一种杨树腐烂病菌环介导等温扩增快速检测方法与流程

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种杨树腐烂病菌环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术：

杨树腐烂病是杨树的一种危险性枝干病害，主要由金黄壳囊孢菌[cytosporachrysosperma(pers.)fr.]引起。该病害主要发生在树干及枝条上，在主干、大枝处主要表现为干腐型。杨树感病初期病部呈略微肿胀的暗褐色水渍状斑，皮层组织也腐烂变软，同时会出现水浸软组织的现象。后失水下陷，同时树皮将会表现出龟裂状。病斑边缘明显。后在病斑上长出许多针头状小突起，受病组织皮层变成暗褐色，并易与木质部分开。腐烂部位有时可深达木质部，当病斑扩展，病斑在粗皮树种上表现不明显。在1-4年幼树或大树上主要表现为枯枝型，发病初期呈暗灰色，病部迅速扩展，环绕枝条一周后枝条便死亡，后期在病枝上形成许多散生的分生孢子器，并在死亡的枝条上形成子囊壳。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification)是2000年日本学者notomi等人新发明的一种核酸特异性序列体外等温扩增技术(notomietal，2000)。lamp技术的关键在于引物的设计。与传统pcr引物相比较其特异性在于普通的真菌pcr引物只有正向引物和反向引物两种，两种引物分别沿模板连的5’端和3’端按碱基互补配对的原则扩增，而lamp引物是主要是针对要扩增的靶基因的六个不同的区域设计的，分别是基于靶基因3’端的flc区、f2c区和f3c区以及基于靶基因5’端的bl区、b2区和b3区等6个不同的区域位点设计的4种引物，该技术已在各种检测鉴定技术中被证明有着不可比拟的优势并且得到迅速发展，尤其在食物病原细菌以及口腔细菌的检测鉴定中发展迅速(n.sowmyaetal，2012；akihiroetal，2005)。

lamp技术的主要特点在于用两对特殊设计的引物(一对内引物，一对外引物)和具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)在反应中在模板两端的引物结合处不断重复出现单链环状结构，并且使引物可以在等温条件下与模板结合进行连置换扩增反应。与传统的pcr技术相比较，lamp技术克服了传统pcr要通过反复热变性以获取单链模板的缺点，大大节省了反应时间，实现了等温条件下的连续快速扩增，并且其灵敏度与传统的pcr技术相比有了很大的提高(kanekoetal，2007)；同时，lamp引物为2对特异性引物，2对引物是针对靶基因的六个区域设计的，这就使lamp扩增有较高的特异性(akihiroetal，2005；焦文强等，2009)。lamp扩增结果的检测有多种方法：扩增产物电泳检测会出现特征性的阶梯状条带；扩增产物中加入mg²⁺肉眼可见白色浑浊物；扩增产物中加入荧光染料钙黄绿素混匀后，在肉眼中可见绿色荧光。

但lamp技术也存在一些不够完善的地方。第一，lamp扩增产物的检测通常如同pcr，是对产物进行电泳，然后观察扩增条带，由于lamp反应比pcr反应的扩增效率高，这种开管检测的方式更容易引起实验的污染；第二，lamp采用的环引物虽然增加了扩增效率，但容易环引物间的非特异性配对而导致假阳性结果(胡宗悦等，2016)。

目前在杨树腐烂病菌的检测上，主要采用分子生物学检测方法，其中以pcr最为常见，但是pcr需要30～35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(pcr仪)且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。

技术实现要素：

针对背景技术中所述及的问题，本公开提供一种杨树腐烂病菌环介导等温扩增快速检测方法。采用lamp方法检测，检测时间短、无需特殊仪器，检测灵敏度高，特异性好，克服了常规pcr法及血清检测方法的缺陷。

本公开采用以下技术方案：

本公开第一个方面，提供快速检测杨树腐烂病菌环介导等温扩增的引物，所述引物以杨树腐烂病菌基因组为模板设计得到；引物序列如下：

杨树腐烂病菌环介导等温扩增外引物f3：5’-gccctctggtattccagc-3’；

杨树腐烂病菌环介导等温扩增外引物b3：5’-tacctgatccgaggtcaacc-3’；

杨树腐烂病菌环介导等温扩增内引物

fip：5’-gagggaaggtaatgccccaagt-gcctgttcgagcgtcatt-3’；

杨树腐烂病菌环介导等温扩增内引物

bip：5’-ggactccgagcgcagtagtca-agttgggggttttacggc-3’。

lamp引物设计的质量，直接影响检测方法的特异性和灵敏度。本申请人发现在以杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)基因组为模板设计引物序列时，引物扩增位点的选择尤为重要，扩增位点向前或向后移动几个碱基，都会造成设计得到的引物对杨树真菌性腐烂病菌检测呈阴性。本发明人通过大量筛选，筛选得到以上所述引物可以用于快速检测杨树腐烂病菌。

本公开第二个方面，提供快速检测杨树腐烂病菌的试剂盒，包括以上所述快速杨树腐烂病菌环介导等温扩增的引物。

进一步地，所述试剂盒还包括；

试剂a：2×预混反应缓冲液12.5×20μl，

试剂b：反应酶液1×20μl，

试剂c：引物缓冲液1×20μl，

试剂d：阴性对照1ml，

试剂e：阳性对照1ml，

试剂f：荧光染料钙黄绿素溶液。

本公开第三个方面，提供快速检测杨树腐烂病菌的试剂盒，包括预混引物干粉，在使用前加入40μl超纯水，2×20μl；所述引物序列如以上所述；

试剂a：2×u-lampmix12.5×20μl，

试剂b：bstdna聚合酶1×20μl，

试剂c：引物mix1×20μl，

试剂d：超纯水1ml，

试剂e：杨树腐烂病菌基因组模板1ml，10ng/μl，

试剂f：荧光染料钙黄绿素溶液。

本公开第四个方面，提供一种快速检测杨树腐烂病菌环介导等温扩增的反应体系，总反应体系25μl，包括10μl2×u-lampmix，4μl引物mix，2μltempaltedna，1μlbstdna聚合酶，8μlddh2o，以上所述引物各1μl。该体系可保证环介导等温扩增反应的顺利进行。

本公开第五个方面，提供一种快速检测杨树腐烂病菌环介导等温扩增的方法，使用以上所述反应体系，反应条件：65℃恒温50min；80℃10min。在该反应条件下，进行环介导等温扩增，可获得清晰的条带，若反应时间、反应温度发生变化后，无法扩增得到清晰的条带，且样品显色不明显。

本公开第六个方面，提供以上所述快速检测杨树腐烂病菌环介导等温扩增的引物、所述快速检测杨树腐烂病菌的试剂盒，以及以上所述扩增反应体系、扩增方法在检测杨树腐烂病中的应用。

本公开第七个方面，提供一种快速检测杨树腐烂病的方法，包括以下步骤：

(1)杨树腐烂病病斑样品收集；

(2)步骤(1)样品总dna的提取；

(3)采用以上所述环介导等温扩增的反应体系、反应方法进行检测，反应液呈翠绿色的待测样品，即含有金黄壳囊孢病菌的样品，该样品对应杨树患腐烂病组织样品。

进一步地，杨树腐烂病菌样品收集；

进一步地，采用ctab法提取dna。

本公开建立了一种杨树腐烂病菌的环介导等温检测方法，本公开针对目的基因杨树腐烂病菌的6个区域设计了4条特异引物，该4条引物组合特异性强、灵敏度高。

本公开利用一种链置换dna聚合酶在等温65℃，50分钟即可实现核酸的高效扩增；样品提取总dna后，进行lamp反应，反应产物经电泳或者加入荧光染料钙黄绿素溶液直接观察的方法实现杨树腐烂病菌的检快速测。提供的方法对杨树腐烂病菌的检测特异性强，稳定性高，能够特异性地检测杨树腐烂病菌，与其它真菌和细菌无交叉反应；且灵敏度高，检测浓度可达1.55×10^-6ng/μl。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是实施例1lamp引物筛选结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1-3：分别为三套引物检测杨树腐烂病菌感病样品，4-6：依次为三套引物的阴性对照。

图2是实施例1lamp引物筛选结果荧光染料图，1-3：分别为三套引物检测杨树腐烂病菌感病样品，4-6：依次为三套引物的阴性对照。

图3是实施例2lamp反应体系优化结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1、2、3、7、8、9、13、14、15：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系检测杨树腐烂病菌感病样品，4、5、6、10、11、12、16、17、18：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系的阴性对照。

图4是实施例2lamp反应体系优化结果荧光染料图，1、2、3、4、5、6、7、8、9：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系检测杨树腐烂病感病样品，10、11、12、13、14、15、16、16、18：分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i体系的阴性对照。

图5是实施例3lamp特异性检测结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1为田间感染杨树腐烂病菌c.chrysosperma的杨树样品，2、3、4、5分别为botryosphaeriastevensii、b.dothidea、colletotrichumgloeosporioides、c.mandshuricamiura感病样品，6-10：阴性对照。

图6是实施例3lamp特异性检测结果荧光染料图，其中1为田间感染杨树腐烂病菌c.chrysosperma杨树样品，2、3、4、5分别为botryosphaeriastevensii、b.dothidea、colletotrichumgloeosporioides、c.mandshuricamiura感病样品，6～10：阴性对照。

图7是实施例4lamp灵敏性检测结果电泳图，其中m：trans2kplusdnamaker，1-8分别用dna稀释10⁰-10^-7倍做模板，9：阴性对照。

图8是实施例4lamp灵敏性检测结果荧光染料图，其中1-8分别用dna稀释10^-1-10^-8倍做模板，9：阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

材料与试剂：

标本采集在山东省菏泽市赵和桥杨树人工林进行，采集时间选在8、9月份病害发生的高峰期，采集各个发病时期的标本，带回实验室待分离纯化和鉴定。鉴定为目标菌株后-20℃保存。

主要试剂：

bstdna聚合酶：购自北京美莱博医学科技有限公司；

2×ctab缓冲液：本实验室；

2×u-lampmix：购自北京美莱博医学科技有限公司；

钙黄绿素：购自北京索莱宝生物有限公司。

实施例1：建立杨树腐烂病菌环介导等温扩增检测方法

以感染杨树腐烂病菌样品为检测对象，以无核酸ddh2o为阴性对照。

1、引物设计：

根据ncbi上已报道的杨树腐烂病菌c.chrysosperma脱氧核糖核酸序列(kp114131.1c.chrysosperma)，利用lamp引物设计软件primerexplorerv5设计了3套特异引物，引物序列如下(5’-3’)：

第一组引物：

f3：5’-attgcgccctctggtatac-3’(seqidno.1)；

b3：5’-ttgggggttttacggcag-3’(seqidno.2)；

fip：5’-tgccccaacaccaagctggaa-cagagggcatgcctgttc-3’(seqidno.3)；

bip：5’-ggagggtaagccctgaaattcg-agtacagtccagagcgagg-3’(seqidno.4)。

第二组引物：

f3：5’-gccctctggtattccagc-3’(seqidno.5)；

b3：5’-tacctgatccgaggtcaacc-3’(seqidno.6)；

fip：5’-gagggaaggtaatgccccaagt-gcctgttcgagcgtcatt-3’(seqidno.7)；

bip：5’-ggactccgagcgcagtagtca-agttgggggttttacggc-3’(seqidno.8)。

第三组引物：

f3：5’-ttggtgttggggcattgc-3’(seqidno.9)；

b3：5’-ctccggcttttgatatgctc-3’(seqidno.10)；

fip：5’-ctgcgctcggagtcctggtc-ttccctcacgggagggta-3’(seqidno.11)；

bip：5’-gctctggactgtactggcgtc-cctacctgatccgaggtcaa-3’(seqidno.12)。

2、杨树腐烂病菌总dna提取：

采用2×ctab法，具体步骤：

(2.1)取约2g备用菌丝，置于灭菌研钵中，加入液氮快速研磨，重复3次，至菌丝被研磨成粉状；

(2.2)将菌丝粉末转入1.5ml离心管中，加入1ml预热的2×ctab提取液；

(2.3)颠倒混匀，置于水浴锅中，65℃水浴15min，每隔3-4min颠倒混匀一次；

(2.4)室温，10000rpm离心7min，将上清液转移至新离心管；(约600μl)

(2.5)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡15s，至液体呈均一乳白色；

(2.6)室温，12000rpm离心10min，将上清液转移至新离心管；(约400μl)

(2.7)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于4℃静置沉淀30min；

(2.8)室温，12000离心5min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，置于超净工作台下室温干燥5min；

(2.9)加入50μlddh2o，溶解dna，-20℃保存备用。

3、lamp反应及lamp引物的筛选：

反应体系(25μl)如下：10μl2×u-lampmix；4μl引物mix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o

三组引物中引物(f3和b3)1μl，三组引物中引物(fip和bip)1μl，

反应条件：65℃恒温70min；80℃10min。

4、检测：

电泳检测：取5μl扩增产物加1μldnabuffer混匀加入1％的琼脂糖凝胶中电泳，选择d2000为dnamarker，电压设为120v，电泳约30-45min后将凝胶用0.1％的eb染液染色10-15min，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。

或：荧光染料检测：扩增完成后，向扩增产物中直接加入荧光染料钙黄绿素(北京索莱宝生物)溶液1μl，充分混匀后稍离心，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有金黄壳囊孢菌的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有金黄壳囊孢菌的样品。

5、结果分析

电泳检测：在以杨树腐烂病菌样品dna为模板的三组引物中，可以观察到第二组引物呈弥散状的核酸泳带，而第一和第三组引物则没有弥散状核酸电泳带，在以无核酸ddh2o为模板的六组引物中均无核酸电泳条带，阴性对照也无核酸电泳带(图1)。

荧光染色：在以感染杨树腐烂病菌样品dna为模板的三组引物中，可以观察到第二组引物呈翠绿色，而第一和第三组引物和无核酸ddh2o样品橙黄色。图2中，仅有标号为2的ep管呈翠绿色(对应的引物为第二组引物)；其它标号的ep管呈橙黄色。由此可知，在以杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)核苷酸序列为模板设计所得引物，并不是都可以有效扩增，检测出金黄壳囊孢菌。

实施例2：lamp检测体系的优化

采用实例1筛选出的最优引物第二组引物，通过对构建体系的主要影响的两个因素扩增温度和扩增温度筛选、确定最优检测体系。反应体系(25μl)：

a：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：60℃恒温30min；80℃10min。

b：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：65℃恒温30min；80℃10min。

c：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：70℃恒温30min；80℃10min。

d：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：60℃恒温50min；80℃10min。

e：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：65℃恒温50min；80℃10min。

f：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：70℃恒温50min；80℃10min。

g：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：60℃恒温70min；80℃10min。

h：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：65℃恒温70min；80℃10min。

i：10μl2×u-lampmix；2μltempaltedna；1μlbstdna聚合酶；8μlddh2o，引物中引物(f3和b3)1.0μl，引物中引物(fip和bip)1.0μl，反应条件：70℃恒温70min；80℃10min。

lamp结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素溶液后肉眼观察两种方法来分析。通过图3可以看出，a、b、c、d、f、g、i体系中杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)扩增样品没有明显的弥散状核酸电泳带，e、h体系中杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)样品呈弥散状核酸电泳带，其中e体系样品弥散状核酸电泳带比较明亮清晰，h有条带但不是很明亮清晰，对照中均无核酸电泳带；图4中，a、b、c、d、f、g、i体系中杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)扩增样品呈橙黄色，e、h体系中杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)样品呈现绿色荧光，其中e体系样品荧光最亮，对照均呈橙黄色。以上结果说明e体系为最优体系。

实施例3：本发明中lamp检测方法的特异性和稳定性

按上述实施例2反应e体系及反应条件，同时对田间botryosphaeriastevensii、b.、colletotrichumgloeosporioides、cytospora.mandshuricamiura感病样品进行检测，检验lamp方法的特异性及稳定性。以提取的botryosphaeriastevensii、b.dothidea、colletotrichumgloeosporioides、cytosporamandshuricamiura感病样品中提取的dna为检测模板进行lamp扩增反应，lamp结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素肉眼观察两种方法来分析。在图5、6中，仅在杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)反应管中出现了阳性反应出现特异性地翠绿色荧光，其他反应管均为阴性。结果说明本公开中的lamp方法特异性强，稳定性高，能够特异性地检测杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)，与其它真菌无交叉反应。

实施例4：本发明中lamp检测方法的灵敏性

样品：杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)(原始浓度15.5ng/μl)

样品处理：将杨树腐烂病菌(c.chrysosperma)做10⁰-10^-7的倍比稀释。

按上述实施例2反应e体系及反应条件，以稀释后的dna来做lamp的模板进行lamp扩增反应，lamp结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素肉眼观察两种方法来分析。在图7中，稀释10^-7倍时，扩增所得样品进行琼脂糖凝胶电泳，还可得到较为清晰的条带；在图8中，稀释10^-7倍时，扩增所得样品加入钙黄绿素溶液还可呈现特异的翠绿色荧光。结果说明本发明中的lamp方法灵敏性高，能够检测到10^-7的模板(1.55×10^-6ng/μl)。

lamp检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，而且有快速高效、高特异性、高灵敏性的特点，其应用范围越来越广泛，已经在病原微生物检测中发挥出极大的优势。用本实验中描述的lamp方法检测杨树腐烂病菌可以节省大量的时间，而且操作简单。总之，本发明建立了一套快速、简便、特异、灵敏的检测杨树溃疡病菌的方法。因此，有理由相信lamp作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种杨树腐烂病菌环介导等温扩增快速检测方法

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