一种鸡Nrf2蛋白抗体及其免疫原、免疫原性多肽、检测试剂盒和应用的制作方法

本发明属于病毒免疫学技术领域，具体涉及一种鸡nrf2蛋白抗体及其免疫原、免疫原性多肽、检测试剂盒和应用。

背景技术：

细胞内氧化还原平衡对于机体健康具有重要且复杂的影响。一方面，能量代谢催生大量活性氧自由基，这些活性氧自由基在体内的积累严重损伤细胞，是造成衰老、过敏反应、糖尿病、肝脏疾病和心血管疾病等众多疾病的病理生理基础。另一方面，当病原微生物侵染机体时，细胞将触发适当水平的氧化应激反应，产生的活性氧不但可以直接杀伤病原体，还可以间接诱发调控机体先天免疫应答系统。为了确保在细胞内外环境发生变化时机体能够及时精确地调控细胞氧化还原过程，细胞内形成了一套以转录因子nf-e2相关因子2(nrf2，也称nfe2l2)为核心调控因子的复杂的氧化应激应答系统。作为机体维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者，nrf2以转录调控因子的方式，在细胞核通过内与ⅱ相解毒酶启动子区域are结合，调控一系列氧化应激相关酶及抗氧化蛋白的基因的表达，包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nad(p)h)、氧化还原酶(nqo1)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh)、过氧化物酶(pod)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(gcl)、谷胱甘肽环氧化物水解酶(eh)和血红素氧化酶(ho-1)等，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡。

目前已知鸡nrf2蛋白氨基酸序列，其在genbank中序列号为baa08364.1，由582个氨基酸组成。然而，nrf2相关研究集中在人和哺乳类动物，禽类包括鸡nrf2研究基本空白。尚未有识别鸡nrf2蛋白的抗体和合适的试剂能检测鸡nrf2蛋白的表达与分布情况。

技术实现要素：

针对现有技术中缺乏有效检测鸡nrf2蛋白表达情况的抗体和相关检测试剂盒，本发明提供了一种免疫原性多肽，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明还提供了一种用于获得鸡nrf2蛋白抗体的免疫原，是由氨基酸序列如seqidno：1所示的免疫原性多肽通过偶联剂与载体蛋白偶联获得的。

本发明还提供了一种鸡nrf2蛋白抗体，是以上述的免疫原与佐剂混合乳化后免疫接种兔，取免疫后兔的血液经纯化后制备获得的。

本发明还提供了上述鸡nrf2蛋白抗体的制备方法，包括如下步骤：

1)制备免疫原：将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽，通过偶联剂与载体蛋白偶联，得到鸡nrf2免疫原；

2)免疫接种：将步骤1)获得的鸡nrf2免疫原与佐剂混合乳化后，接种兔进行免疫；

3)在接种一个月后，参照首次免疫使用的剂量减半进行二次免疫；

4)制备粗抗体：二次免疫一个月后，在无佐剂条件下静脉注射鸡nrf2免疫原，注射剂量为0.1-1mg/只，此后，每隔两周进行加强免疫，累计加强免疫2-5次，每次加强免疫1周后取兔血进行离心，收集上清液，获得鸡nrf2蛋白粗抗体；

5)纯化抗体：将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽偶联到柱中预先活化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂上制备抗原亲和柱，然后用pbs缓冲液进行柱平衡；将过滤后的鸡nrf2蛋白粗抗体加入平衡后的抗原亲和柱，而后用pbs缓冲液再次进行柱平衡，经洗脱后制备获得鸡nrf2蛋白抗体。

进一步地限定，步骤1)所述偶联剂为4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、n-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯或戊二醛；所述载体蛋白为玥孔戚血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或人工合成的多聚赖氨酸。

进一步地限定，步骤2)所述免疫接种是将0.25-1.5mg免疫原与0.1-1mg胞壁酰二肽佐剂混合后，加pbs定容至1ml，然后与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后接种兔；所述兔为两月龄雌性新西兰白兔；所述接种部位为兔两侧腹股沟和腋下四点及颈背部四点皮下；接种剂量为0.1-1mg免疫原/只。

进一步地限定，步骤5)所述洗脱是指用ph2.5的100mm甘氨酸溶液作为抗体洗脱液对抗原亲和柱进行洗脱，合并收集280nm波长处吸光度大于1.0的洗脱液，以pbs缓冲液为透析液进行透析，获得所述鸡nrf2蛋白抗体。

本发明还提供了一种检测鸡nrf2蛋白的elisa检测试剂盒，所述elisa检测试剂盒组分包括酶标板、包被缓冲液、封闭液、酶标二抗、tmb显色液、终止液、检测抗原和上述鸡nrf2蛋白抗体，所述检测抗原是以戊二醛为偶联剂，将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽与牛血清白蛋白偶联制备获得的。

进一步地限定，所述包被缓冲液为ph9.6的50mm碳酸盐包被缓冲液；所述封闭液为质量分数为1％的bsa溶液；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体fc段二抗；所述终止液为2m的硫酸水溶液。

本发明还提供了所述的鸡nrf2蛋白抗体在监测鸡nrf2蛋白在细胞内的表达和分布中的应用。

有益效果

鸡nrf2可以调控鸡细胞的氧化还原平衡，对于鸡的健康及抗微生物感染至关重要，是鸡抗微生物先天性免疫应答的重要调控因子，有望成为鸡抗病治疗及抗病育种的新靶标。

申请人通过blast比对发现，鸡nrf2蛋白与人和小鼠nrf2蛋白序列差异较大，同源性分别为65.6％和62.3％。申请人进一步比对几个主要抗体供应商目前用于制备市售的识别人和小鼠nrf2蛋白的抗体的免疫多肽和鸡nrf2蛋白相应序列发现，其间同源性普遍较低。申请人检测了多种市售抗人或小鼠nrf2的抗体，均不能够识别鸡nrf2(见图2)。

本发明根据鸡nrf2蛋白序列信息，合成了鸡nrf2蛋白氨基酸569位至氨基酸582位多肽作为免疫原。所选择多肽处于鸡nrf2蛋白c末端，氨基酸序列：iflvpksrkaetkl。利用该免疫原获得鸡nrf2抗体以及elisa检测试剂盒，取得了如下有益的技术效果：

本发明以所选择多肽作为免疫原接种兔获得的抗体，能够特异性识别鸡nrf2蛋白，所选择多肽氨基酸序列经过blast比对验证也仅与鸡nrf2蛋白氨基酸序列高度一致。

本发明提供的一种用于检测鸡nrf2蛋白的elisa检测试剂盒，对鸡nrf2蛋白具有特异性识别能力和较高的灵敏性，能够检测样品中鸡nrf2蛋白的表达水平。

本发明还经过免疫荧光实验对抗体进行验证，结果显示本发明nrf2蛋白抗体能够用于免疫荧光检测，实现同时监测鸡nrf2蛋白在细胞内表达和分布动态，具有较高特异性。

本发明可以用于生物治疗、诊断鉴定、生物学研究等领域，所制备的抗体可以用制备诊断、预防和/或治疗个体的药物，如：鸡体内一种或多种与nrf2相关病症；以及可以用于调节有鸡nrf2介导的抗氧化、抗炎症、蛋白酶体功能和抗感染先天免疫反应中的用途。

附图说明

图1elisa试剂盒检测范围测定，横坐标为多肽浓度(pg/ml)，纵坐标为450nm处的吸光值；

图2鸡巨噬细胞hd11中nrf2表达量的elisa检测结果，横坐标依次为对照以及不同抗体，纵坐标为450nm处的吸光值，其中abcam-ab62352为兔抗人nrf2单克隆抗体(abcamab62352)，其中abcam-ab156883为兔抗鼠nrf2多克隆抗体(abcamab156883)，sigma-sab4501984为兔抗人/鼠nrf2多克隆抗体(sigmasab4501984)；

图3鸡巨噬细胞hd11中nrf2表达的免疫荧光检测结果；

图4tmuv感染鸡巨噬细胞hd11后，nrf2蛋白在细胞内的表达和分布情况，其中dapi是指细胞核指示剂，nrf2是指鸡nrf2蛋白，merge为dapi细胞核指示标记和鸡nrf2蛋白共聚焦在同一个视野。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。实例中若无特别说明均为常规操作方法，所使用的试剂或仪器设备入去特殊说明，均可通过商业途径购买获得。

1％bsa溶液：在本发明中也称为1％bsa封闭液，为质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液，购买自sigma-aldrich，货号a1933。

鸡巨噬细胞hd11：可通过商业途径购买获得，本发明中使用的鸡巨噬细胞hd11来自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

dmem培养基(10％fbs，1％sp)：其中dmem培养基：购买自sigma-aldrich，货号d0819。

10％fbs：胎牛血清，购买自sigma-aldrich，货号12006c，在培养基中的体积分数为10％。

1％sp：青霉素-链霉素双抗溶液，购买自invitrogen，货号15140122，在培养基中的体积分数为1％。

禽坦布苏病毒(tmuv)：该毒株记载于sunl,liy,zhangy,hanz,xuy,kongx,lius.adaptationandattenuationofducktembusuvirusstraindu/ch/lsd/110128followingserialpassageinchickenembryos.clinvaccineimmunol.2014aug；21(8):1046-53.本发明使用的毒株来自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

实施例1.用于获得鸡nrf2蛋白抗体的免疫原。

本实施例所述的免疫原是通过如下方法制备获得的：

1)根据鸡nrf2蛋白序列信息，(genbank中序列号为baa08364.1)，综合应用生物信息学分析方法预测并筛选抗原性好、溶解度高并易于合成的多肽。最终选用氨基酸569位至氨基酸582位多肽作为免疫原，氨基酸序列如seqidno：1所示。该段多肽处于鸡nrf2蛋白c末端，氨基酸序列：iflvpksrkaetkl。

2)化学合成上述多肽，应用4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为偶联剂，将上述10mg多肽与25mg玥孔戚血蓝蛋白在室温偶联，然后用10kd的透析袋于pbs(ph7.2)中透析除去游离未偶联的多肽，得到所述用于获得鸡nrf2蛋白抗体的免疫原，记作：klh569。

实施例2.鸡nrf2蛋白抗体的制备方法。

本实施例所述的鸡nrf2蛋白抗体是将实施例1制备获得的免疫原klh569与佐剂混合乳化后免疫接种兔，取免疫后兔的血液经纯化后制备获得的。制备方法如下：

1)制备免疫原：将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽，通过偶联剂与载体蛋白偶联，得到鸡nrf2免疫原klh569，参见实施例1所述制备方法。

2)免疫接种：将步骤1)获得的鸡nrf2免疫原与佐剂混合乳化后，接种兔进行免疫；具体如下：将0.4mgklh569与0.1mg胞壁酰二肽佐剂混合，加pbs定容至1ml。然后再与等体积弗氏完全佐剂(1ml)混合乳化后，在两月龄雌性新西兰白兔两侧腹股沟和腋下四点及颈背部四点皮下免疫接种，接种剂量为0.1mg免疫原/只。

3)在接种一个月后，参照首次免疫使用的剂量减半进行二次免疫。

4)制备粗抗体：二次免疫一个月后，在无佐剂条件下静脉注射pbs定容至0.1ml的0.1mgklh569，此后，每隔两周进行加强免疫，累计加强免疫5次。每次加强免疫1周后取20ml兔血进行离心，收集上清液，获得鸡nrf2蛋白粗抗体；所述加强免疫，是指按照上一次剂量再次进行接种，本实施例中加强免疫的剂量为0.1mlklh569(含0.1mgklh569)。

5)纯化抗体：将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽偶联到柱中预先活化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂上制备抗原亲和柱，然后用pbs缓冲液进行柱平衡；将过滤后的鸡nrf2蛋白粗抗体加入平衡后的抗原亲和柱，而后用pbs缓冲液再次进行柱平衡，经洗脱后制备获得鸡nrf2蛋白抗体。具体为：

首先，将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽偶联到柱中预先活化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂上来制备抗原亲和柱；然后将过滤后的鸡nrf2蛋白粗抗体加入用pbs缓冲液平衡好的抗原亲和柱，而后用pbs缓冲液再次进行柱平衡；最后用ph2.5的100mm甘氨酸溶液作为抗体洗脱液对抗原亲和柱进行洗脱，合并收集280nm波长处吸光度大于1.0的洗脱液，以pbs缓冲液为透析液进行透析，获得所述鸡nrf2蛋白抗体，在本发明中也称为鸡nrf2-569蛋白抗体。

实施例3.抗体质量检测。

本实施例的目的在于检测实施例2所获得的鸡nrf2蛋白抗体的质量，具体方法及步骤如下。

1)抗原包被：

以戊二醛为偶联剂，将10mg氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽与20mg牛血清白蛋白室温振荡偶联作为检测抗原。用50mm的碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)溶解检测抗原，调整抗原浓度为4μg/ml，每孔加100μl/孔到96孔酶标板，4℃放置过夜。

2)封闭：

第二天弃去包被液，用pbs洗涤3次，每孔加入150μl的1％bsa溶液，37℃封闭1小时。

3)抗原抗体结合：

弃去封闭液，pbs洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的纯化后的抗鸡nrf2蛋白抗体或市售人及小鼠nrf2抗体，未免疫兔血清作为阴性对照，37℃孵育2小时。

4)孵育酶标二抗：

pbs洗涤5次后拍打酶标板若干次，加入100μl用封闭液1:200稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体fc段二抗，37℃孵育1小时。

5)显色：

pbs洗涤5次后拍打酶标板若干次，加入100μl的tmb显色液，37℃孵育20分钟。

6)读数：

每孔加入50μl的2m硫酸终止液，将终止反应后的酶标板在酶标仪上读取450nm处的吸光值，检测结果如下表所示。

表1.鸡nrf2-569抗体elisa检测结果

从表1试验数据中可以看出本发明方法分离得到的抗体具有很好的特异性及灵敏性，该段多肽免疫获得的抗体滴度均在1:512000倍以上。

实施例4.检测鸡nrf2蛋白的elisa检测试剂盒。

所述elisa检测试剂盒组分包括酶标板、包被缓冲液、封闭液、酶标二抗、tmb显色液、终止液、检测抗原和实施例2所述的鸡nrf2蛋白抗体，所述检测抗原是以戊二醛为偶联剂，将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽与牛血清白蛋白偶联制备获得的。

下面举例描述检测鸡nrf2蛋白的elisa检测试剂盒组成成分以及质量检测结果。

1.elisa检测试剂盒组成

本实施例所述elisa检测试剂盒组分具体可由如下成分组成：96孔酶标板、ph9.6的50mm碳酸盐包被缓冲液、1％bsar溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体fc段二抗、tmb显色液和2m硫酸终止液，以戊二醛为偶联剂，将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽与牛血清白蛋白偶联(如将10mg氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽与20mg牛血清白蛋白室温振荡偶联)所制备的检测抗原和实施例2所述的鸡nrf2-569蛋白抗体。

2、elisa试剂盒质量检测

具体方法及步骤如下。

2.1抗原包被：

以戊二醛为偶联剂分别将氨基酸序列如seqidno：1所示的多肽与牛血清白蛋白偶联作为检测抗原。用50mm的碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)溶解检测抗原，抗原浓度从2μg/ml倍比稀释至15.6pg/ml，每孔加100μl，4℃放置过夜。

2.2封闭：

第二天弃去包被液，用pbs洗涤3次，每孔加入150μl的1％bsa，37℃封闭1小时。

2.3抗原抗体结合：

弃去封闭液，pbs洗涤3次，将纯化后的抗鸡nrf2蛋白抗体浓度调整为1mg/ml，每孔加入100μl按1:2000稀释的抗体，37℃孵育2小时。

2.4孵育酶标二抗：

pbs洗涤5次后拍打酶标板若干次，加入100μl用封闭液1:200稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体fc段二抗，37℃孵育1小时。

2.5显色：

pbs洗涤5次后拍打酶标板若干次，加入100μl的tmb显色液，37℃孵育20分钟。

2.6读数：

每孔加入50μl的2m硫酸终止液，将终止反应后的酶标板在酶标仪上读取450nm处的吸光值，检测结果如图1所示。

从图1试验数据中可以看出，本发明方法研制的elisa试剂盒具有较宽的检测范围和较好的灵敏度及稳定性。尚无市售鸡nrf2蛋白elisa试剂盒及相关报道可用于与本试剂盒进行比较。

实施例5.鸡nrf2蛋白抗体在监测鸡nrf2蛋白在细胞内的表达和分布中的应用。

1.利用鸡nrf2蛋白抗体检测鸡巨噬细胞hd11中nrf2表达情况

比较市售人nrf2抗体、小鼠nrf2抗体和本发明所述鸡nrf2-569抗体对鸡nrf2的识别是否存在差异，具体方法及步骤如下。

1)细胞培养：

在96孔细胞培养板中每孔接种5×10⁴个hd11细胞，dmem培养基(10％fbs，1％sp)培养，37℃，5％co2。

2)固定：

贴壁细胞培养24小时后，弃上清，并用pbs洗涤3次，每孔加入150μl的4％多聚甲醛，37℃固定1小时。

3)透膜：

pbs洗涤3次，每孔加入200μl的0.25％triton-100透膜液，室温孵育0.5小时。

4)封闭：

pbs洗涤3次，每孔加入200μl的1％bsa封闭液，37℃孵育1小时。

5)抗原抗体结合：

弃去封闭液，pbs洗涤3次，将用封闭液稀释的市售人nrf2抗体、小鼠nrf2抗体和本发明所述鸡nrf2抗体按0.01μg/ml的浓度孵育细胞，未免疫兔血清作为阴性对照，37℃孵育2小时。

6)孵育酶标二抗：

pbs洗涤3次，加入100μl用封闭液1:500稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体fc段二抗，37℃孵育1小时。

7)显色：

pbs洗涤5次，加入100μl的tmb显色液，37℃孵育20分钟。

8)读数：

每孔加入50μl的2m硫酸终止液，将终止反应后的酶标板在酶标仪上读取450nm处的吸光值，检测结果如图2所示。

从图2试验数据中可以看出本发明方法获得的抗体均可以较好地检测鸡nrf2的表达，然而检测的三株市售人和小鼠nrf2抗体均不能识别鸡nrf2。

2.免疫荧光检测鸡nrf2表达

确定本发明所述抗体能否用于鸡nrf2免疫荧光检测，具体方法及步骤如下。

1)细胞培养：

在6孔细胞培养板中按每孔5×10⁵个细胞接种hd11，dmem培养基(10％fbs，1％sp)培养，37℃，5％co2。

2)固定：

贴壁细胞培养24小时后，弃上清，并用pbs洗涤3次，每孔加入750μl的4％多聚甲醛，37℃固定1小时。

3)透膜：

pbs洗涤3次，每孔加入1ml的0.25％triton-100透膜液，室温孵育0.5小时。

4)封闭：

pbs洗涤3次，每孔加入1ml的1％bsa封闭液，37℃孵育1小时。

5)抗原抗体结合：

弃去封闭液，pbs洗涤3次，将本发明所述鸡nrf2抗体按0.02μg/ml浓度加入6孔板，未免疫兔血清作为阴性对照，37℃孵育2小时。

6)孵育酶标二抗：

pbs洗涤3次，加入1ml用封闭液1:500稀释的fitc标记的羊抗兔抗体fc段二抗，37℃孵育1小时。

7)荧光检测：

pbs洗涤3次，dapi染色液染核10分钟；充分清洗后加入防荧光淬灭剂，荧光倒置显微镜(olympusix81)下观察并拍照，检测结果如图3所示。

从图3可以看出本发明所述抗体nrf2-569可以用于鸡nrf2蛋白的免疫荧光检测，具有较高的特异性。

3.免疫荧光检测鸡nrf2细胞内分布

检测本发明所述抗体能否用于免疫荧光监测鸡nrf2蛋白在细胞内的表达和分布动态，具体方法及步骤如下。

1)细胞培养及病毒感染：

在35mm玻璃底培养皿中接种5×10⁵个hd11细胞，dmem培养基(10％fbs，1％sp)培养，37℃，5％co2。贴壁细胞培养24小时后，按感染复数moi＝1接种禽坦布苏病毒(tmuv)。

2)固定：

tmuv感染24小时后，弃上清，并用pbs洗涤3次，每孔加入750μl的4％多聚甲醛，37℃固定1小时。

3)透膜：

pbs洗涤3次，每孔加入1ml的0.25％triton-100透膜液，室温孵育0.5小时。

4)封闭：

pbs洗涤3次，每孔加入1ml的1％bsa封闭液，37℃孵育1小时。

5)抗原抗体结合：

弃去封闭液，pbs洗涤3次，将本发明所述鸡nrf2抗体按0.02μg/ml浓度加入培养皿，37℃孵育2小时。

6)孵育酶标二抗：

pbs洗涤3次，加入1ml用封闭液1:500稀释的fitc标记的羊抗兔抗体fc段二抗，37℃孵育1小时。

7)荧光检测：

pbs洗涤3次，dapi染色液染核10分钟；充分清洗后加入防荧光淬灭剂，共聚焦荧光显微镜(zeisslsm880)下观察并拍照，检测结果如图4所示。

从图4可以看到，tmuv感染鸡巨噬细胞hd11后，nrf2蛋白总体表达水平没有明显改变，但是nrf2蛋白显著向细胞核内聚集，提示病毒感染触发了宿主细胞nrf2介导的氧化应激调控网络。

上述结果显示，本发明所述抗体可以用于同时监测鸡nrf2蛋白在细胞内的表达和分布动态。

实施例6.鸡nrf2蛋白抗体的制备方法。

重复实施例2，与实施例2的不同在于，所述制备方法中步骤2)接种剂量为1mg免疫原/只；步骤4)所述制备粗抗体时，二次免疫一个月后，在无佐剂条件下静脉注射pbs定容至0.4ml的1mgklh569。本实施例制备的抗体同样能够用于免疫荧光检测，实现同时监测鸡nrf2蛋白在细胞内表达和分布动态，具有较高特异性。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

<120>一种鸡nrf2蛋白抗体及其免疫原、免疫原性多肽、检测试剂盒和应用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>免疫原性多肽

<400>1

ilepheleuvalprolysserarglysalagluthrlysleu

1510