检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及所用引物与流程

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于荧光定量pcr检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及应用。

背景技术：

铁皮石斛属于兰科植物，是南亚和东南亚最受欢迎的附生多年生草本植物之一。在中国，它主要分布在安徽，浙江，福建，广西，四川和云南省。铁皮石斛是一种重要的中药。野生铁皮石斛主要附生或岩生在海拔较高的古树和峭壁上，与微生物协同共生是其适应特殊生境的自然选择。因此目前对于铁皮石斛中的内生菌的相关研究也越来越受到重视。而在铁皮石斛人工培育过程中，常用的杀菌剂及杀菌方法只能对于石斛表面病原菌有消杀作用，而对于其内生菌的作用极其有限。这就导致了石斛移植苗往往处于带菌状态。

铁皮石斛黑斑病是铁皮石斛移植苗中常见的真菌病害之一，最早报道是发生在浙江义乌。目前全国各石斛产区均有黑斑病发生，以浙、滇、桂、贵等省份发病较为严重。在云南西双版纳、文山、德宏、普饵等地的石斛基地的铁皮石斛、金钗石斛和齿瓣石斛常有黑斑病发生，发病率在30％左右。而浙江地区铁皮石斛黑斑病发病严重，每丛铁皮石斛中的病株数高达50％左右，每株上的病叶数同样高达50％，发病率最低都在30％以上，病株叶片后期枯黄脱落(图1)，影响铁皮石斛产量及品质，严重制约石斛产业的发展。以往有报道表明，链格孢属真菌和枝孢属真菌为诱发铁皮石斛黑斑病的病原真菌。

实时定量pcr技术作为一种高效的检测手段，已被广泛用于真菌多样性的检测。其主要扩增的是真菌核糖体转录间隔区(internaltranscribedspacer，its)部分序列。该区域作为非编码区，具有相对进化速度快，选择压力较小等特点，具有很高的可变性，因此被广泛用于真菌的分类和鉴定中。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种一种基于荧光定量pcr检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法所用的特异性引物：

通用正向引物f4：5'-cgatgaagaacgcagcgaaatgc-3'；

针对链格孢属的反向引物cla-r：5'-gcgaggcttgagtggtgaaatga-3'；

针对枝孢属的反向引物alt-r：5'-agcttgagggtacaaatgacgctcgaa-3'。

本发明还同时提供了利用上述特异性引物进行的检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法，包括以下步骤：

1)、设定引物：

包括通用正向引物f4、针对链格孢属的反向引物cla-r、针对枝孢属的反向引物alt-r；

还包括针对内参基因的正向引物gapdh-f、反向引物gapdh-r；

gapdh-f：5'-caaggactggagaggtggaaga-3'，

gapdh-r：5'-caaggactggagaggtggaaga-3'；

2)、配置反应体系(20μl)：

10μl2*superrealpremix，0.6μl正向引物(10μm)以及0.6μl反向引物(10μm)，80ng待测样品的基因组，0.4μlroxreferencedye；rnase-freeddh2o加至总体积20μl；

3)、qpcr反应程序为：

95℃，15min；

95℃，10sec；60℃，32sec，循环40次；

95℃，15sec；60℃，1min；95℃，30sec；60℃，15sec；

4)、判定：

以表现有黑斑病症状的发病铁皮石斛作为样品、以健康铁皮石斛作为对照(所述健康铁皮石斛是植株叶片表面没有黑斑病症状)；

当以植物gapdh作为内参基因时，正向引物选用gapdh-f，反向引物选用gapdh-r；从而获得样品的ct样品内参和对照的ct对照内参；

当为针对铁皮石斛中链格孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用cla-r；从而分别样品的ct(链)样品以及对照的ct(链)对照；

当为针对枝孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用alt-r；从而分别样品的ct(枝)样品以及对照的ct(枝)对照；

δct(链)样品＝ct(链)样品-ct样品内参，δct(链)对照＝ct(链)对照-ct对照内参，δδct(链)＝δct(链)样品-δct(链)对照，依据δδct(链)的值，判断样品中链格孢属真菌相对生物量变化情况；

δct(枝)样品＝ct(枝)样品-ct样品内参，δct(枝)对照＝ct(枝)对照-ct对照内参，δδct(枝)＝δct(枝)样品-δct(枝)对照，依据δδct(枝)的值，判断样品中枝孢属真菌相对生物量变化情况。

作为本发明的检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法的改进，步骤4)中：

当δδct(链)＜0时，判定样品中链格孢属真菌相对生物量增加；

当δδct(枝)＜0时，判定样品中枝孢属真菌相对生物量增加。

相对生物量＝2^-δδct。

说明：作为样品的发病铁皮石斛、作为对照的健康铁皮石斛，这2者必须是同一产地的。

本发明的qpcr反应结果，当溶解曲线为双峰时，说明反应可能存在污染，需要重新进行。当溶解曲线为单一峰时，继续进行如下操作：当15≤ct值≤35，判定待测样品存在链格孢属/枝孢属；当ct值＜15时，判定为需要重新进行实验(即，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值，数据不采纳，需稀释模板重新实验)；当ct值＞35，判定为不存在链格孢属/枝孢属。

本发明是一种基于荧光定量pcr检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法，用于高效便捷检测引起铁皮石斛黑斑病的病原真菌相对生物量的变化。本发明针对铁皮石斛黑斑病病原(链格孢属和枝孢属)真菌的its序列，分别设计特异性引物，从而实现对这两类病原菌的高效快速鉴定。

本发明基于荧光实时定量qpcr技术，对于样品中的链格孢属和枝孢属的病原真菌相对生物量(即，相对于植物内参基因gapdh)进行检测。其中，f4和cla-r这对引物特异性地检测样品中枝孢属病原真菌的积累量；使用f4和alt-r这对引物特异性地检测样品中链格孢属病原真菌的相对生物量。

本发明的发明过程如下：

1)、针对铁皮石斛黑斑病叶的宏基因组数据，鉴定到了两株病原真菌gxdf3和gxdf24，分别属于链格孢属和枝孢属真菌。

以铁皮石斛黑斑病病叶为材料，对其中的微生物进行宏基因组测序；分别得到了能够引起铁皮石斛黑斑病的病原真菌gxdf3和gxdf24的部分its序列，分别如下：

gxdf3-its：

tctatgagcgggctggacctctcggggttacagccttgctgaattattcacccttgtcttttgcgtacttcttgtttccttggtgggttcgcccaccactaggacaaacataaaccttttgtaattgcaatcagcgtcagtaacaaattaataattacaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtagtgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctttggtattccaaagggcatgcctgttcgagcgtcatttgtaccctcaagctttgcttggtgttgggcgtcttgtctctagctttgctggagactcgccttaaagtaattggcagccggcctactggtttcggagcgcagcacaagtcgcactctctatcagcaaaggtctagcatccattaagccttttttttcaacttttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagccgggaggaaagxdf24-its：

ggttgctgacccggtctaccaccgggatgttcataaccctttgttgtccgactctgttgcctccggggcgaccctgccttcgggcgggggctccgggtggacacttcaaactcttgcgtaactttgcagtctgagtaaacttaattaataaattaaaacttttaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgttcgagcgtcatttcaccactcaagcctcgcttggtattgggcaacgcggtccgccgcgtgcctcaaatcgaccggctgggtcttctgtcccctaagcgttgtggaaactattcgctaaagggtgctcgggaggctacgccgtaaaacaaacccatttctaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaagccgggaggaa。

2)、依据gxdf3-its和gxdf24-its序列，设计了针对链格孢属和枝孢属的通用正向引物f4以及分别针对链格孢属和枝孢属真菌的反向引物cla-r和alt-r。

3)、荧光实时定量pcr检测

使用天根生化科技公司的superrealpremixplus(sybrgreen)试剂盒进行试验，使用appliedbiosystems7500荧光定量pcr仪以及配套96孔板。

具体方法步骤如下：

1，根据说明书配置20μl反应体系；即加入10μl2*superrealpremix，0.6μl正向引物(10μm)以及0.6μl反向引物(10μm)，80ng基因组，0.4μlroxreferencedye；rnase-freeddh2o加至总体积20μl。

分别使用正向引物(f4：5'-cgatgaagaacgcagcgaaatgc-3')和cla-r：5'-gcgaggcttgagtggtgaaatga-3'和alt-r：5'-agcttgagggtacaaatgacgctcgaa-3')来确定铁皮石斛中链格孢属和枝孢属真菌的相对生物量。gapdh用作内参(gapdh-f：5'-caaggactggagaggtggaaga-3'和gapdh-r：5'-caaggactggagaggtggaaga-3')。使用superrealpremixplus(tiangen，china)进行实时荧光定量pcr。

当为针对铁皮石斛中链格孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用cla-r；

当为针对枝孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用alt-r；

当以植物gapdh作为内参基因时，正向引物选用gapdh-f，反向引物选用gapdh-r。2，使用两步法进行qpcr；程序如下：

3，观察溶解曲线是否为单一峰。使用软件导出ct值进行相对定量的分析。

通过appliedbiosystem7500序列检测系统自动计算阈值循环(ct)值，并且通过使用比较ct(2^-δδct)方法计算病原体的相对比例作为相对量值。使用t检验方法评估值之间的差异。

在本发明中，使用改良的十六烷基三甲基溴化铵法对植物样品总基因组进行提取，并通过琼脂糖凝胶电泳、借助nanodropnd-1000分光光度计定量测定基因组dna的质量。

本发明根据能够引起铁皮石斛黑斑病的两类真菌(链格孢属和枝孢属)its序列，设计特异性引物，从而实现对这两类病原菌的动态变化检测。相比于传统基于微生物培养方法鉴定病原真菌过程，本发明能够在短时间内完成病原真菌的动态变化检测，也能够在短时间完成对真菌病原物的种属鉴定，且不依赖于传统微生物培养技术，为铁皮石斛黑斑病的预警和防治提供了新的方法和新思路。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为荧光定量pcr检测铁皮石斛病叶中链格孢属病原真菌的熔解曲线图。

图2为荧光定量pcr检测铁皮石斛病叶中枝孢属病原真菌的熔解曲线图。

图3为荧光定量pcr检测铁皮石斛病叶中内参基因gapdh的熔解曲线图。

图4为基于荧光实时定量qpcr技术对3个地区采集的铁皮石斛叶片样本进行链格孢属病原真菌相对生物量变化的检测(*表示p值<0.05，**表示p值<0.01)。ja：吉安县。jx：嘉兴县。yk：永康县。

图5为基于荧光实时定量qpcr对3个地区采集的铁皮石斛叶片样本进行枝孢属病原真菌相对生物量变化的检测(*表示p值<0.05，**表示p值<0.01)。ja：吉安县。jx：嘉兴县。yk：永康县。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、铁皮石斛叶片总基因组的提取

分别采集了嘉兴、吉安、永康三地的铁皮石斛样品，各分为健康组和发病组，使用改良的十六烷基三甲基溴化铵法对植物样品总基因组进行提取，具体如下：

1、配置ctab溶液，酚-氯仿-异戊醇(25：24：1体积比)混合液，氯仿-异戊醇(24：1体积比)混合液。

ctab溶液配置：每1lctab裂解液需要20gctab，81.816gnacl，2.9225gedta-na2，12.114gtris，以及10gpvp40.溶液ph调至8.0。用去离子水定容至1l。

2、将新鲜的铁皮石斛叶片样品在液氮中研磨至细粉状，再以0.2g每管为单位分装，部分存放在-80℃冰箱冷冻保存，部分进行下述dna提取。

3、将ctab溶液在65℃预热，再向每管样品中加入1mlctab裂解液并加入终浓度为1％β-巯基乙醇，立即振荡混匀。65℃金属浴60min，期间每20min上下颠倒混匀一次。

4、12000rpm，4℃离心10min。

5、取上清，加入2/3体积的酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)混合液，混匀后12000rpm，4℃离心10min。

6、取上清，加入2/3体积的氯仿-异戊醇(24：1)混合液，混匀后12000rpm，4℃离心10min。

7、重复上一步骤(即，重复步骤6)，直至中间层变薄至几乎消失。

8、取上清，加入1体积的无水乙醇(-20℃预冷)。在-20℃冰箱静置30min以上。

9、10000rpm，4℃离心10min。

10、弃上清，用70％的酒精洗涤两次。

11、10000rpm，4℃离心10min。真空干燥15min。

12、加入100μl去离子水。取5μl进行凝胶电泳，观察条带；当条带清晰时，可进行后续实验。反之，当没有清晰条带时，重新提取。

实施例2、铁皮石斛黑斑病病原(链格孢属和枝孢属)真菌的检测

将实施例1所得的3种产地的铁皮石斛使用天根生化科技公司的superrealpremixplus(sybrgreen)试剂盒进行试验，使用appliedbiosystems7500荧光定量pcr仪以及配套96孔板。

每种产地均选择三个健康铁皮石斛(植株叶片表面没有黑斑病症)作为对照、另选择三个发病的铁皮石斛(植株叶片表面已经出现黑斑病症)作为样品。每组样品进行三个技术重复。

具体如下：

1，根据说明书配置20μl反应体系。即加入10μl2*superrealpremix，0.6μl正向引物(10μm)以及0.6μl反向引物(10μm)，80ng基因组(实施例1所得)，0.4μlroxreferencedye；rnase-freeddh2o加至总体积20μl。

说明：

当为针对铁皮石斛中链格孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用cla-r；

当为针对枝孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用alt-r；

当以植物gapdh作为内参基因时，正向引物选用gapdh-f，反向引物选用gapdh-r。2，使用两步法进行qpcr；程序如下：

3、经过验证，3对引物扩增产物的熔解曲线均为单一峰(如图1，图2，图3所示)，表明本方法中使用的3对引物：f4和cla-r、f4和alt-r、gapdh-f和gapdh-r，能在铁皮石斛样品中扩增出特异性产物。为了进一步确定产物的特异性，分别将f4和cla-r、f4和alt-r两对引物扩增之后的产物，进行常规dna测序。结果表明f4和cla-r扩增产物序列属于gxdf3-its，而属于f4和alt-r这对引物扩增产物属于gxdf24-its。以上结果表明，f4和cla-r、f4和alt-r两对引物能够分别从铁皮石斛样品中特异性地检测链格孢属和枝孢属真菌。

所得ct值所得结果如下：

表1、嘉兴、吉安、永康三地健康植株(作为对照)中链格孢属和枝孢属病原真菌的平均ct值

表2、嘉兴、吉安、永康三地发病植株(作为待测样品)中链格孢属和枝孢属病原真菌的平均ct值

4、随后基于ct值进行相对定量的分析。通过比较ct(2^-δδct)方法计算病原体的相对比例作为相对量值。用t检验检验其与健康样品对照对比是否存在显著差异(如表3、表4和图4、图5所述)。

具体为：

以表现有黑斑病症状的发病铁皮石斛作为样品(待测样品)、以健康铁皮石斛作为对照，所述健康铁皮石斛为植株叶片表面没有黑斑病症状；

当以植物gapdh作为内参基因时，正向引物选用gapdh-f，反向引物选用gapdh-r；从而获得样品的ct样品内参；和对照的ct对照内参；

当为针对铁皮石斛中链格孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用cla-r；从而分别样品的ct(链)样品以及对照的ct(链)对照；

当为针对枝孢属的检测时，正向引物选用正向引物f4，反向引物选用alt-r；从而分别样品的ct(枝)样品以及对照的ct(枝)对照；

δct(链)样品＝ct(链)样品-ct样品内参，δct(链)对照＝ct(链)对照-ct对照内参，δδct(链)＝δct(链)样品-δct(链)对照，当δδct(链)＜0时，判定样品中链格孢属真菌相对生物量增加；

δct(枝)样品＝ct(枝)样品-ct样品内参，δct(枝)对照＝ct(枝)对照-ct样品内参，δδct(枝)＝δct(枝)样品-δct(枝)对照，当δδct(枝)＜0时，判定样品中枝孢属真菌相对生物量增加。

相对生物量＝2^-δδct，

当相对生物量(2^-δδct(枝))＞1时，判定成发病样品枝孢属真菌相对生物量增加；当相对生物量(2^-δδct(链))＞1时，判定成发病样品中链格孢属真菌相对生物量增加。

说明：作为样品的发病铁皮石斛、作为对照的健康铁皮石斛，这2者必须是同一产地的。

表3、嘉兴、吉安、永康三地发病植株中枝孢属病原真菌的相对生物量

表4、嘉兴、吉安、永康三地发病植株中链格孢属病原真菌的相对生物量

注：标准差由office2016excel中的stdev函数根据每个样品的三个技术重复的δct数值验算获得。p值由office2016excel中的student'sttest函数根据每个样品的三个技术重复的δct数值验算获得。

根据上述表3、表4的标准差与p值，可说明经t检验，上述数据满足2^-δδct(链),2^-δδct(枝)均大于1且p值<0.05，说明铁皮石斛黑斑病发生之后，植株体内链格孢属和枝孢属病原生物量上调。

验证实验1、将实施例1的嘉兴、吉安、永康三地的铁皮石斛样品按照本行业公认的检测精度高的宏基因组高通量测序法进行检测；

宏基因组验证方法：对植物组织进行基因组提取，使用its通用引物its906(5′-aactttyrrcaayggatctc-3′)和1453r(5′-aagttcagcgggtadyccta-3′)进行扩增，于miseq平台上进行illumuna测序。测序结果用采用uclust与rdpclassifier进行分类，alpha多样性分析与beta多样性分析后在属水平上进行主成分分析，得出相对于对照(健康铁皮石斛)，患病样品的链格孢属与枝孢属丰度更高。

这与实施例2中所得结果相符。因此，证明上述表3、表4结论的正确性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江理工大学

<120>检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及所用引物

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgatgaagaacgcagcgaaatgc23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcgaggcttgagtggtgaaatga23

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agcttgagggtacaaatgacgctcgaa27

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caaggactggagaggtggaaga22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

caaggactggagaggtggaaga22