与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用与流程
本发明涉及与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
蚜虫是影响桃树生长的主要害虫之一，危害桃树的蚜虫有桃绿蚜、桃粉蚜和桃瘤蚜3种，其中以桃绿蚜(greenpeachaphid)危害最重，同时桃绿蚜也是世界范围内广泛分布的植物刺吸式害虫。蚜虫以刺吸式口器从幼嫩的植物组织中吸取汁液，造成植物营养损失，发育受阻，出现生长畸形、早衰、甚至死亡，除刺吸造成的直接危害，蚜虫还是众多植物病毒的传播载体，由此造成的生产损失甚至比蚜虫的直接危害更加严重。农业生产中，蚜虫普遍采用化学农药防治，既增加了生产成本和果品农药残留风险，还会杀灭害虫在自然界的天敌，导致生态环境的污染和破坏。另外，蚜虫已对近些年来广泛应用的有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性，导致其防治难度逐渐增加，培育桃抗蚜品种，是生产中预防桃蚜虫危害的重要途径，有助于从根本上减少蚜虫对桃产业的不良影响。
国内外对桃树抗蚜性状的研究，主要集中在抗蚜种质资源的鉴定、抗性遗传规律分析和抗蚜基因的定位等方面。王力荣等对桃属5个种419份资源进行抗蚜性状的田间鉴定，选出15份抗性资源：山桃、寿星桃和碧桃。通过人工接种后，分析蚜虫的取食和迁飞规律后推测，寿星桃和碧桃类为抗生型抗性，山桃类为趋避型抗性，而国外基于蚜虫精确刺吸电位图谱的规律则得出与之不同的结果，所以，对于桃属植物抗蚜类型的划分还需要进一步的讨论(《settlingbehaviourandreproductivepotentialofthegreenpeachaphidmyzuspersicaeonpeachvarietiesandarelatedwildprunus》，entomologiaexperimentalisetapplicata1998,89(3):233-242，saugemh等)。此前，法国最早开展了对桃树抗蚜性状的研究，并筛选出了三份抗蚜材料：垂枝花桃、砧木品种‘rubira’和山桃‘p1908’。
遗传分析表明，垂枝花桃和‘rubira’对桃绿蚜的抗性均呈显性单基因的遗传，并且抗性表型非常相似，都具有很强的趋避型抗性，即蚜虫不能在其枝稍上繁殖，通常会在3天内离开寄主，且刺吸部位会出现红色或黄色的过敏性坏死斑点。但与垂枝花桃不同，‘rubira’具有很强的诱导型抗性特征，即前期蚜虫的危害会抑制后来蚜虫的危害行为，推测两种材料的调控机理可能并不相同。因此，将垂枝花桃和‘rubira’的抗性调控位点分别命名为了rm1和rm2。lambert等人将rm2位点定位在第1号染色体末端2.88mb的区间内，2016年该团队又将区间缩小至1.14mb(参见《identifyingsnpmarkerstightlyassociatedwithsixmajorgenesinpeach[prunuspersica(l.)batsch]usingahigh-densitysnparraywithanobjectiveofmarker-assistedselection(mas)》，treegenetics&genomes2016,12(6):1-21，lambertp等)。与‘垂枝花桃’和‘rubira’不同的是，山桃对绿蚜蚜虫的抗性是数量性状位点，蚜虫刺吸电位图谱表明山桃为抗生型抗性，其上蚜虫的种群繁殖速率会受到明显的抑制，qtl定位分析表明，山桃中共存在7个影响桃绿蚜抗性的效应位点，主效位点位于第3号染色体上。
公开号为cn107604095a的中国发明专利申请中公开了一种与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的indel标记，所述标记pp-indel-23检测的indel位点对应于lovel1基因组组装的scaffold1的第44057689碱基处，该处的碱基序列为a或agtcaaat，序列方向为5’-3’。当该处的碱基为a时，为抗性标记。该标记与一类毛桃种质或其后代抗绿色桃蚜性状紧密连锁，通过检测pp-indel-23分子标记可以预测桃材料对蚜虫的抗性，获知毛桃类型种质及其后代是否携带抗绿色桃蚜基因，从而应用于桃种质资源筛选或品种检测。但是该文献中仅验证了所述标记与毛桃种质2013-04-20r抗绿色桃蚜性状相关，而未验证其与桃栽培品种、抗蚜优系、野生毛桃及桃野生近缘种的抗蚜性状的关联性，因此其中的抗性标记仅适用于部分群体内部，而不能适用于更大范围的桃群体抗蚜性状的鉴定。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记，该分子标记与抗蚜调控基因rm3相关联，因此能够更大范围的用其检测出桃植株是否具有抗蚜性状。
本发明还提供了用于检测桃抗蚜性状的引物，该引物能够检测出桃植株是否具有抗蚜性状。
本发明还提供了用于检测桃抗蚜性状的试剂盒，该试剂盒能够检测出桃植株是否具有抗蚜性状。
本发明还提供了桃抗蚜性状的检测方法，该方法能够检测出桃植株是否具有抗蚜性状。
本发明还提供了上述的用于检测桃抗蚜性状的引物、用于检测桃抗蚜性状的试剂盒或者桃抗蚜性状的检测方法的应用，能够用于筛选桃种质资源或品种检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明中在抗桃绿蚜性状候选调控基因rm3的定位过程中，发现了一个与其紧密连锁的20bp的特异插入片段(如seqidno.1所示)；调控基因rm3控制抗桃绿蚜性状，含有调控基因rm3的植株则具有抗蚜性状；因此可以根据植株中是否含有这20bp的特异插入片段，判断植株中是否含有调控基因rm3，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。
用于检测桃抗蚜性状的引物，所述引物的扩增区域覆盖与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记的插入位点，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明中根据上述的20bp的特异插入片段设计覆盖改片段的引物，能够检测出植株中是否含有这20bp的特异插入片段，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。
优选的，所述引物的扩增区域还覆盖控制桃抗蚜性状的抗性基因所在的区域，所述抗性基因位于桃基因组1号染色体pp01:45,727,868-45,733,266bp的位置。
桃野生近缘种中存在与rm3基因相似度很高的同源基因，引物的扩增区域还覆盖控制桃抗蚜性状的抗性基因所在的区域可以很好的区分这些近缘种中的同源基因，用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。
优选的，所述引物的序列如下所示：p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’；p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’。
该对引物的扩增片段全长为229bp，覆盖了上述的20bp的特异插入片段，含有抗蚜性状的植株扩增结果为229bp；不含抗蚜性状的植株扩增结果为209bp；可以以此判断植株是否具有抗蚜性状。该对引物扩增片段短，对扩增试剂要求不高，扩增时短，能在聚丙烯酰胺凝胶上检测，更加适用于大规模的样品基因型鉴定。目前已经在10个分离群体近1800个分离单株进行过分析验证，准确率为100％；在140份国内外的桃栽培品种和47份本单位保存的育种优系共180余份材料中检测抗蚜性的准确性为100％；同时使用该引物检测了来源于全国范围的野生毛桃20份，标记的鉴定结果100％准确。
优选的，所述引物的序列如下所示：rm3-0001f：5’-ccatctcgcaagtttggtctga-3’；rm3-9027r：5’-actagtgattggcttagagcggacg-3’。
上述引物能够扩增出rm3完整基因和其附近共9019bp的基因组序列。该对引物扩增所使用试剂成本高，扩增时间长，但应用范围更广，长基因片段扩增引物可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。
用于检测桃抗蚜性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于检测桃抗蚜性状的引物。
本申请中的试剂盒可以检测出与桃抗蚜性状紧密连锁的20bp的indel分子标记，由此可以检测桃植株是否含有抗蚜性状。
一种桃抗蚜性状的检测方法，包括以下步骤：
1)根据与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
提取待测桃的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；
2)根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状。
本发明中的检测方法中扩增区域覆盖与桃抗蚜性状紧密连锁的20bp的indel分子标记的插入位点，因此可以检测出桃植株中是否含有这20bp特异插入片段，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。
所述根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状为：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。
本发明中通过研究发现20bp的特异插入片段与抗桃绿蚜性状候选调控基因rm3紧密连锁；而调控基因rm3控制抗桃绿蚜性状，含有调控基因rm3的植株则具有抗蚜性状；因此可以根据植株中是否含有这20bp的特异插入片段，判断植株中是否含有调控基因rm3，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。
优选的，所述引物的序列如下所示：p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’；p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’。
该对引物的扩增片段全长为229bp，覆盖了上述的20bp的特异插入片段，含有抗蚜性状的植株扩增结果为229bp；不含抗蚜性状的植株扩增结果为209bp；可以以此判断植株是否具有抗蚜性状。
优选的，所述引物的序列如下所示：rm3-0001f：5’-ccatctcgcaagtttggtctga-3’；rm3-9027r：5’-actagtgattggcttagagcggacg-3’。
上述引物能够扩增出rm3完整基因和其附近共9019bp的基因组序列，可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。
上述的用于检测桃抗蚜性状的引物、上述的用于检测桃抗蚜性状的试剂盒或者上述桃抗蚜性状的检测方法在筛选桃种质资源或品种检测中的应用。
上述的引物、试剂盒和方法都可以用在筛选桃种质资源或品种检测中，具体的，可以依靠上述引物、试剂盒和方法鉴定和筛选出含有抗蚜性状桃植株，作为优秀的桃种质资源。
附图说明
图1为本发明中寿星桃来源抗桃绿蚜性状候选调控区间精细定位图；
图2为本发明中精细定位区间内基因表达情况图；
图3为本发明中桃绿蚜性状候选调控精细定位区间内基因功能及表达量分析图；
图4为本发明中新r基因的获得示意图；
图5为本发明中基于bac文库构建与测序对精细定位区间进行重新组装拼接图；
图6为本发明中寿星桃抗蚜品种和感蚜品种的表型图；
图7为本发明中‘01-77-3’x‘中油桃13号’分离后代的蚜虫抗性表型与基因型展示图；
图8为本发明中rm3基因上游的p62f和p62r引物在栽培品种、抗感优系、野生毛桃和桃近缘种中进行抗蚜鉴定的应用表现图；
图9为本发明中rm3基因在光核桃、山桃、甘肃桃和毛桃中的同源基因编码蛋白的序列对比图；
图10为rm3基因全长引物区分寿星桃、光核桃、山桃、甘肃桃和新疆桃等野生近缘种展示图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。‘01-77-3’是由‘87-71’(抗蚜)和‘92-60’(蟠桃)经杂交得到，‘01-77-03’的抗性来自源于‘87-71’，‘87-71’是北京市农林科学院培育的观赏和食用的兼用品种，‘87-71’的抗性来自源于寿星桃(北京地区两用桃育种研究进展[j].北京农业科学，2000，18(6):23-25，刘佳棽，王虞英，宋婧一.)。
桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记的实施例1
本实施例中与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
用于检测桃抗蚜性状的引物的实施例1
本实施例中用于检测桃抗蚜性状的引物的序列如下所示：
p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’(如seqidno.2所示)；
p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’(如seqidno.3所示)。
用于检测桃抗蚜性状的引物的实施例2
本实施例中用于检测桃抗蚜性状的引物的序列如下所示：
rm3-0001f：5’-ccatctcgcaagtttggtctga-3’(如seqidno.4所示)；
rm3-9027r：5’-actagtgattggcttagagcggacg-3’(如seqidno.5所示)。
用于检测桃抗蚜性状的试剂盒的实施例1
本实施例中用于检测桃抗蚜性状的试剂盒包含如下所示的引物：
p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’；
p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’。
用于检测桃抗蚜性状的试剂盒的实施例2
本实施例中用于检测桃抗蚜性状的试剂盒包含dntps、dna聚合酶、pcr缓冲液，以及如下所示的引物：
rm3-0001f：5’-ccatctcgcaagtttggtctga-3’；
rm3-9027r：5’-actagtgattggcttagagcggacg-3’。
桃抗蚜性状的检测方法的实施例1
本实施例中桃抗蚜性状的检测方法，包括以下步骤：
1)根据与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
提取待测桃的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；
2)根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。
上述的引物的序列如下所示：
p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’；
p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’。
桃抗蚜性状的检测方法的实施例2
本实施例中桃抗蚜性状的检测方法，包括以下步骤：
1)根据与桃抗蚜性状紧密连锁的indel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
提取待测桃的基因组dna，利用设计的引物进行pcr扩增；
2)根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。
上述的引物的序列如下所示：
rm3-0001f：5’-ccatctcgcaagtttggtctga-3’；
rm3-9027r：5’-actagtgattggcttagagcggacg-3’。
用于检测桃抗蚜性状的引物在筛选桃种质资源或品种检测中的应用的实施例1
本实施例中所用到的引物为“用于检测桃抗蚜性状的引物的实施例1”中的引物，以待测桃样品的dna为模板，用上述引物进行pcr扩增，当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。挑选出含有抗蚜性状的桃植株作为优秀的桃种质资源。
用于检测桃抗蚜性状的试剂盒在筛选桃种质资源或品种检测中的应用的实施例1
本实施例中的所用到的试剂盒为“用于检测桃抗蚜性状的试剂盒的实施例1”中的试剂盒，其中包含如下所述的引物：
p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’；
p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’。
以待测桃样品的dna为模板，用上述引物进行pcr扩增，当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。挑选出含有抗蚜性状的桃植株作为优秀的桃种质资源。
桃抗蚜性状的检测方法在筛选桃种质资源中的应用的实施例1
本实施例中的所用到的方法为“桃抗蚜性状的检测方法的实施例1”中的方法，根据上述的方法挑选出含有抗蚜性状的桃植株作为优秀的桃种质资源。
桃抗蚜性状的检测方法在品种检测中的应用的实施例2
本实施例中的所用到的方法为“桃抗蚜性状的检测方法的实施例2”中的方法，可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。
试验例1
1、寿星桃来源抗蚜性状调控基因的精细定位、新r基因的发现及关于基因组结构变异的推断
前期研究中通过精细定位将抗桃绿蚜性状候选调控基因rm3锁定在桃1号染色体一个160kb的区间中(如图1所示)，该区间内共有21个基因，通过结合抗感品种桃绿蚜处理后转录组分析(niul,panl,zengw,etal.dynamictranscriptomesofresistantandsusceptiblepeachlinesafterinfestationbygreenpeachaphids(myzuspersicae,sülzer)revealdefenceresponsescontrolledbytherm3,locus[j].bmcgenomics,2018,19(1):846.)，发现区间内共有12个基因表达(如图2所示)。
根据基因表达情况分析发现，定位区间中12个表达的基因在抗感蚜品种接种蚜虫后的变化趋势为没有变化；蚜虫是刺吸式害虫之一，目前已经克隆到的6个刺吸式害虫抗性调控基因都是抗性基因(resistancegene,rgene)rgene，分别是番茄中的mi-1.2、甜瓜中的vat和水稻中的bph1/2/7/9。
从基因功能角度分析定位区间的12个中只有rgene(ppa000596m)与植物抗虫性相关(如图3所示)，故将其视为重点候选基因进行研究。以该基因上游600bp处的插入位点即标记indel-45.734为上游引物，以ppa000596m基因终止子下游的一段序列为下游引物，扩增到了一个全新的抗病基因，命名为rm3(如图4所示)。连锁分析表明该基因位于精细定位区间，但桃参考基因并不存在该基因，说明参考基因组在精细定位区间有大型结构变异，候选调控基因rm3就处于这一结构变异区域，单独依靠桃参考基因应该并不能找到候选调控基因。
2、基于细菌人工染色体文库(bac)重新组装精细定位区间
鉴于候选调控基因rm3很可能位于精细定位区间的结构变异中，因此采用抗性来源品种寿星桃构建了10倍覆盖的的细菌人工染色体文库(bac)，平均插入片段大小110kb，并挑选到4个克隆能够完整覆盖精细定位区间，其中部分克隆已经测序组装完成(如图5所示)。
3、rm3基因序列信息及相关引物设计
通过bac文库克隆并测序，得到rm3完整序列，并且rm3基因确实位于ppa000596m所在的位置(如图5所示)。rm3基因起始密码子前2553bp和终止密码子之后956bp已经得到pcr测序加一代测序验证，全长为9019bp。该片段的扩增引物如下所示：
rm3-0001f：5’-ccatctcgcaagtttggtctga-3'；
rm3-9027r：5’-actagtgattggcttagagcggacg-3'。
pcr扩增采用宝生物
表1pcr扩增反应体系
表2pcr扩增反应程序
对比rm3基因和ppa000596m(如seqidno.11所示)基因序列，发现两个基因的dna序列相似性很高。因此设计的pprm3基因扩增引物为：
上游引物：5’-cttgctaccaagtcaagtgtatagc-3’(如seqidno.6所示)；
下游引物：5’-catttcaagaaattgttgtcactg-3’(如seqidno.7所示)；扩增全长6165bp。
由根据上述的分析内容设计了扩增片段较短的一对引物p62f/p62r，其序列如下所示：
p62f：5’-agttaatttcccaaggtgttctt-3’；
p62r：5’-tgcaaattgtagagaaattgagag-3’。该对引物的扩增产物在200bp左右，既能扩增rm3基因又能扩增ppa000596基因，但rm3基因的对应片段长220bp。该对引物与基因全长的扩增引物都可以用于rm3基因的检测，但p62f和p62r扩增片段短，对扩增试剂要求不高，扩增时短，能在聚丙烯酰胺凝胶上检测，更加适用于大规模的样品基因型鉴定。pcr扩增采用vazymelampdnapolymerase(货号p302-d1)，扩增反应体系如表3所示，扩增反应程序如表4所示。
表3pcr扩增反应体系
表4pcr扩增反应程序
4、rm3相关标记在抗蚜分离群体抗感鉴定及野生近缘种抗感鉴定中的应用效果分析
4.1寿星桃抗蚜性状的鉴定方法
参考pascal等(pascalt,pfeifferf,kervellaj,lacrozejp,saugermh,weberwe.inheritanceofgreenpeachaphidresistanceinthepeachcultivar‘rubira’.plantbreeding,2002,121(5):459-461.)的抗蚜表型鉴定方法和标准，结合人工接蚜鉴定和田间鉴定方法确定分离群体中各单株的抗性有无。人工鉴定：群体分离单株放入网室中进行接种处理，人工接种10头桃绿蚜后套上小纱网，2周后观察蚜虫对新梢的危害，两年连续鉴定。田间条件下鉴定，桃绿蚜是桃树早春最重要的虫害，早春对需要鉴定的群体不进行化学农药防治，让蚜虫虫害自然发生后，鉴定表型。寿星桃对桃绿蚜的抗性是单基因调控的(牛良,鲁振华,曾文芳,崔国朝,潘磊,徐强,李国怀,王志强.‘粉寿星’对桃绿蚜抗性的遗传分析[j].果树学报,2016,33(05):578-584.)，感蚜单株的表型为蚜虫着生和卷叶；抗蚜单株的表型为蚜虫不能着生，短期取食后离开，取食过的嫩茎留下红色的过敏斑点，并且不会发生卷叶现象(如图6所示)。
4.2rm3相关标记在‘01-77-3’x‘中油桃13号’分离群体中的抗性鉴定应用
母本‘01-77-3’(rr)的抗蚜性来源为‘粉寿星’，父本‘中油桃13号’感蚜(rr)，2014年人工授粉杂交，获得147杂种后代，按照段落4.1的方法进行了1年温室鉴定和连续两年田间鉴定，分离单株的抗感蚜性状表型稳定，用p62f和p62r引物检测该群体的抗感蚜基因型和表现型100％一致。如图7所示，从左至右1-4排分别为亲本‘01-77-3’、‘中油桃13号’、单株612至657、701至756和单株801至845，图示为单株用p62f和p62r检测的结果，page胶上面的条带指示rm3，下面的条带指示ppa000596m，条带下字母“r”和“s”分别表示单株抗蚜或感蚜表型。2016年本人所在的课题组组配了大量以抗蚜材料为亲本的杂交组合，9个杂交组合共得到杂种苗1600余株(如表5所示)杂交得到的种子在2017年春季定植前采用p62f和p62r引物基因型后按照抗感分开定植，并于2017年和2018年春季蚜虫危害季节进行两年连续的田间鉴定，鉴定结果表明，该标记在9个组合1600余株的杂种分离后代中鉴定的准确率为100％。
表52017年定植抗蚜组合情况
4.3rm3相关标记在栽培品种、抗感优系、野生毛桃和桃近缘种中进行抗蚜鉴定的应用表现
目前认为rm3基因是控制寿星桃抗蚜性状的调控基因，则其上的相关筛选标记的准确性应该不止在于相关的抗蚜分离群体。因此用rm3基因上游的p62f和p62r引物检测了140份国内外的桃栽培品种和47份本单位保存的育种优系共180余份材料，该标记鉴定的准确度为100％(如图8所示，其中第1-5排，图中寿星桃类抗蚜品种用品种名后加圆圈表示)；又检测了来源于全国范围的野生毛桃20份，标记的鉴定结果100％准确(如图8所示，其中第6排)。
目前研究的蚜虫抗源来自半野生的观赏桃品种寿星桃，寿星桃和栽培桃同属于桃亚属(subgenusamygdalusl.)，此外桃亚属真桃组还包括光核桃、甘肃桃、陕甘山桃、山桃和新疆桃，以上五种植物作为桃的野生近缘种，在新品种选育过程中也会作为亲本材料加以使用，因此有必要对rm3相关抗蚜筛选标记在这些野生近缘种中的筛选效果进行评价。因此用rm3基因上游的p62f和p62r检测了24份的有代表性的桃野生近缘种材料，包括4份光核桃、6份山桃、1份陕甘山桃、5份甘肃桃、6份新疆桃和两份扁桃材料。结果如图8中第7排所示，发现除了新疆桃和扁桃的检测结果的表现型一致外，光核桃、山桃、陕甘山桃和甘肃桃虽然都不具有寿星桃来源的趋避性抗蚜性(其中山桃虽然抗蚜，但是和寿星桃不是一种类型，应认定为不具有本文中提及的抗蚜基因)，但p62f和p62r的检测基因型为抗蚜，说明抗蚜品种中的rm3基因在这4个品种中可能有同源基因存在。因此又对这些4种近缘种进行了进一步研究。
用rm3基因rna扩增引物(rna-f和rna-r)从光核桃、山桃和甘肃桃叶片样品的cdna都能扩增出寿星桃rm3基因同源序列，因为蛋白序列更能反映基因的功能，对rna编码的氨基酸局部序列进行了展示(如图9中所示)，表明rm3基因引物在光核桃、山桃和甘肃桃中扩增到的基因只是他的同源基因而非rm3基因本身，桃野生近缘种中存在与rm3基因相似度很高的同源基因，目前的rm3基因上的引物没能很好的区分这些近缘种中的同源基因。
rna-f和rna-r的引物序列如下所示：
rna-f：5’-tctgctcgagtcggatcggaaggcc-3’(如seqidno.8所示)；
rna-r：5’-cagtgacaacaatttcttgaaatg-3’(如seqidno.9所示)；扩增产物为5632bp。
pcr扩增采用宝生物
表6pcr扩增反应体系
表7pcr扩增反应程序
考虑到同一物种如栽培桃中r基因也存在较多相似性较高的基因，设计用来群分近缘种的引物是沿着rm3基因的附近3kb的范围开展的，最终获得一对引物能够很好的将抗感品种、毛桃和野生近缘种区分开来，即上文提到的rm3-0001f和rm3-9027r，其上游引物位于rm3起始密码子上游2553bp，下游引物位于终止密码子下游956bp，扩增rm3完整基因和附近共9019bp的基因组序列。
pcr扩增采用宝生物
表8pcr扩增反应体系
表9在pcr扩增反应程序
5、rm3功能标记的特点
本文所述标记是基于精细定位和候选基因筛选找到的rm3抗蚜调控基因相关的功能标记，适用范围广；而非单独基于1个分离群体获得的只在群体内部有适用性的标记。
本文所述标记在寿星桃类抗蚜分离群体、栽培种、毛桃和野生近缘种中均具有优异的鉴定区分效能。
本文涉及的抗蚜鉴定标记有两对：(1)短片段扩增引物p62f和p62r：目前已经在10个分离群体近1800个分离单株进行过分析验证，准确率100％；在140份国内外的桃栽培品种和47份本单位保存的育种优系共180余份材料中检测抗蚜性的准确性为100％。该标记试剂成本低，扩增时间短，易用性强；(2)长基因片段扩增引物rm3-0001f和rm3-9027r：能够从桃野生基因种中将寿星桃类抗蚜性状区分出来。该标记试剂成本高，扩增时间长，但应用范围更广。长基因片段标记可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定，短标记可用于亲缘关系材料和寿星桃后代的抗蚜性鉴定，鉴于目前桃新品种选育过程中野生近缘种的利用非常少，短标记即可完成满足几乎全部的寿星桃抗蚜性状的鉴定需求。
<110>中国农业科学院郑州果树研究所
<120>与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<211>20
<212>dna
<213>寿星桃
<221>indel分子标记
<400>1
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<211>23
<212>dna
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<211>22
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<400>6
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<221>rm3-0001f/rm3-9027r扩增序列
<400>10
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