构中，数量仅170多只，是世界最濒危的一个虎亚种。

近年来的一些研究表明，一些虎患有的细菌性、病毒性及寄生虫性疾病使野生东北虎和人工饲养的东北虎、华南虎、孟加拉虎和印支虎受到极大威胁，造成严重的损失，因此对这些疾病的防疫与治疗是不可忽视的。特别是华南虎，因其家族高度近亲，免疫能力低下，提高其非特异性免疫能力对于华南虎种群的健康具有重要的意义。

干扰素(interferon，ifn)是一种在特定诱生剂的作用下由单核细胞和淋巴细胞产生的具有抗病毒繁殖及免疫调节等功能的蛋白质。干扰素可分为ⅰ型、ii型和ⅲ型。ⅰ型干扰素又称病毒干扰素或白细胞干扰素，包括α、β、ω、κ、τ、δ、ξ等，主要功能是抑制病毒增殖。ii型干扰素又称免疫干扰素，只有ifn-γ一个成员，主要起免疫调节的作用。ⅲ型干扰素包括ifn-λ或il-28/29，在防御和治疗感染方面，对固有免疫和适应性免疫起重要作用。免疫干扰素gamma干扰素(ifn-γ)起免疫调节作用，对于提高华南虎等虎的免疫能力，抵抗病毒等病原微生物的感染具有重要的作用。

迄今为止，哺乳动物的ifn-γ的研究(尤其是人和猪的研究)已取得很多成果，但虎ifn-γ相关的研究尚处空白。由于至今还没有虎γ干扰素的产品问世，大多是使用猫干扰素来代替虎干扰素。然而猫和虎存在种属差异，其干扰素对虎的病毒性疾病的治疗效果并不是很显著，因而研究虎干扰素是非常有必要的。

现有仅发现有虎α干扰素的原核表达，然而α干扰素具有抗病毒的作用，与ifn-γ的免疫调节作用的机理是不一致的，不存在替代的作用，且虎为真核生物，毕赤酵母也为真核生物，重组虎ifn-γ基因的毕赤酵母其表达的蛋白更接近天然构象，活性更好，较之原核表达具有不可比拟的优势。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用，能够提供重组虎ifn-γ蛋白，可用于对虎病毒性疾病的治疗。

一种虎γ干扰素，包括如seqidno.1所示的氨基酸序列。

本发明还公开了一种编码上述的虎γ干扰素的表达基因，所述表达基因的序列为：

a)编码权利要求1的虎γ干扰素的核苷酸序列；或者

b)与a)的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a)的核苷酸序列不同的序列；或者

c)对上述a)或b)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

在其中一个实施例中，所述a)中的核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.3所示。

本发明还公开了一种ppic9k表达载体，包含上述的虎γ干扰素的表达基因。

在其中一个实施例中，该ppic9k表达载体包含seqidno.4所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种重组毕赤酵母，包含上述的ppic9k表达载体。

本发明还公开了一种上述的虎γ干扰素的制备方法，通过诱导虎外周淋巴细胞获得所述虎γ干扰素，或者通过基因工程生产所述虎γ干扰素。

在其中一些实施例中，通过诱导虎外周淋巴细胞获得所述虎γ干扰素，步骤如下：

取虎外周血，分离其中淋巴细胞，以50-150μg/ml刀豆素(concanavalina，cona)诱导，于co2培养箱中培养12-36h，使淋巴细胞分泌所述虎γ干扰素，即得；

或者

通过基因工程生产所述虎γ干扰素，步骤如下：

(1)获得虎γ干扰素的原始表达基因，去除该原始表达基因中的信号肽序列，并根据毕赤酵母的偏嗜性进行密码子优化，随后在5’端和3’端分别加上酶切位点，得到ifn-γ成熟蛋白基因片段，将上述ifn-γ成熟蛋白基因片段插入至ppic9k表达载体中，构建重组质粒ppic9k-ifn-γ；

(2)将上述重组质粒ppic9k-ifn-γ转入毕赤酵母中，通过筛选得到阳性重组毕赤酵母；

(3)培养、诱导上述重组毕赤酵母表达虎γ干扰素，即得。

在其中一个实施例中，通过基因工程生产所述虎γ干扰素，所述步骤(1)中，所述ifn-γ成熟蛋白基因片段的核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述步骤(2)中，采用内切酶noti将重组质粒ppic9k-ifn-γ线性化，转化至毕赤酵母感受态细胞，筛选得到阳性重组毕赤酵母；

所述步骤(3)中，所述培养的培养基为bmgy培养基；所述诱导的条件为：诱导温度为26-30℃，诱导时间为36-96h，每8-32h向培养基中加入甲醇至甲醇的终浓度为0.8-1.2％

本发明还公开了述的虎γ干扰素在制备用于增强虎免疫能力和/或抵抗病原微生物感染的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用，首先通过分离培养东北虎外周血淋巴细胞，cona诱导其分泌γ干扰素，从淋巴细胞中克隆获得虎γ干扰素。并且为了更好地利用基因工程技术来开发重组虎干扰素γ制剂，本发明中，还将去除信号肽序列的虎干扰素γ基因序列根据毕赤酵母的偏嗜性进行密码子优化，插入到ppic9k载体，构建成能分泌表达干扰素γ蛋白的重组表达载体，然后将其导入高效表达系统-毕赤酵母中。培养毕赤酵母，表达虎γ干扰素蛋白，为后续制备用于增强虎免疫能力和/或抵抗病原微生物感染的药物中提供坚实的基础。

附图说明

图1为实施例1中使用引物f1和r1pcr扩增ifn-γ的电泳结果图；

图2为实施例1中pcr扩增γ干扰素的6个退火温度梯度电泳结果图；

图3为实施例1中表达载体ppic9k的图谱；

图4为实施例1中表达载体ppic9k用ecori和noti进行双酶切的电泳图；

图5为实施例1中质粒线性化电泳图；

图6为实施例1中电转化后md平板菌落长势情况；

图7为实施例1中pcr筛选阳性克隆电泳图；

图8为实施例1中蛋白sds-page结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用原料除非特别说明外，均为市售购得。

实施例1

一种虎γ干扰素，通过以下方法制备：

一、东北虎外周淋巴细胞的分离和培养

采用cona诱导ifn-γ的产生，以天津灏洋公司的tbd虎外周血淋巴细胞分离液kit的分离淋巴细胞，具体步骤如下；

1、取东北虎(自养)静脉血3ml于抗凝管中，轻轻混匀。

2、取3mlkit中的稀释液与静脉血按照体积为1:1进行稀释，将混合液轻轻加入已加有3ml淋巴分离液的离心管，使得淋巴分离液：血液：稀释液的体积比为1:1:1。室温1800r/min离心30min。

3、吸取离心后产物中白色环状物部分于新的离心管中。加入洗涤液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min离心20min，弃上清；洗3-4次，即得淋巴细胞。

4、沉淀的淋巴细胞用含100μg/mlcona，10％小牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640培养基液悬浮，取10μl细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×10⁶个/ml，分装于6孔板中，在co2培养箱中37℃培养24h。

5、5000r/min离心2min收集细胞，该细胞即为诱导后产生虎γ干扰素的淋巴细胞。

二、虎ifn-γ基因序列的扩增

1、总rna提取。

取200μl上述实施例1收集的诱导培养后淋巴细胞，按axygen公司的dna/rna体液小量试剂盒提取rna，后反转录得cdna。

2、引物设计。

以猫序列为参考，根据genbank上feliscatμsifn-gammacompletecds(序列号：d30619.1)设计2对引物。引物序列如下：

第一引物对：

f15'atgaattacacaagttttat3'(seqidno.5)

r15’ttatttcgatgctctacgtcct3’(seqidno.6)

第二引物对：

f25'tactgtcaggccatgttt3'(seqidno.7)

r25’ttatttcgatgctctacgg3’(seqidno.8)

3、pcr扩增。

以上述引物对步骤1中反转录得到的cdna进行pcr扩增，扩增条件如下：

95℃，4min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，10min。

然而，上述第二引物对无法扩增得到目的片段，具体如下：

扩增后产物在1％的琼脂糖凝胶电泳的结果如图1和图2所示，图1为使用引物f1和r1pcr扩增ifn-γ的电泳结果图，图1中的1泳道为pcr扩增的γ干扰素，m泳道为dnamarker；图中可以看出已成功扩增出目的片段。

图2为使用引物f2和r2pcr扩增γ干扰素的6个退火温度梯度，其中，1-6泳道为6个退火温度梯度，m泳道为dnamarker。图中可以看出，6种不同的退火温度下均没有扩增出目的片段，舍弃此对引物。

随后回收引物f1/r1扩增出的目的大小条带(图1所示)，连接转化，挑取阳性质粒测序获得虎γ干扰素序列，如seqidno.9所示。

三、虎ifn-γ基因的毕赤酵母表达

1、设计优化表达基因。

预测上述seqidno.9所示虎γ干扰素序列的信号肽序列，具体为atgaattacacaagttttattttcgcttttcagctttgcataattttgtgttcttctggttgttactgtseqidno.10(69bp)，删除该信号肽序列，对照毕赤酵母密码子偏好表对γ干扰素密码子进行优化。并且，为了便于后期蛋白纯化，在ifn-γ基因的3’末端加入6×his标签，在5’端和3’端分别加上酶切位点ecori和noti，重新合成序列如下：

上述序列中，前后下划线部分为酶切位点，加粗的tga为终止子，加入的his标签为斜体catcatcatcatcatca部分，该序列所得到的对应氨基酸序列如seqidno.11所示。

2、酶切。

将改造的上述ifn-γ成熟蛋白基因(seqidno.4)和表达载体ppic9k(如图3)用ecori和noti进行双酶切。

酶切方案(50μl)如下：

3、连接。

酶切后电泳结果如图4的表达载体ppic9k用ecori和noti进行双酶切的电泳图所示，图中，泳道1为双酶切，泳道2为表达载体ppic9k，泳道m为dnamarker。

将酶切产物回收后，将ifn-γ成熟蛋白基因片段与ppic9k载体进行连接。

连接体系(10μl)为：

回收的9.3kb载体片段2ul

回收的目的片段3μl

ligationsolution5μl

16℃连接过夜。

4、线性化。

将质粒在下述体系中线性化处理。

单酶切体系(100μl)：

线性化电泳图片如图5的质粒线性化电泳图所示，图中泳道1为单酶切，泳道m为dnamarker。图中可以看出质粒已成功线性化。

随后，用2倍体积无水乙醇沉淀回收，用30μlddh2o溶解，得线性化质粒。

5、电转化。

(1)取200μlgs115毕赤酵母感受态细胞至ep管中，加入30μl上述线性化质粒，混合后转入电转杯(d＝0.2cm)中，冰上放置数分钟后，放入电转仪中电击(电压：1680v，电击时间：5ms)，电击后，立刻加入1ml1md-山梨醇，轻轻吹打数次，将电转后的酵母吸到1.5mlep管中，冰上放置数分钟。

(2)将ep管放到28℃培养箱中孵育1h后涂布于md平板培养基。48h后观察平板菌落长势，如图6的电转化md平板菌落长势情况所示，平板中菌落长势良好。

6、基因组的抽提。

从上述md平板上挑取10个单克隆至含有4mlypd(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)液体培养基的单管之中，28℃培养36h。

取500μl菌液至1.5mlep管中，离心收集菌体，使用tianampyeastdnakit酵母基因组dna提取试剂盒(天根生物，cat.#dp307-02，lot#p4106)提取酵母菌的基因组。

7、pcr筛选阳性克隆。

从目的基因序列两端设计以下引物对进行pcr扩增验证：

f3:gctagtaatccagacgtagcagacggag(seqidno.12)

r3:gccgctcagtgatgatgatgatgatg(seqidno.13)

pcr体系如下：

pcr反应程序(共30个循环)：

94℃预变性5min

94℃变性30s

58℃退火30s

72℃延伸2min

72℃充分延伸5min

扩增得到的条带在450bp左右，结果如图7所示。图7为pcr筛选阳性克隆电泳图，泳道1-10分别为挑取得10个菌落pcr电泳图，mk泳道为dnamarker。

三、虎ifn-γ基因的毕赤酵母表达

1、重组酵母的诱导表达。

(1)挑选单克隆菌落，置于装有4mlbmgy培养基的试管中，于28℃/250-300rpm培养od600(波长600nm处的吸光度值)至2-6，培养时间为16-18h。

(2)室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用1mlbmmy培养基重悬菌体。

(3)将上述步骤所得的菌液置于装有4mlbmmy培养基的试管中，放置于28℃/250-300rpm的摇床上继续生长。

(4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％，共培养72h。(每次均添加至1％，24h消耗后再添加至1％)

2、重组酵母诱导表达发酵上清液浓缩和sds-page检测。

(1)取1ml菌液，12000rpm离心10分钟，取900μl上清至新的ep管中，加入1/10体积100％三氯乙酸置于冰上10min。

(2)12000rpm离心10min，倒去上清液，加入1ml丙酮，涡旋使其棕色沉淀溶解其中，置于-20℃过夜沉淀。

(3)12000rpm离心10min，倒去上清液，加入20μlddh2o和5μl上样缓冲液，100℃煮沸10min，sds-page检测，结果如图8所示。图8为蛋白的sds-page结果图，其中，泳道1-10为诱导后的浓缩上清液，mk泳道为dnamarker。图中箭头所指即为目的蛋白，即毕赤酵母已成功表达虎γ干扰素。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州动物园

<120>虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>144

<212>prt

<213>虎γ干扰素(tigerifn-γ)

<400>1

glnalametphephelysgluileglugluleulysglytyrpheasn

151015

alaserasnproaspvalalaaspglyglyserleuphevalaspile

202530

leulysasntrplysglugluserasplysthrileileglnsergln

354045

ilevalserphetyrleulysmetphegluasnleulysaspaspasp

505560

glnargileglnargasnmetaspthrilelysgluaspmetleuasp

65707580

lysleuleuasnthrserserserlysargaspasppheleulysleu

859095

ileglnileprovalasnaspleuglnvalglnarglysalaileasn

100105110

gluleuphelysvalmetasnaspleuserproargserasnleuarg

115120125

lysarglysargserglnasnleupheargglyargargalaserlys

130135140

<210>2

<211>432

<212>dna

<213>虎γ干扰素(tigerifn-γ)

<400>2

caggccatgttttttaaagaaatagaagagctaaagggatattttaatgcaagtaatcca60

gatgtagcagatggtgggtcgcttttcgtagacattttgaagaactggaaagaggagagt120

gataaaacaataattcaaagccaaattgtctccttctacttgaaaatgtttgaaaacctg180

aaagatgatgaccagcgcattcaaaggaacatggacaccatcaaggaagacatgcttgat240

aagttgttaaataccagctccagtaaacgggatgacttcctcaagctgattcaaatccct300

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agagcatcgaaa432

<210>3

<211>435

<212>dna

<213>虎γ干扰素(tigerifn-γ)

<400>3

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gacttatcaccaagaagtaatttaagaaaaagaaaaagaagtcaaaatttatttagagga420

agtagagctagtaaa435

<210>4

<211>470

<212>dna

<213>虎ifn-γ成熟蛋白基因(tigerifn-γ)

<400>4

gaattcatgcaagctatgtttttcaaagaaatagaagaattaaaaggatattttaatgct60

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agaggaagtagagctagtaaacatcatcatcatcatcactgagcggccgc470

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<213>虎γ干扰素(tigerifn-γ)

<400>9

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<210>10

<211>69

<212>dna

<213>虎γ干扰素信号肽序列(tigerifn-γsignalpeptide)

<400>10

atgaattacacaagttttattttcgcttttcagctttgcataattttgtgttcttctggt60

tgttactgt69

<210>11

<211>151

<212>prt

<213>虎γ干扰素蛋白(tigerifn-γpeptide)

<400>11

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151015

asnalaserasnproaspvalalaaspglyglyserleuphevalasp

202530

ileleulysasntrplysglugluserasplysthrileileglnser

354045

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505560

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859095

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<213>人工序列(artificialsequence)

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