一种用于提高山西老陈醋γ-氨基丁酸含量的生物强化方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于提高山西老陈醋γ-氨基丁酸（gaba）含量的生物强化方法。

背景技术：

山西老陈醋是我国传统四大名醋之一，其中含有乳酸、苹果酸等多种有机酸以及酯、醇、酮、醛等呈香物质，这些风味物质的协同作用，赋予了山西老陈醋“绵、酸、香、甜、鲜”等特点。川芎嗪是山西老陈醋中重要的生理功能物质，除此之外，新近发现山西老陈醋中也含有微量的γ-氨基丁酸。

γ-氨基丁酸（gaba）是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸，也是高等生物脑和脊髓神经系统中广泛分布的最重要的神经性抑制递质。具有控制高血压，降血糖，抗焦虑、凝神，治疗神经性病变，调节内分泌，利肾健肝，控制哮喘，延缓衰等一系列保健和生理功能。在动物、植物和微生物体内gaba的主要合成途径是通过谷氨酸脱羧酶催化l-谷氨酸脱羧，作为一种新型功能因子，gaba正逐步被人们所注意。由于gaba在动植物含量非常低，要想从自然界生物体内获取丰富的gaba资源比较困难。当今，用微生物发酵法来实现gaba的生产主要是通过紫色红曲霉、酵母菌等菌株发酵。

公布号为cn101899382a公布了一种γ-氨基丁酸高含量谷物醋的制备方法。其以高产的红曲菌制备的红曲为糖化发酵剂，探讨了高含量谷物醋的酿造条件，制备得到了gaba含量高达100mg/l的谷物醋。公布号为cn104774734a公布了一种富含γ-氨基丁酸的红曲醋的制备方法。添加巴氏醋杆菌、植物乳杆菌以及红曲霉后，制备得到的红曲醋中γ-氨基丁酸含量与传统方法相比提高了120~230%。

本发明采用多株高产gaba的菌种，并且在原料中添加富含gaba的发芽大麦，多阶段强化，用于提高山西老陈醋gaba含量的方法，主要是从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出高产gaba的菌株，对于提高山西老陈醋的营养生理功能和丰富风味具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于提高山西老陈醋γ-氨基丁酸（gaba）含量的生物强化方法，本发明的技术方案如下：

一种用于提高山西老陈醋gaba含量的生物强化方法，具体步骤如下：

高产gaba菌株的筛选：对实验室购买的红曲霉cgmcc3.15546和山西老陈醋酒精发酵阶段的酒醪样品和醋酸发酵阶段的醋醅样品分离出的42株酵母菌、30株乳酸菌、35株醋酸菌、10株霉菌进行产gaba能力的测定，最终筛选得到高产gaba的红曲霉cgmcc3.15546、酵母菌421、乳酸菌7和醋酸菌2416，其gaba产量分别为5.76mg/ml、2.05mg/ml、3.94mg/ml、1.56mg/ml。对酵母菌421、乳酸菌7和醋酸菌2416进行形态学和测序鉴定，经鉴定为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）、植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）和巴氏醋杆菌（acetobacterpasteurianus）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日，保藏编号分别为cgmcc15729、cgmcc15731、cgmcc15730。

红曲霉发酵液的制备方法为：将红曲霉菌cgmcc3.15546点接于pda固体斜面，30℃培养3‒5d，将活化好的斜面菌种，用无菌生理盐水冲洗获得孢子悬液，滤纸过滤除去菌丝，制备成10⁶cfu/ml的红曲霉孢子悬液；pda液体扩大培养基中接种培养基体积10%的红曲霉孢子悬液，调节ph为5，30℃，180r/min培养10d后得到红曲霉发酵液。

复配直投式发酵剂的制备方法为：

（1）将活化后的酿酒酵母cgmcc15729按照3%的接种量接入到pda液体培养基，30℃静置培养培养24h；将活化后的植物乳杆菌cgmcc15731、巴氏醋杆菌cgmcc15730按照3%的接种量分别接入到mrs液体培养基，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃下180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到10⁸cfu/ml后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥；

（2）将酿酒酵母cgmcc15729、植物乳杆菌cgmcc15731干粉按质量比1:1混合即为酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂，将植物乳杆菌cgmcc15731、巴氏醋杆菌cgmcc15730干粉按质量比1:1混合即为醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂，其活菌数均为10¹¹cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

将gaba强化的直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋发酵过程中的具体方法为：

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱和5公斤的发芽大麦加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，加入红曲霉发酵液和酒精发酵阶段的复配直投式发酵剂（酿酒酵母cgmcc15729、植物乳杆菌cgmcc15731），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入醋酸发酵阶段的复配直投式发酵剂（植物乳杆菌cgmcc15731、巴氏醋杆菌cgmcc15730），控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。

采用gaba强化发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酸含量为5.85g/100ml，gaba含量为0.23mg/ml，总酯含量为4.58g/100ml，与对照相比分别提高了55.58%、283.33%、54.73%，另外，丰富了有机酸和挥发性香气的种类和含量。

所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。所述无菌保护剂配方为：a：脱脂奶粉10g，蒸馏水100ml，115℃灭菌15min；b：海藻糖1.5g、甘油0.5g、山梨醇2g、麦芽糊精1g、蒸馏水100ml，121℃灭菌15min；a和b分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。

附图说明

图1高产gaba菌株的菌落形态和细胞形态；图中a为酿酒酵母cgmcc15729的菌落形态图；a为酿酒酵母cgmcc15729在1000×下的细胞形态图；b为植物乳杆菌cgmcc15731的菌落形态图；b为植物乳杆菌cgmcc15731在1000×下的细胞形态图；c为巴氏醋杆菌cgmcc15730的菌落形态图；c为巴氏醋杆菌cgmcc15730在1000×下的细胞形态图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：高产gaba菌株的筛选

对实验室购买的红曲霉cgmcc3.15546和山西老陈醋酒精发酵阶段的酒醪样品和醋酸发酵阶段的醋醅样品分离出的10株霉菌、42株酵母菌、30株乳酸菌、35株醋酸菌，使用发酵培养基培养菌株，待发酵结束后，将发酵物8000r/min离心20min，取上清备用。采用薄层色谱（tlc）和反相高效液相色谱(rp-hplc)-opa柱前衍生法检测gaba的含量，最终筛选得到高产gaba的红曲霉cgmcc3.15546、酵母菌421、乳酸菌7和醋酸菌2416，其gaba产量分别为5.76mg/ml、2.05mg/ml、3.94mg/ml、1.56mg/ml。

上述的发酵培养基的制备方法为：

（1）霉菌的发酵培养基：大米粉2%，葡萄糖4%，谷氨酸单钠盐(msg)1%，nano30.5%，kh2po40.15%，mgso4·7h2o0.1%，蒸馏水1000ml，ph6.0，121℃灭菌20min备用；

（2）酵母菌的发酵培养基：葡萄糖30g，nano33g，酵母浸膏1g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4·7h2o0.01g，l-谷氨酸0.5g，蒸馏水1000ml，ph6.0，121℃灭菌20min备用；

（3）乳酸菌的发酵培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，k2hpo42g，乙酸钠2g，柠檬酸三胺2g，葡萄糖20g，吐温801ml，mgso40.2g，mnso40.05g，谷氨酸钠10g，蒸馏水1000ml，ph6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用；

（4）醋酸菌的发酵培养基：葡萄糖20g，酵母膏10g，无水碳酸钙10g，谷氨酸钠10g，蒸馏水1000ml，ph6.2‒6.6，121℃灭菌20min，冷却至60℃加入4%的无水乙醇备用。

上述的薄层色谱（tlc）法的具体方法为：配制10‒500mg/lgaba系列标准水溶液，分别取2μl不同浓度的gaba标准溶液和发酵液，点样于薄板并展开（展开剂为95%乙醇:25%氨水=4:1），展距10cm。随后置薄板于通风橱吹干，90℃烘箱保温30min挥尽氨气，以0.2%茚三酮乙醇溶液喷雾，90℃显色10min，比较样品与标样斑点大小与颜色深浅，分析样品中gaba的含量。

上述的反相高效液相色谱（rp-hplc）-opa柱前衍生法的具体方法为：134mgopa溶于10ml无水乙醇，加入200μl2-mce和40ml0.1mol/l的四硼酸钠（ph=9.6）溶液，配成opa衍生液。发酵液经0.1mol/lk2co3缓冲溶液稀释，10000r/min离心20min，上清过0.45μm滤膜。1ml发酵液滤液加入500μlopa衍生液，轻轻混匀，室温静置2min，进样20μl。用含50%甲醇的0.1mol/l碳酸钾缓冲液配制10μg/l‒10mg/l的gaba系列标准液，经同样的条件衍生并进样，绘制标准曲线。色谱条件为：色谱柱为kromasilc18（5μm，250.0×4.6mm）；流动相为磷酸钾缓冲液（0.1mol/l，ph6.0）：甲醇：乙腈体积比为6:3:1；检测器为荧光检测器；检测波长ex=340nm，em=455nm；流速0.6ml/min。

实施例2：高产gaba酵母菌421、乳酸菌7和醋酸菌2416的鉴定

形态学鉴定：酵母菌421在pda平板上形成菌落呈规则圆形，白色，不透明，光滑，有光泽，表面隆起，菌落直径为1.5mm，细胞形态呈椭圆状；乳酸菌7在mrs培养基上的菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，菌落直径分别为0.6‒0.8mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色均呈g⁺，菌体呈小短杆状；醋酸菌2416在醋酸菌平板培养基上形成菌落直径0.8mm，规则圆形，乳白色，半透明，光滑，有光泽，表面很平的菌落；其细胞形态：革兰氏染色呈g^-，呈小短杆状，见图1。

经鉴定为酵母菌421为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），保藏编号为cgmcc15729，乳酸菌7为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum），保藏编号为cgmcc15731，醋酸菌2416为巴氏醋杆菌（acetobacterpasteurianus），保藏编号为cgmcc15730。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日。

上述的pda固体培养基的制备方法为：取马铃薯20g，葡萄糖2g，蛋白胨0.2g，kh2po40.2g，mgso4·2h2o0.1g，琼脂2g，加蒸馏水100ml，121℃灭菌20min。

上述的mrs培养基的制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠2g，吐温801g，无水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1l，ph6.2‒6.4，121℃，20min灭菌。

上述的醋酸菌固体培养基的制备方法为：葡萄糖20g，酵母膏10g，无水碳酸钙10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调ph6.2‒6.6，121℃灭菌20min，冷却至60℃加入4%的无水乙醇备用。

实施例3：红曲霉发酵液的制备

将红曲霉菌cgmcc3.15546点接于pda固体斜面，30℃培养3~5d，将活化好的斜面菌种，用无菌生理盐水冲洗下孢子，转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用滤纸过滤除去菌丝，制备成10⁶cfu/ml的红曲霉孢子悬液；取85ml装液量的pda液体扩大培养基，接种10%的红曲霉孢子悬液，调节ph为5，30℃，180r/min培养10d后得到红曲霉发酵菌种。

上述的扩大培养基的制备方法为：10%的葡萄糖、1%的花生粉、1%的kh2p04、0.5%的mgs04，87.5%的pda液体培养基。

实施例4：酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂的制备

（1）酒精发酵阶段复配直投式发酵剂的制备：将活化后的酿酒酵母cgmcc15729按照3%的接种量接入到pda液体培养基，30℃静置培养培养24h；将活化后的植物乳杆菌cgmcc15731按照3%的接种量分别接入到mrs液体培养基，37℃静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到10⁸cfu/ml后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v），通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，将酿酒酵母cgmcc15729、植物乳杆菌cgmcc15731干粉按质量比1:1混合即为酒精发酵阶段复配直投式发酵剂。

（2）醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂的制备：将活化后的植物乳杆菌cgmcc15731、巴氏醋杆菌cgmcc15730按照3%的接种量分别接入到mrs液体培养基，植物乳杆菌在37℃下静置培养24h，巴氏醋杆菌在30℃下180r/min培养2d，待培养液的菌体浓度均达到10⁸cfu/ml后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v），通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，将植物乳杆菌cgmcc15731、巴氏醋杆菌cgmcc15730干粉按质量比1:1混合即为醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂。

上述的保护剂制备方法为：a：脱脂奶粉10g，蒸馏水100ml，115℃灭菌15min；b：海藻糖1.5g、甘油0.5g、山梨醇2g、麦芽糊精1g、蒸馏水100ml，121℃灭菌15min；a，b分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。

上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的复配直投式发酵剂，活菌数均为10¹⁰cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

实施例5：将gaba强化的直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋发酵过程中

高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火，再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（ph、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度、川芎嗪）（结果见表1），有机酸（结果见表2）及挥发性香气成分（结果见表3）。

实施例6：以实施例5为对照例，按照上述方法在原料（100公斤高粱）中添加了5公斤的发芽大麦。

上述的发芽大麦制备方法为：首先筛选，除去麦皮、石子、霉变及未成熟颗粒，然后将500g干大麦于大烧杯中7℃浸泡6h，后将浸泡后稻谷平铺于铺有8层纱布的托盘（1200×1000mm）中，加入800ml蒸馏水（含有1gcacl2，6g谷氨酸钠），30℃保温保湿培养3d，40℃烘干至恒重。

实施例7：以实施例5为对照例，按照上述方法在100公斤高粱中添加了5公斤的发芽大麦；在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量2%的红曲发酵液和高粱重量0.8%酒精发酵阶段复配直投式发酵剂（酿酒酵母cgmcc15729、植物乳杆菌cgmcc15731），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，酒精发酵8‒10天。

上述的酒精发酵阶段复配直投式发酵剂的制备方法：1g复配直投式发酵剂溶解到10ml无菌水中，30℃活化30min后备用。

实施例8：以实施例5为对照例，按照上述方法在100公斤高粱中添加了5公斤的发芽大麦；在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量2%的红曲发酵液和高粱重量0.8%酒精发酵阶段复配直投式发酵剂（酿酒酵母cgmcc15729、植物乳杆菌cgmcc15731），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，酒精发酵8‒10天；在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.8%醋酸发酵阶段复配直投式发酵剂（植物乳杆菌cgmcc15731、巴氏醋杆菌cgmcc15730），进行醋酸发酵10‒12天。

采用gaba强化的直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、gaba、总酯以及有机酸含量，丰富了新淋醋的挥发性香气谱图。实施例8显著优于实施例4（对照例），实施例8总酸含量为5.85g/100ml，gaba含量为0.23mg/ml，总酯含量为4.58g/100ml，与对照相比分别提高了55.58%、283.33%、54.73%（表1）；有机酸总含量由29.8663g/l提高为44.8895g/l，其中乳酸、乙酸含量显著提高，比对照组分别提高了77.74%、43.01%（表2）；挥发性香气成分共检测出40种（酯类18种、醇类4种、酸类3种、酮类5种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为4.26g/100ml、醇类总含量为0.99g/100ml、酸类总含量为3.86g/100ml、醛类总含量为16.93g/100ml；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.08g/100ml）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.38g/100ml）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.32g/100ml）、呈椰子香的癸酸乙酯（0.08g/100ml）、具有柔和甜润玫瑰香的苯乙醇（0.51g/100ml）对陈醋风味提供了一定的贡献（表3）。

表1：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋理化指标的测定结果

表2：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中有机酸的测定结果

表3：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中挥发性香气成分的测定结果

上述山西老陈醋的ph测定用ph计直接测定；山西老陈醋的还原糖、总酯参照gbt19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照gb18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照gbt5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。

上述hplc法测定有机酸含量的具体测定方法为：取样品5g，用超纯水定容至50ml，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统uitimate3000；色谱柱c184.6×150mm，5μm；流动相20mmol/lnah2po4，ph=2.7；进样量20μl；流动速度0.8ml/min；检测器uv210nm；柱温：室温。

上述gc-ms法测定挥发性香气成分的具体测定方法为：采用顶空固相微萃取对样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为vf-5ms（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1ml/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃/min的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70ev，扫描质量范围41‒500amu。