一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法与流程

本发明属于微生物发酵及食品加工领域，涉及一种益生菌发酵食品中的应用方法，特别是涉及一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法。

背景技术：

2001年，fao/who联合将益生菌定义为“摄入足够数量后，对宿主健康提供益处的活的微生物”。被广泛应用的益生菌有乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌等。鼠李糖乳杆菌有较高的细胞黏附能力，可以增强免疫防御、缓解急性腹泻、降低血脂、预防龋齿和小儿湿疹、减少呼吸道感染以及改善克罗恩病症状等，是研究和应用最为广泛的乳杆菌。而益生菌赋予的健康益处和发酵性能具有菌株特异性，所以在株的水平上鉴定区分鼠李糖乳杆菌十分重要。现有的菌株区分手段包括核糖体分型、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型和随机扩增多态性dna技术等基于dna特征的分类方法，操作复杂，需要特殊设备，且耗时较长。生长能力是菌株基因特征和表达调控的具体表现，因而测定不同菌株在不同碳源中的生长能力，能够完成对菌株的区分。主成分分析作为一种常用的多元统计分析方法，可以实现对研究对象的简化与综合评价，还表示观测值和变量的相似性。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有核糖体分型技术的大体操作流程为：菌株纯化-dna提取-酶切-电泳-southernblot-显示，操作极为繁琐、需要特定仪器和一定技术支持等不足，提出一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分。严格限定菌株传代时间(24小时)，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，利用自动生长曲线分析仪在600nm波长处测定12株菌在不同碳源条件下(葡萄糖、蔗糖和乳糖)的吸光度，连续测定48小时(间隔15分钟)，采用主成分分析法对测得的生长曲线进行分析，综合考虑3种碳源，可以有效区分不同的鼠李糖乳杆菌菌株。

本发明的技术方案：一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法如下：

(1)鼠李糖乳杆菌培养

利用生长曲线对12株鼠李糖乳杆菌进行区分，无菌条件下，将12株菌的菌粉接种于mrs肉汤培养基，37℃培养24小时，将复苏的菌液在mrs固体培养基上划线纯化；

(2)鼠李糖乳杆菌形态观察

将纯化的菌落转接至mrs培养基，37℃培养24小时，收集1ml菌液，6000g离心5分钟，用纯净水重悬菌体；吸取10μl至载玻片，固定制片，染色，在光学显微镜100倍油镜下观察菌体形态；

(3)鼠李糖乳杆菌生长曲线测定

严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的mrs肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μl至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样，然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据，重复试验5次；

(4)鼠李糖乳杆菌生长曲线比较

选取所有测定的时间点及其对应的od600nm值，利用simca14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异，采用分类pca的方法对各个菌株所有时间点的od600nm值进行处理，将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类，共12类，直观考察各组之间的相似和差异情况，样本与所选模型的相似度>0.05，记为“×”(相似度高，未区分)，相似度<0.05，记为“√”(相似度低，可区分)；

(4-1)葡萄糖作碳源，pca分类法的比较

在葡萄糖作碳源时，pca分类法的效果较差，151m和hsryfm1301相似度高，bg和f相似度高，bm01和f、grx19、lv1、sp1相似度高，crl1505和f相似度高，f和grx19、hsryfm1301、lv1相似度高，grx19和lv1、sp1相似度高，lv1和sp1相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为5个类型；

(4-2)乳糖作碳源，pca分类法的比较

在乳糖作碳源时，bm01和f、lv1相似度高，f和grx10、grx19、lv1相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为9个类型；

(4-3)蔗糖作碳源，pca分类法的比较

在蔗糖作碳源时，只有151m和hsryfm1301相似度高，bg和grx10相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为10个类型；

(5)鼠李糖乳杆菌菌株的区分

葡萄糖是大多数乳酸菌的偏爱碳源，因而葡萄糖对菌株的区分能力不佳，乳糖和蔗糖的区分能力较好，综合三种碳源下，在试验进行的12株鼠李糖乳杆菌菌株中，均可利用生长曲线数据进行区分。

本发明的有益效果为：本发明提出的一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，鉴定方法科学，原理清晰，利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分，严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，利用自动生长曲线分析仪在600nm波长处测定12株菌在不同碳源条件下的吸光度，连续测定48小时，采用主成分分析法对测得的生长曲线进行分析，综合考虑3种碳源，能够对12株菌进行有效区分。与现有的核糖体分型技术操作流程相比，本发明操作流程为菌株纯化-同步-生长曲线测定-分析，操作简单，成本较低，建立了快捷可靠的株水平上的鼠李糖乳杆菌区分手段。

附图说明

图1是本发明中不同鼠李糖乳杆菌在100×油镜下的镜检图片。

图2是本发明中不同鼠李糖乳杆菌在葡萄糖mrs中的生长曲线。

图3是本发明中不同鼠李糖乳杆菌在乳糖mrs中的生长曲线。

图4是本发明中不同鼠李糖乳杆菌在蔗糖mrs中的生长曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

1.鼠李糖乳杆菌培养

本发明利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分。无菌条件下，将12株菌的菌粉接种于mrs肉汤培养基，37℃培养24小时，将复苏的菌液在mrs固体培养基上划线纯化。

2.鼠李糖乳杆菌形态观察

将纯化的菌落转接至mrs培养基，37℃培养24小时，收集1ml菌液，6000g离心5分钟，用纯净水重悬菌体；吸取10μl至载玻片，固定制片，染色，在光学显微镜100倍油镜下观察菌体形态。

12株鼠李糖乳杆菌的镜检图均呈现典型的杆菌形态。菌株151m、bg、crl1505、grx10、grx19、hsryfm1301、lyo和sp1的菌体形态相似，呈链状。菌株bm01、f、lv1和lv108的菌体形态相似，呈短链(如图1所示)。

3.鼠李糖乳杆菌生长曲线测定

严格限定菌株传代时间(24小时)，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定。将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的mrs肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μl至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样。然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据。重复试验5次。

生长曲线结果如图2、图3、图4所示。鼠李糖乳杆菌在蔗糖中生长差异明显大于葡萄糖，在乳糖中的生长差异居中。

4.鼠李糖乳杆菌生长曲线比较

选取所有测定的时间点及其对应的od600nm值，利用simca14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异。采用分类pca的方法对各个菌株所有时间点的od600nm值进行处理。将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类，共12类。直观考察各组之间的相似和差异情况。样本与所选模型的相似度>0.05，记为“×”(相似度高，未区分)，相似度<0.05，记为“√”(相似度低，可区分)。

(1)葡萄糖作碳源，pca分类法的比较

在葡萄糖作碳源时，pca分类法的效果较差，151m和hsryfm1301相似度高，bg和f相似度高，bm01和f、grx19、lv1、sp1相似度高，crl1505和f相似度高，f和grx19、hsryfm1301、lv1相似度高，grx19和lv1、sp1相似度高，lv1和sp1相似度高，其它菌株均可区分。大致将12株菌分为5个类型(表1)。

表1葡萄糖作碳源时各菌株两两比较的结果

(2)乳糖作碳源，pca分类法的比较

在乳糖作碳源时，bm01和f、lv1相似度高，f和grx10、grx19、lv1相似度高，其它菌株均可区分。大致将12株菌分为9个类型(表2)。

表2乳糖作碳源时各菌株两两比较的结果

(3)蔗糖作碳源，pca分类法的比较

在蔗糖作碳源时，只有151m和hsryfm1301相似度高，bg和grx10相似度高，其它菌株均可区分。大致将12株菌分为10个类型(表3)。

表3蔗糖作碳源时各菌株两两比较的结果

5.鼠李糖乳杆菌菌株的区分

葡萄糖是大多数乳酸菌的偏爱碳源，因而葡萄糖对菌株的区分能力不佳，乳糖和蔗糖的区分能力较好。综合三种碳源下，在试验进行的12株鼠李糖乳杆菌菌株中，均可利用生长曲线数据进行区分。

实施例1

发酵乳中所用菌株的鉴定

将0.5g发酵乳转接至5mlmrs培养基，37℃培养24小时后划线纯化，挑取菌落。将待鉴定菌落和12个母株按本专利所述方法进行生长同步。

将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的mrs肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μl至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样。然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据。重复试验5次。选取所有测定的时间点及其对应的od600nm值，利用simca14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异。在3中碳源条件下均无法进行区分的母株，即待测菌株所属的菌株。

实施例2

发酵剂中菌株的鉴定

将1g发酵剂溶解于5mlmrs培养基，37℃培养24小时后划线纯化，挑取菌落。将待鉴定菌落和12个母株按本专利所述方法进行生长同步。

将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的mrs肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μl至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样。然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据。重复试验5次。选取所有测定的时间点及其对应的od600nm值，利用simca14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异。在3中碳源条件下均无法进行区分的母株，即待测菌株所属的菌株。

实施例3

益生菌饮料中菌株的鉴定

将1ml饮料转接至5mlmrs培养基，37℃培养24小时后划线纯化，挑取菌落。将待鉴定菌落和12个母株按本专利所述方法进行生长同步。

将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的mrs肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μl至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样。然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据。重复试验5次。选取所有测定的时间点及其对应的od600nm值，利用simca14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异。在3中碳源条件下均无法进行区分的母株，即待测菌株所属的菌株。