一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用，属于微生物应用
技术领域：
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背景技术：
：植物真菌病害给农业生产带来巨大损失。白粉病是在许多重要农作物上发生普遍、危害严重，较难防治的一种世界性病害。子囊菌亚门白粉病目的真菌均能引发白粉病，病原物种类很多。该类病菌在温度到10-30℃分生孢子均可萌发，对湿度要求不高，正常情况下10天即可完成一次侵染循环；因此造成了作物一个生长季节能反复多次受到侵染，一旦发生很快爆发流行的特点，尤其是大棚温室种植环境下，给农业生产造成了巨大的损失。白粉病是一个病害症状的描述，但不同作物上白粉病危害程度差异较大，而且病原菌也是差异较大，分别属于不同的科、不同的属、不同的种，因此对不同作物上白粉病防控难易程度、操作技术及方法包括使用菌剂时间、菌剂量等有很大差异。不同作物白粉病致病菌种类表1所示。表1.不同作物白粉病种类及其病原菌病害名称病原菌中文名字寄主专一性草莓白粉病sphaerothecaaphanis羽衣草单囊壳菌专一番茄白粉病leveillulataurica鞑靼内丝白粉菌寄主宽泛黄瓜白粉病sphaerothecafuliginea单丝壳白粉菌专一西甜瓜白粉病sphaerothecafuliginea单丝壳白粉菌专一西瓜白粉病sphaerothecacucurbitae瓜类单囊壳白粉菌寄主宽泛西瓜白粉病erysiphecichoracearum菊科白粉菌寄主宽泛牡丹白粉病erysiphecichoracearum菊科白粉菌寄主专一性西葫芦白粉病erysiphealphitoides粉状白粉菌寄主宽泛冬青白粉病erysiphealphitoides粉状白粉菌专一小麦白粉病blumeriagraminis禾本科布氏白粉菌专一茄子白粉病sphaerothecafuliginea单丝壳白粉菌专一枸杞白粉病arthrocladiellamougeotii穆氏节丝壳属专一南瓜白粉病podosphaeraxanthil苍耳单囊壳白粉菌寄主宽泛南瓜白粉病erysiphecichoracearum菊科白粉菌寄主宽泛草莓白粉病为低温高湿病害，引起草莓白粉病的病原菌为子囊菌亚门单囊壳属的羽衣草单囊壳菌(sphaerothecaaphanis)。该病原菌具有以下特点：专性寄生，菌丝体或分生孢子在病株或病残体中越冬或越夏，分生或子囊孢子表皮直接侵入，发病潜育期5-10天，7天后产分生孢子，循环侵染，侵染最适温度15-25℃；相对湿度80％，雨水不利于孢子萌发，低于5℃或高于35℃均不利于发病，保护地比陆地栽培发病早、时间长、危害重，长期高温干旱与高温高湿交替出现时，发病较重，连续阴、雨、雾、雪等少日照容易发病，偏施氮肥，容易患病；增施磷钾肥发病轻。瓜类白粉病目前也是普遍发生，引起该病害的菌为瓜类单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)。由于近年来，白粉病菌已产生一定抗药性，而且一年四季均可发病，给防治带来一定难度。一般年份减产在10％左右，流行年份减产在20％-40％左右。苗期至收获期均可染病，主要危害叶片，叶柄和茎蔓次之。一般不侵染瓜条。叶片染病初始在叶片背面或正面产生白色粉状小园斑，后逐渐扩大为不规则、边缘不明显的白粉状霉斑。随着病情发展，病斑连接成片，布满整张叶片，受害部分发现褪绿和发黄，发病后期病斑上产生许多黑褐色的小黑点。最后白色粉状霉层老熟，变成灰白色。发病严重时，病叶组织变为黄褐色而枯死。高湿条件下，病菌也可以侵染茎蔓和花器，产白色粉斑，症状与叶片类似，病斑较小。瓜类白粉病发病盛期主要在4月上中旬至6月下旬。危害保护地黄瓜，秋植黄瓜9月下旬至11上中旬也有危险发生。最适宜发病的气候条件为温度16-25℃，相对温度80％以上。保护地栽培黄瓜因通风不良，栽培密度过高，氮肥施用过多、田块低洼而发病较重。葡萄白粉病发生比较普遍，流行年份对果实品质和产量往往造成很大损失。同时还影响枝条的生长发育及葡萄二年的生长发育。白粉病病菌可侵染葡萄所有的绿色组织。叶片被害时，呈现大小不等的褪绿斑块，之后产生白色粉状物覆盖在病斑上，后期粉斑下的叶表面呈褐色花纹，严重时叶片焦枯脱落。有时在病上产生黑色小粒点。幼叶感病后常皱缩、扭曲，且发育缓慢。穗轴感病后组织变脆、易断。幼果感病，果面布满白粉，果粒易枯萎脱落，有的果面出现黑褐色网状花纹。病果停止生长，畸形、果肉质地变硬、味酸，果粒易开裂引起腐烂。葡萄开花后幼果期是发病高峰。温度高湿度大的闷热天气最易发病，雾天的夜晚流行很快。连续下雨，或真正高温都会遏止该病的流行和发生。果穗套袋前如用药不严格，成熟期的果实就会因白粉病感染发生裂果。茄子白粉病是茄子常见病害之一，其病原菌为单囊壳菌瓜类单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)。各菜区都有发生，露地栽培，保护地栽培时均可发生危害，但保护地栽培明显重于露地栽培。生长期间温暖、多雨天气多的年份发病严重。发病严重时叶片正反面全部被白粉覆盖。茄子白粉病主要危害叶片。发病初期叶面出现不规则褪绿黄色小斑，叶背相应部位则出现白色小霉斑，以后病斑数量增多，白色粉状物日益明显而呈白粉斑。白粉状斑可相互连在一起，扩展后遍及整个叶面，严重时叶片正反面全部被白粉覆盖，最后导致叶片变黄干枯。茄子白粉病最适宜发病的气候条件为温度16-24℃，相对湿度45-75％；相对湿度超过95％时则病害的发展被抑制。茄子的感病敏感生育期在开花结果期。地势低洼、排水不良、作物长势差、连作及栽培上种植过密、通风透光差、偏施氮肥的田块发病严重。年度间以春夏温暖、多雨天气的年份发病严重。小麦白粉病是世界性病害，在各主要产麦国均有分布，我国山东沿海、四川、贵州、云南发生普遍，为害严重。该病可侵害小麦植株地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主，发病重时颖壳和芒也可受害。初发病时，叶面出现1-2mm的白色霉点，后逐渐扩大为近圆形至椭圆形白色霉斑，霉斑表面有一层白粉，遇有外力或振动立即飞散。这些粉状物就是该菌的菌丝体和分生孢子。后期病部霉层变为灰白色至浅褐色，病斑上散生有针头大小的小黑粒点，即病原菌的闭囊壳。因此小麦白粉病扩散的非常快，造成植株生长缓慢，长不高，叶片发黄，影响结穗，是种植户最重视的病害。该菌剂能不能通过早期施用，提高小麦抗病力，以求达到完全抑制白粉病，值得继续试验研究。花卉的经济价值很高。在花卉种植中，白粉病是重要病害之一，近几年来，白粉病在月季等花卉上严重发生，各花卉产区的发生面积一年比一年大。花卉白粉病发生的适宜温度是15-25℃，无论环境干燥还是在湿度高的条件下，白粉病都可以蔓延传播。目前生产中对白粉病的防治仍然以化学防治为主，但由此带来的“3r”负面影响非常严重；化学农药的大量使用严重破坏了生态环境，导致作物中大量的农药残留，影响人们身体健康。尤其在草莓产业、西瓜产业，对白粉病病的防治手段同样也是以化学农药为主，这不仅影响人民的身体健康，也限制了果实产品的加工与出口。我国已将发展生物农药和绿色食品列入了《中国21世纪议程》要求北京市及周边地区作物病害实现绿色防控、农业产品实行绿色生产。白粉病是一个病害症状的描述，但不同作物上白粉病危害程度差异较大，而且病原菌也是差异较大，分别属于不同的科、不同的属、不同的种，因此对不同作物上白粉病防控难易程度、操作技术及方法包括使用菌剂时间、菌剂量等有很大差异。芽孢杆菌(bacillusspp.)在土壤中普遍存在，是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群之一，由于产生内生芽孢，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中因干燥、热和紫外辐射所造成的伤害，维持自身生存能力不受影响。这个生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景，特别是在使用活菌制剂的生物制品中表现出强大的生命力。芽孢杆菌种类繁多，数量巨大，能够产生多种多样的生理活性物质和代谢产物，具有广泛的工业应用前景。贝莱斯芽孢杆菌在自然界中分布十分广阔，鉴于白粉病较难防控，不能离体培养，对应药剂筛选技术门槛高，生测实验难度大，试验成本高，不同作物白粉病理化差异巨大等因素，目前尚未有防治多种作物的白粉病贝莱斯芽孢杆菌的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)，菌株为wz1，保藏号为cgmccno.16510。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)的菌株号为wz1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmccno.16510。所述述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1的16srdna序列seqidno.1所示。所述贝莱斯芽孢杆菌wz1的形态学特征为：菌株wz1的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在lb培养基上不产色素，菌落为白色不透明或菌落颜色微偏黄，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有轻微褶皱，变为乳脂色。所述贝莱斯芽孢杆菌wz1的生理生化特征为革兰氏染色阳性；可利用或吸收l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-甘露糖、l-山梨糖、鼠李糖、半乳糖醇、肌醇、d-甘露糖醇、d-山梨糖醇、熊果苷、马栗树皮甙、水杨苷、d-麦芽糖、乳糖、葡糖酸钾、potassium2-ketogluconate、potassium5-ketogluconate、龙胆二糖、淀粉、肝糖、d-棉子糖；不可利用或吸收赤藻糖醇、d-阿拉伯糖、l-木糖、核糖醇、甲基-β-d-吡喃木糖苷、甲基-α-d-吡喃甘露糖苷、n-乙酰基葡萄糖、d-蜜二糖、菊粉、d-松三糖、木糖醇、d-松二糖、d-来苏糖、d-塔格糖、d-岩藻糖、l-岩藻糖、d-阿拉伯糖醇。所述贝莱斯芽孢杆菌wz1的环境耐受性表现为于含有1％-7％(质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10％(质量含量)氯化钠的培养基中生长弱或不可生长，于ph4.5-9.0的培养基中均可正常生长，在ph4.0下生长势弱，ph9.9下不可生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃-80℃下处理15min，仍可正常生长。本发明的目的也在于提供一种病原菌抑制剂，其活性成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其发酵液。本发明的目的也在于提供一种病害抑制剂，其活性成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其发酵液。本发明的目的还在于提供上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其发酵液在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。所述病原菌为下述至少一种：a、草莓白粉病病原菌；b、番茄白粉病病原菌；c、黄瓜白粉病病原菌；d、西甜瓜白粉病病原菌；e、西瓜白粉病病原菌；f、牡丹白粉病病原菌；g、冬青白粉病病原菌；h、小麦白粉病病原菌；i、茄子白粉病病原菌；j、枸杞白粉病病原菌。所述病害为下述至少一种：a、草莓白粉病；b、番茄白粉病；c、黄瓜白粉病；d、西甜瓜白粉病；e、西瓜白粉病；f、牡丹白粉病；g、冬青白粉病；h、小麦白粉病；i、茄子白粉病；j、枸杞白粉病。其中，所述草莓白粉病病原菌为羽衣草单囊壳菌(sphaerothecaaphanis)；所述番茄白粉病病原菌为鞑靼内丝白粉菌(leveillulataurica)；所述黄瓜白粉病病原菌为单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；所述西甜瓜白粉病病原菌为单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；所述西瓜白粉病病原菌为瓜类单囊壳白粉菌(sphaerothecacucurbitae)；所述牡丹白粉病病原菌为瓜类单囊壳白粉菌(sphaerothecacucurbitae)；所述冬青白粉病病原菌为粉状白粉菌(erysiphealphitoides)；所述小麦白粉病病原菌为禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)；所述茄子白粉病病原菌为单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；所述枸杞白粉病病原菌为穆氏节丝壳属(arthrocladiellamougeotii)。所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1的发酵液，可按照如下方法制备：在液体培养基中培养所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1，除去液体培养物(发酵液)中的所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1即得到所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)的发酵液。本发明的有益效果本发明中的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1可以同时对草莓白粉病病原菌、番茄白粉病病原菌、黄瓜白粉病病原菌、西甜瓜白粉病病原菌、西瓜白粉病病原菌、牡丹白粉病病原菌、冬青白粉病病原菌、小麦白粉病病原菌、茄子白粉病病原菌有抑制作用。本发明中的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1可以同对草莓白粉病、番茄白粉病、黄瓜白粉病、西甜瓜白粉病、西瓜白粉病、牡丹白粉病、冬青白粉病、小麦白粉病、茄子白粉病具有抑制作用。对所选择的植物病病害中，病害防控效果都在90％以上。说明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1具有稳定、高效、广谱的抗菌防白粉病性能。生物材料保藏说明分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)；菌株编号：wz1；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年9月21日；保藏中心登记入册编号：cgmccno.16510。附图说明图1为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1在lb培养基上28℃下培养48-72h菌落形态。图2为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1在pda培养基上28℃下培养48-72h菌落形态。图3为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对草莓叶部白粉病抑制效果。图4为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对草莓果实白粉病抑制效果。图5为施用贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1第6天对番茄白粉病抑制效果。图6为施用乙嘧酚(25％悬浮剂)第6天对番茄白粉病抑制效果。图7为空白对照组第6天的番茄白粉病的情况。图8为施用贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1第14天对番茄白粉病抑制效果。图9为施用施用乙嘧酚(25％悬浮剂)第14天对番茄白粉病抑制效果。图10为空白对照组第14天的番茄白粉病的情况。图11为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对黄瓜白粉病抑制效果。图12为所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对小麦白粉病抑制效果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中用到的病原菌，公众可从野外采集或商业购买：草莓白粉病病原菌——羽衣草单囊壳菌(sphaerothecaaphanis)；番茄白粉病病原菌——鞑靼内丝白粉菌(leveillulataurica)；黄瓜白粉病病原菌——单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；西甜瓜白粉病原菌——单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；西瓜白粉病病原菌——瓜类单囊壳白粉菌(sphaerothecacucurbitae)；牡丹白粉病病原菌——瓜类单囊壳白粉菌(sphaerothecacucurbitae)；冬青白粉病病原菌——粉状白粉菌(erysiphealphitoides)；小麦白粉病病原菌——禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)；茄子白粉病病原菌——单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；枸杞白粉病病原菌——穆氏节丝壳属(arthrocladiellamougeotii)。戊唑醇从市场上购得；乙嘧酚由江西禾益化工公司提供。实施例1本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1的分离与菌株鉴定1、样品采集从有中国北方有机果园中，采集桃子。2、菌株的分离筛选及拮抗筛选从有机水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用lb，na，kb和cm0002共4种培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在lb培养基上纯化保存，并以白粉病病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名其为wz1。3、菌株的鉴定对菌株wz1进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《土壤微生物研究原理与方法》(林先贵.土壤微生物研究原理与方法[m]，高等教育出版社，2010)中描述方法进行生理生化和环境耐受性特性的测定。结果表明，菌株wz1的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在lb培养基上不产色素，菌落为白色不透明或菌落颜色微偏黄，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有轻微褶皱，变为乳脂色。菌株wz1的生理生化特征为革兰氏染色阳性；可利用或吸收l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-甘露糖、l-山梨糖、鼠李糖、半乳糖醇、肌醇、d-甘露糖醇、d-山梨糖醇、熊果苷、马栗树皮甙、水杨苷、d-麦芽糖、乳糖、葡糖酸钾、potassium2-ketogluconate、potassium5-ketogluconate、龙胆二糖、淀粉、肝糖、d-棉子糖；不可利用或吸收赤藻糖醇、d-阿拉伯糖、l-木糖、核糖醇、甲基-β-d-吡喃木糖苷、甲基-α-d-吡喃甘露糖苷、n-乙酰基葡萄糖、d-蜜二糖、菊粉、d-松三糖、木糖醇、d-松二糖、d-来苏糖、d-塔格糖、d-岩藻糖、l-岩藻糖、d-阿拉伯糖醇。其中，图1为所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1在lb培养基上28℃下培养48-72h菌落形态。贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1可以在pda培养基上生长，图2为所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1在pda培养基上28℃下培养48-72h菌落形态。菌株wz1的环境耐受性表现为于含有1％-7％(质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10％(质量含量)氯化钠的培养基中生长弱或不可生长，于ph4.5-9.0的培养基中均可正常生长，在ph4.0下生长势弱，ph9.9下不可生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃-80℃下处理15min，仍可正常生长。所述wz1的16srdna序列seqidno.1及全基因组序列no.2所示。通过形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析，菌株wz1为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。实施例2菌株zw1摇床培养条件及发酵菌液温度耐受性将贝莱斯芽孢杆菌zw1在lb液体培养基上，进行摇瓶培养，26-30℃，180-220rpm，培养48小时，培养好的菌液进行离心浓缩，使得菌液终浓度100亿cfu/ml。然后把浓缩的菌液分装至500ml的蓝盖试剂瓶里，盖好，然后分别放置在50℃和60℃下，放置7天和14天后，进行用稀释涂板法进行有效菌统计，结果如下表所示。表2.zw1发酵液分别在60℃、50℃下放置7天和14天后有效菌含量测定结果通过表2的结果可以看出，贝莱斯芽孢杆菌zw1在50℃的环境下具有良好的活性。实施例3贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对防腐剂那他霉素和聚赖氨酸耐受性实验经lb发酵液发酵的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1菌液，通过离心调至有效菌浓度为10亿cuf/ml，然后分成三组，一组作为对照，一组加那他霉素(终含量1％)、一组加聚赖氨酸(终含量5％)，常温下放置，分别在放置后6个月，12个月取样测定贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对那他霉素和聚赖氨酸的耐受性，结果如下表所示。3.贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对食品防腐剂那他霉素(natamycin)、聚赖氨酸具有较强的耐受性**。**采用spss软件，用duncan法进行差异显著性分析。结果表明和对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对那他霉素、聚赖氨酸有很强的耐受性，具体表现为常温下放置6个月和12个月后，和对照相比，在那他霉素和聚赖氨酸存在下，有效菌含量没有发生显著变化。实施例4本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1抑菌谱的测定供试病原菌：草莓白粉病病原菌——羽衣草单囊壳菌(sphaerothecaaphanis)；番茄白粉病病原菌——鞑靼内丝白粉菌(leveillulataurica)；黄瓜白粉病病原菌——单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；西瓜白粉病病原菌——葫芦科白粉菌(sphaerothecacucurbitae)；冬青白粉病病原菌——粉状白粉菌(erysiphealphitoides)；小麦白粉病病原菌——禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)；茄子白粉病病原菌——单丝壳白粉菌(sphaerothecafuliginea)；枸杞白粉病病原菌——穆氏节丝壳属(arthrocladiellamougeotii)。选择上述病原菌为指示真菌，采用叶盘法进行生测。具体操作如下：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1在lb培养基上28℃恒温培养48h。通过离心调至其菌浓度为100亿cfu/ml，并且调节菌浓度为50亿cfu/ml，10亿cfu/ml，2亿cfu/ml，不同浓度分别处理。分别把采集的草莓、番茄、西瓜、黄瓜、牡丹、冬青、小麦、茄子、枸杞叶片先用自来水冲洗干净，然后用75％乙醇消毒30秒，再用无菌水彻底冲洗干净，然后用打孔器，获取直径1.5cm的叶盘。然后，把叶盘放置于铺有一层灭过菌纱布(2-3层)的培养皿中，无菌操作台中，吹4-5分钟，然后把叶盘浸泡于贝莱斯芽孢杆菌发酵液中30-60秒，然后取出叶盘回放置于含有灭菌纱布的培养皿中，叶盘背面向上。无菌操作台中，吹1-2分钟，然后，从4度冰箱中，取出白粉病病菌孢子悬浮液(104cfu/ml)，用移液器，取20ul分别接种于每个叶盘背面，放置5-10分钟，然后防治于相对湿度为70-80％，22度和30度两个温度下，每隔2天交替，生化培养箱中进行培养。以仅接种病原菌的叶盘为对照，每个处理三次重复，培养7-10天，观察白粉病菌叶盘发病情况。根据发病叶盘数占总接种叶盘数的多少，计算发病率，未发病的叶盘数占总接种叶盘数的多少，计算病害抑制率。实验结果见表4，在浓度为2亿cfu/ml的时候，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1对所选择的白粉病的抑制率达到90％及以上。说明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。其中最小的抑菌浓度为2亿cfu/ml。表4.叶盘法生测实验中贝莱斯芽孢杆菌wz1对不同作物白粉病的抑制效果贝莱斯芽孢杆菌菌株wz1在附着叶片和果实表面之后，可以对白粉病菌形成营养竞争、空间位点竞争，并且也对白粉病菌有直接的触杀作用。并且贝莱斯芽孢杆菌菌株wz1在附着叶片和果实表面之后，可以诱导植物产生抗性、也能够促进植物生长增加对白粉病的抵抗力。实施例5本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对草莓白粉病防控的田间应用及田间防控效果验证贝莱斯芽孢杆菌wz1水剂(贝莱斯芽孢杆菌wz1发酵液)防治草莓白粉病对草莓白粉病的防效。其中，贝莱斯芽孢杆菌wz1发酵液的制备方法为：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1在lb培养基上28℃恒温培养48h，得发酵液。通过离心调至贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1浓度为100亿cfu/ml。其中，草莓栽培方式为大棚栽培。试验地选在北京昌平草莓生产基地，草莓面积500亩，试验地点草莓白粉病重度发生。分别设置贝莱斯芽孢杆菌wz1水剂组、乙嘧酚(25％悬浮剂)组和空白对照组。试验设计和安排如下：处理编号药剂施药剂量(毫升/亩)a贝莱斯芽孢杆菌wz1水剂1000b乙嘧酚(25％悬浮剂)75ck空白对照-试验地点位于平地，随机分散在三个地点，做好标记记录。采用常规喷雾，选择在高温高湿交替时出现进行第一次施药，药剂均匀喷洒于番茄叶片正反面及果实表面。喷雾器械选用当地的常规喷雾装置(20l电动喷雾器)。试验于12月20日第一次施药，12月25日第二次施药，12月30日共施药3次。施药当日晴，大棚平均气温25℃，最高气温30℃，最低气温13℃，相对湿度60％-81％。试验地土壤良好，肥力高。在施药后14天后观察番茄叶片白粉病的防治效果。未发现供试药剂试验剂量对其他生物有不良影响。试验结果与分析综合上述试验结果可以看出，贝莱斯芽孢杆菌wz1防治草莓白粉病时，制剂用量为1000毫升/亩，施药后14天防治效果可达到在80％，与制剂对照药剂差异不大，而且防治效果略优于对照药剂。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌wz1具有良好的持效性，可以持续控制草莓白粉病的发生。同时在田间观察到施过贝莱斯芽孢杆菌wz1的草莓的叶片对其他病害的侵染具有一定抵抗作用，表现为被侵染的病斑较少，也侧面说明贝莱斯芽孢杆菌wz1对草莓具有一定诱抗性，可以提高草莓的对病原菌抵抗力，如图3-4所示。实施例6本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对番茄白粉病防控的田间应用及田间防控效果验证贝莱斯芽孢杆菌水剂(wz1发酵液)防治番茄白粉病对番茄白粉病的防效。其中，贝莱斯芽孢杆菌wz1发酵液的制备方法为：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1在lb培养基上28℃恒温培养48h，得发酵液。通过离心调至贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1浓度为100亿cfu/ml。其中，番茄栽培方式为大棚栽培。试验地选在云南省元谋县陈老根基地，番茄面积300亩，试验地点番茄白粉病重度发生。分别设置贝莱斯芽孢杆菌wz1水剂组、乙嘧酚(25％悬浮剂)组和空白对照组。试验设计和安排如下：处理编号药剂施药剂量(毫升/亩)a贝莱斯芽孢杆菌wz1水剂1000b乙嘧酚(25％悬浮剂)75ck空白对照-试验地点位于平地，随机分散在三个地点，做好标记记录。采用常规喷雾，选择在高温高湿交替时出现进行第一次施药，药剂均匀喷洒于番茄叶片正反面及果实表面。喷雾器械选用当地的常规喷雾装置(20l电动喷雾器)。试验于10月25日第一次施药，10月31日第二次施药，共施药2次。施药当日晴，平均气温25℃，最高气温31℃，最低气温13℃，相对湿度81％，东风2级，试验期间为多云天气。试验地土壤良好，肥力高。在施药后6天和14天后观察番茄叶片白粉病的防治效果，结果如图5-10所示。未发现供试药剂试验剂量对其他生物有不良影响。试验结果如下所示：综合上述试验结果可以看出，贝莱斯芽孢杆菌wz1防治番茄白粉病时，制剂用量为1000毫升/亩，施药后14天防治效果可达到在89％，与制剂对照药剂差异不大，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌wz1具有良好的持效性，可以持续控制番茄白粉病的发生。同时在田间观察到施过贝莱斯芽孢杆菌wz1的番茄的叶片对其他病害的侵染具有一定抵抗作用，表现为被侵染的病斑较少。实施例7本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对黄瓜白粉病防控的田间应用及田间防控效果验证贝莱斯芽孢杆菌水剂(wz1发酵液)防治黄瓜白粉病对黄瓜白粉病的防效。其中，贝莱斯芽孢杆菌wz1发酵液的制备方法为：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1在lb培养基上28℃恒温培养48h，得发酵液。通过离心调至贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1浓度为100亿cfu/ml。其中，黄瓜栽培方式为大棚栽培。试验地选在北京大兴千亩园生产基地，黄瓜面积10亩，试验地点黄瓜白粉病常年发生。分别设置贝莱斯芽孢杆菌wz1水剂组、乙嘧酚(25％悬浮剂)组、戊唑醇(4.3％悬浮剂)组和空白对照组。试验设计和安排如下：试验地点位于平地，随机分散在三个地点，做好标记记录。采用常规喷雾，选择在高温高湿交替时出现进行第一次施药，药剂均匀喷洒于番茄叶片正反面及果实表面。喷雾器械选用当地的常规喷雾装置(20l电动喷雾器)。试验于3月20日(黄瓜叶片白粉病发病初期)第一次施药，3月25日第二次施药，共连续施药2次，一周后调查计算防治效果。施药当日晴，大棚平均气温26℃左右，最高气温30℃左右，最低气温15℃左右，相对湿度60％-80％。试验地土壤良好，肥力高。在连续2次施药后7天后观察黄瓜叶片白粉病的防治效果。试验结果与分析综合上述试验结果可以看出，贝莱斯芽孢杆菌wz1防治黄瓜白粉病时，制剂用量为1000毫升/亩，连续2次施药后7天防治效果可达到在88.2％，与制剂对照药剂乙嘧酚差异不大，而且防治效果略优于对照药剂乙嘧酚(防效为86.5％)；与制剂对照药剂戊唑醇，并显著优于化学药剂戊唑醇(防效为76.4％)，如图11所以。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌wz1具有良好的持效性，可以持续控制黄瓜白粉病的发生。同时在田间观察到施过贝莱斯芽孢杆菌wz1的草莓的叶片对其他病害的侵染具有一定抵抗作用，表现为被侵染的病斑较少，也侧面说明贝莱斯芽孢杆菌wz1对黄瓜具有一定诱抗性，可以提高黄瓜对病原菌抵抗力。未发现供试药剂试验剂量对其他生物有不良影响。实施例8本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)wz1对小麦白粉病防控应用及防控效果验证贝莱斯芽孢杆菌水剂(wz1发酵液)防治小麦白粉病的效果。其中，贝莱斯芽孢杆菌水剂(wz1发酵液)的制备方法为：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1在lb培养基上28℃恒温培养48h，得发酵液。通过离心调至贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株wz1浓度为100亿cfu/ml。小麦(品种：中麦175)，栽培方式为盆栽、大棚生长。试验地选在北京大兴青云店农场基地，小麦种植70盆，试验对象采前人工接种模式。试验设计和安排如下：处理编号药剂施药剂量(毫升/亩)a贝莱斯芽孢杆菌wz11000b乙嘧酚(25％悬浮剂)75ck空白对照-试验于大棚温室内进行，随机分散在三个处理，做好标记记录。小麦长至7-8片叶片时，将发病小麦(病原菌培养专用)叶片上24h内产生的白粉病菌新鲜孢子均匀抖落接种于药剂处理过的小麦叶片上，每0.2g孢子平均接种于4盆小麦，做好标记记录。采用常规喷雾，选择在人工接种小麦白粉病病原菌7天后，进行第一次施药，药剂均匀喷洒于小麦叶片正反面。喷雾器械选用当地的常规喷雾装置(20l电动喷雾器)。试验于2018年12月20日第一次施药，2018年12月25日第二次施药，2019年1月2日第三次施药，1月15日第四次施药，共施药4次。实验在温室内进行，室内平均温度17.5℃，平均湿度25.3％，平均二氧化碳浓度627.7ppm，平均光照强度6.7kl，试验地土壤良好，肥力高。在第一次施药前、接种白粉病一周后和接种白粉病四周后观察小麦白粉病的防治效果。实验结果与分析病级划分：根据空白对照发病情况分级调查。采用如下分级方法：0级：无病；1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下；3级：病斑面积占整片叶面积的6％-15％；5级：病斑面积占整片叶面积的16％-25％；7级：病斑面积占整片叶面积的26％-50％；9级：病斑面积占整片叶面积的50％以上。病情指数计算方法如下：ck是空白对照病情指数；pt是药剂处理病情指数。实验结果如下：不同处理小麦植株白粉病发生情况如下：综合上述试验结果可以看出，在防治小麦白粉病时，施药四次后防治效果较为显著：小麦病斑面积显著减少，病情指数显著降低，整体植株比对照组(ck)要高；说明贝莱斯芽孢杆菌水剂(wz1发酵液)对小麦白粉病具有较好的抑制作用，如图12所示，对小麦植株生长也有一定的促生作用。未发现供试药剂试验剂量对其他生物有不良影响：同时在温室中观察到使用贝莱斯芽孢杆菌水剂(wz1发酵液)对其他生物无毒害作用，表现为种植着小麦的盆里有小飞虫，喷了药小飞虫也依然无恙。序列表<110>北京奥沃伽科技有限公司<120>一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用<130>seqlist<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1459<212>dna<213>bacillusvelezensis<400>1ccctttctgtcccaccttcggcggctggctcctaaaggttacctcaccgacttcgggtgt60tacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgg120catgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgat180ccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttc240tgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatcc300ccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaa360ctaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctga420cgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattg480tcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctc540caccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactcccc600aggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttag660cactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgcttt720cgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacat780ctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccc840cagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccg900cctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcg960gctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctat1020ttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcact1080cacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcc1140cgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggcta1200cgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatc1260tgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcagacaaccatccg1320gtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttac1380tcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgactgcatgta1440tagcaagcccgcccacgcg1459当前第1页12