绒山羊繁殖力基因ESR的分子标记、引物及应用的制作方法

本发明属于绒山羊基因检测技术领域，特别涉及一种绒山羊繁殖力基因esr的分子标记、引物及应用。

背景技术：

繁殖性状在山羊育种中具有较高的经济价值，提高母羊的产仔数对于提高整个养羊业的生产效益具有十分重要的意义。母羊的多羔基因是决定绒山羊繁殖性状的关键因素，而产羔数是一个遗传力很低的数量性状，其遗传力只有0.1左右，因此难以用常规的育种技术来改良产羔数性状。辽宁绒山羊是低繁群体，发情周期和发情时间具有明显的时间规律性，产羔数受外界因素影响很大。因此，提高辽宁绒山羊的繁殖性状、探寻控制繁殖率的相关基因的关键位点至关重要。繁殖力是一个复杂的过程，排卵率、产仔数等繁殖力性状可以由许多小效基因调控，有时也可以由单基因调控，称为繁殖力(fec)基因。关于繁殖力的关键候选基因已有较多研究，但国内外还没有关于esr基因对辽宁绒山羊的产羔数及产绒性能的进行关联分析。雌激素(esr)能刺激雌性动物的副性腺和生殖道，引起第二性征的发育以及性周期的变化，协同fsh、lh作用能使卵泡产生fsh、lh受体。结合了配体的esr与特定的dna序列如雌激素应答元件(ere)相互作用可以改变雌激素基因的转录，进一步影响雌性动物的第二性征、繁殖周期、生殖力和妊娠维持，在胚胎的生长发育中其重要作用

esr的多态性已有研究成果，但大多数都是关于猪的。然而，关于辽宁绒山羊的类似调查报告较少，因此本研究是首次针对群体进行的调查，旨在识别esr基因的多态性，并将它们与产仔数联系起来。在此基础上，分析了辽宁绒山羊产仔数与产绒量的相关性，以期检验多羔基因优势基因型及产绒优势基因型。

技术实现要素：

本发明分子标记c463t可应用于绒山羊的多胎性状及羊绒细度研究。

本发明提供了一种绒山羊繁殖力基因esr的分子标记，所述分子标记为分子标记c463t；

其中，分子标记c463t的核苷酸序列如seqidno.1所示，为：5’-ggaaggaagg[c/t]ccctaattgtca-3’，且核酸序列自5’端起第11位碱基是snp位点。

一种上述的绒山羊繁殖力基因esr的分子标记的pcr特异性扩增引物，分子标记c463t的引物包括：

f：5’-gctcggttctatgtggca-3’，如seqidno.2所示；

r：5’-actggtggatgtggaggtt-3’，如seqidno.3所示。

一种上述绒山羊繁殖力基因esr的分子标记在绒山羊的多胎性状及羊绒细度研究中的应用，包括以下步骤：

s1，提取待测绒山羊的基因组dna；

s2，用分子标记c463t的引物组进行pcr扩增；

其中，扩增体系为：dna模板溶液1μl，各引物溶液0.5μl，10mmol/l的10×dntp取0.5μl，10×taq缓冲液2.5μl，5u/μl的taq酶取0.2μl，ddh2o取20μl；引物浓度均为10μmol/l，dna模板溶液od260/280：1.846；

s3，1％琼脂糖凝胶与溴化乙锭进行电泳鉴定分析；

s4，判断目标snp的基因型；

s5，若含有标记目标snp“cc”组合型，则待测绒山羊为候选的既具有多胎性状又能调控羊绒细度的绒山羊。

优选地，扩增程序均为：95℃3min；94℃30s、58℃30s、72℃30-60s、35个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明分子标记c463t可应用于绒山羊的多胎性状及羊绒细度研究，也可在绒山羊生产实践中应用分子标记c463t作为高繁细型品系选种选育的分子标记辅助选择指标，应用前景良好。

附图说明

图1为本发明实施例2中分子标记c463t的snp位点图。

具体实施方式

下面结合附图1对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，下述实验方法采用分子生物实验技术包括dna提取、pcr扩增、pcr产物的荧光值读取等如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一种绒山羊繁殖力基因esr的分子标记，分子标记为分子标记c463t；

其中，分子标记c463t的核苷酸序列如seqidno.1所示，为：5’-ggaaggaagg[c/t]ccctaattgtca-3’，且核酸序列自5’端起第11位碱基是snp位点。

一种上述的绒山羊繁殖力基因esr的分子标记的pcr特异性扩增引物，分子标记c463t的引物包括：

f：5’-gctcggttctatgtggca-3’，如seqidno.2所示；

r：5’-actggtggatgtggaggtt-3’，如seqidno.3所示。

一种上述绒山羊繁殖力基因esr的分子标记在绒山羊的多胎性状及羊绒细度研究中的应用，包括以下步骤：

s1，提取待测绒山羊的基因组dna；

s2，用分子标记c463t的引物组进行pcr扩增；

其中，扩增体系为：dna模板溶液1μl，各引物溶液0.5μl，10mmol/l的10×dntp取0.5μl，10×taq缓冲液2.5μl，5u/μl的taq酶取0.2μl，ddh2o取20μl；引物浓度均为10μmol/l，dna模板溶液od260/280：1.846；

扩增程序均为：95℃3min；94℃30s、58℃30s、72℃30-60s、35个循环；72℃10min；

s3，1％琼脂糖凝胶与溴化乙锭进行电泳鉴定分析；

s4，采用分子标记c463t引物组判断目标snp的基因型；

s5，若含有标记目标snp“cc”组合型，则待测绒山羊为候选的既具有多胎性状又能调控羊绒细度的绒山羊。

实施例2

试验方法：利用实施例1中绒山羊繁殖力基因esr的分子标记的应用方法，对辽宁省畜牧科学研究院所提供的辽宁绒山羊在合格兽医的监督下，从颈静脉采集提取dna的血样。每只母羊取静脉血5ml，用酚-氯仿法提取基因组dna。然后将dna溶于te缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)中，并在－20℃中保存备用。根据pcp-sscp显带模式对不同基因型进行分型，计算基因型和等位基因频率、χ²值、多态信息含量(pic)、等位基因有效数(ne)和杂合度(he)，计算单核苷酸多态性(snps)或esr基因型之间的关系。应用spss软件(20.0)对具有繁殖性能性状的基因进行最小二乘法分析，结果以“均值±标准误”的形式表达。结果如下：

筛选得到的snp位点：如图1所示，测序后通过基因序列与波峰的比对发现，在esr基因3’-utr区发现了1个分子标记-c463t，snp位点是c/t的突变。

基因型频率和基因频率统计：如表1所示，c463t突变的基因频率和基因型频率在群体内有比较明显的差异，c等位基因频率都大于0.5，说明，c等位基因在辽宁绒山羊群中是优势基因且纯合性比较好；在snp突变位点，u基因(c)为优势等位基因，uu(ct)基因型频率最高，uu(cc)，uu(tt)最低。

在本试验群体中，经hardy-weinberg检验，c463t位点χ²检验值小于0.1，说明实际检测次数与理论检测次数非常接近，实验数据比较可靠，p值大于0.05，说明两位点处于hardy-weinberg平衡状态，基因频率和基因型频率在世代遗传中可稳定遗传给后代。

表1esr基因在群体中的遗传多样性分析

基因座位在群体中的遗传特性：由表2可得分子标记c463t多态信息含量pic在0.25-0.5之间，属于中度多态位点，说明此位点变异程度较高，有望获得更多的遗传进展；分子标记c463t杂合度h比较高，有较大的变异趋向和丰富的遗传多样性；有效等位基因数ne在群体中比较低，说明在发生选择、突变或遗传漂变时，群体保持其等位基因的能力较差。

表2esr基因在群体中的杂合度、有效等位基因数和多态信息含量

基因替代效应：由表3可知，esr基因c463t位点由基因c替代t可以使双羔性能提高6％。

表3双羔母羊基因替代效应分析

产绒性能相关分析：由表4可知，分子标记c463t的snp位点平均产绒量tt与ct相比显著下降4.9％(p<0.05)，自然绒长ct与cc相比显著提高8.1％(p<0.05)，绒细cc与ct相比显著下降2.4％(p<0.05)，净绒率tt与ct、cc相比极显著提高4.6％和3.7％(p<0.01)。snp位点cc基因型绒细较优。

表4各基因型生产性能相关分析

snp与母羊产羔数相关分析：由表5可知，c463t的snp位点cc基因型个体产羔数极显著高于ct、tt基因型个体，分别为9％和15％(p<0.01)。应按照esr检测tt基因型个体筛选淘汰，cc基因型产羔数较优。

表5各基因型产羔数相关分析

综上，在辽宁绒山羊群体中，esr基因共检测发现了1个分子标记c463t。基因型鉴定分析，在辽宁绒山羊群体中cc基因型是双羔优势基因型。分子标记c463t的snp位点是双羔关键位点，且等位基因c与辽宁绒山羊产羔数差异极显著。生产性状对比分析发现，利用分子标记c463t可以在辽宁绒山羊群体中能筛选出细型高繁母羊。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120>绒山羊繁殖力基因esr的分子标记、引物及应用

<141>2019-04-02

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggaaggaagg[c/t]ccctaattgtca23

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gctcggttctatgtggca18

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

actggtggatgtggaggtt19