一种厌氧三电极装置及其使用方法与流程

本发明涉及一种厌氧三电极装置及其使用方法，属于微生物电池技术领域。

背景技术：

微生物燃料电池(mfcs)是利用微生物作为生物催化剂，通过生物电化学途径氧化基质并可产生电能的装置，为一种新型的清洁能源。mfcs的广泛利用，可有效解决我国能源紧缺局面，具有重要的现实意义和实践价值。电活性微生物为mfcs废水处理效率和产电性能的重要影响因子，对电活性微生物的产电特性进行详细的研究，可为mfcs的实际应用奠定理论基础。

目前从mfcs中分离的电活性微生物以细菌为主，且兼性厌氧菌和严格厌氧菌居多。然而由于厌氧微生物生长条件苛刻，纯种培养困难，以及研究厌氧微生物的技术和方法进程缓慢，使得人们对厌氧微生物的认识和利用远落后于好氧和兼性厌氧微生物。确保反应器保持严格厌氧环境，为厌氧微生物提供良好的生活环境，为了解厌氧微生物的特性、生理和生化多样性方面提供更好的技术平台。并且通过与其他技术电化学活性分析化学方法联用，更好的表征厌氧微生物的电化学活性及其他特性，从而有效促进mfcs在环境治理及生物能源生产等方面的实际应用。

利用三电极系统研究mfcs的性能及影响因素，可为mfcs的实际应用提供有效的参数。但是，市面上现有的三电极系统存在以下不足：(1)多适用于好氧系统，不适于厌氧系统；(2)总体积较大，使得三电极系统中质子交换膜的面积较大，不具有经济性；(3)需要对微生物进行一定处理后才可进行光学分析，该过程可能会对微生物造成伤害，进而影响对产电微生物的特性研究。由于上述原因，造成mfcs研究进展缓慢。

技术实现要素：

本发明提供了一种厌氧三电极装置及其使用方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种厌氧三电极装置，包括阳极室、阴极室、阳极及阴极，所述阳极室的顶端插入一管状的盐桥，所述盐桥内装有饱和kcl溶液，所述盐桥和所述阳极室的顶端的接触处采用密封塞密封，所述盐桥的顶端伸出所述阳极室的顶端，所述盐桥的顶端的开口中插入标准甘汞电极，所述标准甘汞电极的顶端从所述盐桥的顶端的开口伸出，所述标准甘汞电极与所述盐桥的顶端的开口采用密封塞密封；所述阳极室的侧壁设置第一连接口；

所述阴极室的侧壁设置与所述第一连接口连接的第二连接口，所述第一连接口和所述第二连接口的连接处采用质子交换膜隔开；并用夹子将所述第一连接口和第二连接口夹紧；

所述阳极为导电基底；所述阴极为第二石墨电极；

所述阳极室底部镂空，所述导电基底为平板状并密封所述镂空；

所述第二石墨电极包括第二导电丝和连接在所述第二导电丝底部的第二石墨片，所述第二石墨片伸入到所述阴极室内，所述第二导电丝从所述阴极室的顶端伸出，所述第二导电丝与所述阴极室顶端接触处采用密封塞密封；

所述阳极室的侧面均设有第一出气口、第一取样口及第一进气口，所述第一出气口、所述第一取样口及所述第一进气口均采用密封塞密封；所述阴极室的侧面设有第二出气口、第二取样口及第二进气口，所述第二出气口、所述第二取样口及所述第二进气口均采用密封塞密封；

所述阳极室和所述阴极室内均装有厌氧培养基并接种具有胞外电子转移能力的厌氧菌。

作为进一步改进地，所述导电基底的面积大于所述镂空的面积。

作为进一步改进地，所述导电基板为ito导电基，所述导电基底透明且表面镀有纳米金镀层。

作为进一步改进地，所述第一进气口与所述第一取样口重合。

作为进一步改进地，所述第二导电丝的电阻小于10ω。

作为进一步改进地，所述阳极室和阴极室的体积为35ml。

本发明还提供一种厌氧三电极装置，包括阳极室、阴极室、阳极及阴极，所述阳极室的顶端插入一管状的盐桥，所述盐桥内装有饱和kcl溶液，所述盐桥和所述阳极室的顶端的接触处采用密封塞密封，所述盐桥的顶端伸出所述阳极室的顶端，所述盐桥的顶端的开口中插入标准甘汞电极，所述标准甘汞电极的顶端从所述盐桥的顶端的开口伸出，所述标准甘汞电极与所述盐桥的顶端的开口采用密封塞密封；所述阳极室的侧壁设置第一连接口；

所述阴极室的侧壁设置与所述第一连接口密封连接的第二连接口，所述第一连接口和所述第二连接口的连接处采用质子交换膜隔开；

所述阳极为第一石墨电极；所述阴极为第二石墨电极；

所述第一石墨电极包括第一导电丝和连接在所述第一导电丝底部的第一石墨片，所述第一石墨片伸入到所述阳极室内，所述第一导电丝从所述阳极室的顶端伸出，所述第一导电丝与所述阳极室顶端接触处采用密封塞密封；

所述第二石墨电极包括第二导电丝和连接在所述第二导电丝底部的第二石墨片，所述第二石墨片伸入到所述阴极室内，所述第二导电丝从所述阴极室的顶端伸出，所述第二导电丝与所述阴极室顶端接触处采用密封塞密封；

所述阳极室的侧面均设有第一出气口、第一取样口及第一进气口，所述第一出气口、所述第一取样口及所述第一进气口均采用密封塞密封；所述阴极室的侧面设有第二出气口、第二取样口及第二进气口，所述第二出气口、所述第二取样口及所述第二进气口均采用密封塞密封；

所述阳极室和所述阴极室内均装有厌氧培养基并接种具有胞外电子转移能力的厌氧菌。

作为进一步改进地，所述第一进气口与所述第一取样口重合。

作为进一步改进地，第一导电丝和所述第二导电丝的电阻均小于10ω。

本发明还提供一种上述的厌氧三电极装置的使用方法，包括以下步骤：

s1，将所述厌氧三电极装置灭菌，通入无氧n2:co2混合气体连续曝气；

s2，向所述阳极室和所述阴极室中装入厌氧培养基，厌氧培养基没过述石墨板，向厌氧培养基中接种厌氧菌进行培养，在培养过程中通入无氧n2:co2混合气体连续气流；

s3，将电化学工作站的参比电极连接所述厌氧三电极装置的标准甘汞电极，工作电极与所述厌氧三电极装置的阳极相连，对电极与所述厌氧三电极装置的阴极相连，进行电化学表征。

本发明的有益效果是：

本发明的厌氧三电极装置是一种新的实验装置，可集厌氧培养和性能测试功能于一身，可有效培养厌氧微生物，以及无损、原位地表征厌氧微生物群落电化学活性及其他特性，填补了现有技术的空白。双室厌氧三电极系统便于分别对阳极、质子交换膜(或分隔材料)和阴极进行研究。高导电率及光透过率的导电材料的ito，具有较高的灵敏度和快速的电流响应以及便于进行原位光化学分析的优点。石墨板由于其高导电性、易于微生物生长及造价相对便宜。该装置具有结构简单、灵活性大、耐久度高、对生物群落没有伤害等优点，对于研究厌氧微生物群落电化学活性及其他特性以及mfcs产电性能具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例1提供的厌氧三电极装置结构示意图。

图2是本发明实施例2提供的厌氧三电极装置结构示意图。

图3本发明的厌氧三电极装置与恒位电压仪联用测试到的厌氧微生物群落的电化学特性。a为g.sulfurreducenspca及其突变株在+0.24v（vs.she）电压条件下的i-t图；b为g.sulfurreducenspca及其突变株在-0.1v（vs.she）电压条件下的i-t图；c为周转条件下循环伏安特性曲线图；d为非周转条件下循环伏安特性曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

实施例1

参照图1所示，一种厌氧三电极装置，包括阳极室、阴极室、阳极及阴极，所述阳极室的顶端插入一管状的盐桥，所述盐桥内装有饱和kcl溶液，所述盐桥和所述阳极室的顶端的接触处采用密封塞密封，所述盐桥的顶端伸出所述阳极室的顶端，所述盐桥的顶端的开口中插入标准甘汞电极，所述标准甘汞电极的顶端从所述盐桥的顶端的开口伸出，所述标准甘汞电极与所述盐桥的顶端的开口采用密封塞密封；所述阳极室的侧壁设置第一连接口。

所述阴极室的侧壁设置与所述第一连接口连接的第二连接口，所述第一连接口和所述第二连接口的连接处采用质子交换膜隔开。第一连接口和第二连接口处有夹子夹住，避免漏液。所述第一连接口和第二连接口的面积小，使得使用的质子交换膜的面积小，具有经济性。所述阳极室和阴极室通过小面积的质子交换膜接触，没有大面积的接触，避免对测试时阳极和阴极相互干扰。

所述阳极为导电基底；所述阴极为第二石墨电极。

所述阳极室底部镂空，所述导电基底为平板状并密封所述镂空。

所述第二石墨电极包括第二导电丝和连接在所述第二导电丝底部的第二石墨片，所述第二石墨片伸入到所述阴极室内，所述第二导电丝从所述阴极室的顶端伸出，所述第二导电丝与所述阴极室顶端接触处采用密封塞密封。

所述阳极室的侧面均设有第一出气口、第一取样口及第一进气口，所述第一出气口、所述第一取样口及所述第一进气口均采用密封塞密封；所述阴极室的侧面设有第二出气口、第二取样口及第二进气口，所述第二出气口、所述第二取样口及所述第二进气口均采用密封塞密封。此装置非常方便取样和进气。

所述阳极室和所述阴极室内均装有厌氧培养基并接种具有胞外电子转移能力的厌氧菌。厌氧菌可以生长在导电基底上与工作电极进行电子传递，不需要对微生物进行一定处理后就可进行电学分析，该过程可能会对微生物不会造成伤害，利于对产电微生物的特性研究，灵敏度和精确度高，不同批次实验重复性好。

所述导电基底的面积大于所述镂空的面积，方便测试仪器的工作电极连接在导电基底上。

所述导电基板为ito导电基，所述导电基底透明且表面镀有纳米金镀层。

所述第一进气口与所述第一取样口重合。一孔两用，避免制造多个孔，节约制造成本。

所述第二导电丝的电阻小于10ω。

所述阳极室和阴极室的体积为35ml。

所用密封塞为厌氧丁基橡胶塞。

本厌氧三电极装置要保证密封，适宜厌氧菌生长。

实施例2

本发明还提供一种厌氧三电极装置，包括阳极室、阴极室、阳极及阴极，所述阳极室的顶端插入一管状的盐桥，所述盐桥内装有饱和kcl溶液，所述盐桥和所述阳极室的顶端的接触处采用密封塞密封，所述盐桥的顶端伸出所述阳极室的顶端，所述盐桥的顶端的开口中插入标准甘汞电极，所述标准甘汞电极的顶端从所述盐桥的顶端的开口伸出，所述标准甘汞电极与所述盐桥的顶端的开口采用密封塞密封；所述阳极室的侧壁设置第一连接口。

所述阴极室的侧壁设置与所述第一连接口连接的第二连接口，所述第一连接口和所述第二连接口的连接处采用质子交换膜隔开。所述第一连接口和第二连接口处有夹子夹住，避免漏液。所述第一连接口和第二连接口的面积小，使得使用的质子交换膜的面积小，具有经济性。所述阳极室和阴极室通过小面积的质子交换膜接触，没有大面积的接触，避免对测试时阳极和阴极相互干扰。

所述阳极为第一石墨电极；所述阴极为第二石墨电极。

所述第一石墨电极包括第一导电丝和连接在所述第一导电丝底部的第一石墨片，所述第一石墨片伸入到所述阳极室内，所述第一导电丝从所述阳极室的顶端伸出，所述第一导电丝与所述阳极室顶端接触处采用密封塞密封；所述第一石墨片上可以生长厌氧菌，与工作电极进行电子传递，不需要对微生物进行一定处理后就可进行电学分析，该过程可能会对微生物不会造成伤害，利于对产电微生物的特性研究，灵敏度和精确度高，不同批次实验重复性好。

所述第二石墨电极包括第二导电丝和连接在所述第二导电丝底部的第二石墨片，所述第二石墨片伸入到所述阴极室内，所述第二导电丝从所述阴极室的顶端伸出，所述第二导电丝与所述阴极室顶端接触处采用密封塞密封。

所述阳极室的侧面均设有第一出气口、第一取样口及第一进气口，所述第一出气口、所述第一取样口及所述第一进气口均采用密封塞密封；所述阴极室的侧面设有第二出气口、第二取样口及第二进气口，所述第二出气口、所述第二取样口及所述第二进气口均采用密封塞密封。

所述阳极室和所述阴极室内均装有厌氧培养基并接种具有胞外电子转移能力的厌氧菌。

所述第一进气口与所述第一取样口重合。

第一导电丝和所述第二导电丝的电阻均小于10ω。

所述阳极室和阴极室的体积为35ml。

所用密封塞为厌氧丁基橡胶塞。

本厌氧三电极装置要保证密封，适宜厌氧菌生长。

实施例3表征厌氧微生物群落的产电能力

(1)g.sulfurreducenspca及其突变株在nbaf培养基质中培养至对数增长期或稳定期。g.sulfurreducenspca购自美国模式培养物集存库，保藏编号为atcc-51573，通过基因突变技术构建pca突变株。

所述nbaf培养基的配方为：每升含0.38gkcl,0.2gnh4cl,0.069gnah2po4·h2o,0.04gcacl2·2h2o,0.2gmgso4·7h2o,10ml矿物质混合物[每升含0.1gmncl2·4h2o,0.3gfeso4·7h2o,0.17gcocl2·6h2o,0.1gzncl2,0.04gcuso4·5h2o,0.005galk(so4)2·12h2o,0.005gh3bo3,0.09gna2moo4,0.12gnicl2,0.02gnawo4·2h2o,0.10gna2seo4]，以及20mm乙酸为电子供体，40mm富马酸为电子受体。

(2)质子交换膜的处理：去离子水浸泡质子交换膜2h，以保证质子交换膜润湿充分；将质子交换膜放入10％h2o2中，100℃水浴加热1h，去除表面存在的杂质，取出后用去离子水清洗3次；将质子交换膜放入0.5mh2so4溶液中，85℃煮沸1h，去除表面杂质金属离子，取出后用去离子水清洗3次，放在去离子水中保存备用。

(3)电极的处理；用1500目干/湿砂纸对石墨板表面进行抛光，抛光后的电极经超声波处理以去除碎片，在1nhcl中浸泡过夜以去除金属和其他污染物，用丙酮和去离子水清洗两次以去除有机物，并在去离子水中储存。每次试验结束后，用1nnaoh清洗，以去除生物量，并按照上述步骤对整个表面进行清洗。

(4)按照实施例图1组装厌氧三电极系统。即用硅胶将金纳米颗粒修饰的ito导电基底与底部镂空的阳极室接合，导电基底的面积大于镂空底部面积。出气口及进气口塞入厌氧橡胶塞。将含去离子水的盐桥穿过厌氧橡胶塞，置于阳极室。将石墨板与钛丝相连，用万用表测石墨板与钛丝之间的电阻(不得超过10ω)后，将钛丝穿过厌氧塞，置于阴极室。阳极室和阴极室之间用质子交换膜隔开，并用夹子夹紧，避免漏液。

(5)对步骤(4)所得的厌氧三电极装置灭菌。灭菌后的阳极室加入含乙酸电解液，阴极室加入不含乙酸电解液，通入无氧n2:co2(80％:20％[v:v])连续气流曝气。将盐桥中的去离子水吸出，并加入饱和kcl溶液。用封口膜将盐桥与标准甘汞电极连接。

(6)通过恒电位仪运行实验室软件ec对所述厌氧三电极装置进行控制。标准甘汞电极与参比电极相连，ito导电基底与工作电极相连，阴极与对电极相连。生物反应器在+0.24v或-0.1v之间保持平衡。所述工作电极为玻碳、铂、石墨板、碳毡、碳布电极中的至少一种；对电极为玻碳、铂、石墨板、碳毡、碳布电极中的至少一种；参比电极为hg/hgo电极、ag/agcl电极、氢标准电极、标准甘汞电极中的其中一种。

(7)在实验过程中，保持在30℃，并通入无氧n2:co2(80％:20％[v:v])连续气流。

(8)在步骤(6)装置中，待厌氧三电极系统电流稳定后，将g.sulfurreducenspca或其突变株按体积比为50％：50％(v：v)注入所述厌氧三电极装置的阳极室。接种为生长对数期或成熟期的od600为0.3～0.6的菌液。

实施例4

将装置设置成图2的样子，采用电化学(循环伏安法)表征方法，使用chi660电化学工作站(上海辰华仪器，中国)，工作电极接阳极，阴极接对电极。在相对于饱和甘汞参比电极-0.55v到+0.245v的范围内，以1mv/s的扫速在周转状态下(体系中存留足量电子供体)进行循环伏安法的电化学扫描。在进行非周转状态循环伏安法前24h，用不含乙酸盐介质代替电极介质，以电极作为受体，耗尽可用供体。其他同实施3。

由图3-a和图3-b可知，不同的电极电势条件下，厌氧微生物群落野生型pca及其突变株的产电能力有所不同。该结果与已发表的实验报道(参考文献[1])中同种菌株产电能力一致。图3-c和图3-d可知显示野生型pca及其突变株在相同的生长条件下，而呈现出不同的氧化还原峰。

综上所述，本发明装置提供了一种有效培养厌氧微生物以及原位表征厌氧微生物群落电化学活性和其他特性的平台，便于人们进一步研究难于培养和研究的厌氧微生物群落。该装置将培养装置与测试装置有效结合，两个步骤可以在一个装置中执行，避免了在测试取样阶段可能会对生物群落造成的损伤，实现原位测试厌氧微生物群落性能。系统的相对简单性使得它们更易于以模块化方式进行修改和改进。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献：

[1]levarce,hoffmancl,dunsheeaj,etal.redoxpotentialasamastervariablecontrollingpathwaysofmetalreductionbygeobactersulfurreducens[j].theismejournal,2017,11(3):741-752.