瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用的制作方法

本发明涉及类风湿关节炎治疗技术领域，具体涉及瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用。

背景技术：

类风湿关节炎是一种以慢性进行性关节病变为主的全身性自身免疫病。病变主要累积全身多个关节，呈多发性和对称性慢性滑膜炎，进而引起软骨和骨质的破坏，严重者可导致关节畸形，甚至残疾。类风湿关节炎是造成劳动力丧失与致残的主要疾病之一。

类风湿关节炎的病因尚未明确，普遍认为，遗传因素在类风湿关节炎的发病机制中发挥重要作用。近年来对类风湿关节炎发病机制的研究显示，自身抗原驱动的T细胞激活是类风湿关节炎发病及病情演变的基础。抗原多肽通过体内的抗原提呈细胞识别与提呈，进而被抗原特异性T细胞表面T细胞受体(TCR)识别，形成MHC-抗原肽-TCR三分子复合物，激活抗原特异性T及B细胞，导致炎性细胞因子、免疫球蛋白等产生增多，引起滑膜炎症、血管翳形成，导致软骨及骨质破坏等类风湿关节炎的特征性病理性变化。

目前，尚无从根本上控制类风湿关节炎的药物。临床上主要应用改善病情抗风湿药物和生物制剂来减轻症状，抑制炎症，延缓关节损害和改善患者的功能。近年来，生物制剂和小分子靶向药物的应用，使类风湿关节炎患者的治疗有了更多的选择，缓解率也有进一步的提高。尽管如此，依旧有部分患者治疗效果不佳。生物制剂和小分子靶向药物价格昂贵，给患者和社会带来了巨大的经济负担。而且，这些药物并非作用于发病的起始环节，难以针对性地控制病变。而且，其骨髓抑制、肝功能损害、增加感染风险等不良反应较多，导致很多患者不能耐受这些药物的治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用，所述瓜氨酸化抗原修饰肽与类风湿关节炎相关的HLA-DRB1特异性结合，抑制抗原肽与HLA-DRB1的结合，从而使T细胞的激活受到抑制，达到治疗类风湿关节炎的目的。

本发明提供了瓜氨酸化抗原修饰肽，所述瓜氨酸化抗原修饰肽具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

优选的，在所述瓜氨酸化抗原修饰肽的氮端连接豆蔻酸。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备防治类风湿关节炎药物中的应用。

优选的，所述药物还包括瓜氨酸化抗原修饰肽在药学上可接受的药用载体或佐剂。

优选的，所述药物的剂型包括片剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、粉剂或溶液剂。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制T细胞对抗原识别的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制T细胞对抗原识别引起的自身免疫反应的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备阻断T细胞和抗原肽结合的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制HLA-DRB1分子的功能的药物中的应用。

本发明提供了瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用，所述瓜氨酸化抗原修饰肽具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，所述瓜氨酸化抗原修饰肽与类风湿关节炎相关的HLA-DRB1特异性结合，抑制抗原肽与HLA-DRB1的结合，从而使T细胞的激活收到抑制，达到治疗类风湿关节炎的目的。

附图说明

图1为瓜氨酸化抗原修饰肽筛选；

图2为aVP3和aVP5对类风湿关节炎患者PBMC分泌IL-6影响的进一步验证；

图3为aVP3和aVP5鼻黏膜给药对实验性关节炎的抑制作用；

图4为aVP3和aVP5通过抑制Tfh抑制实验性关节炎的发展。

具体实施方式

本发明提供了瓜氨酸化抗原修饰肽，所述瓜氨酸化抗原修饰肽具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具体序列如下：

SEQ ID No.1：SAVAL-Cit-SSVPGVR；

SEQ ID No.2：SAVRL-Cit-RSVPGVR。

在本发明中，所述瓜氨酸化抗原修饰肽的设计思路为：

1.瓜氨酸化抗原修饰肽与HLA的相互作用能力增强或者不变，至少不能明显减弱；

2.瓜氨酸化抗原修饰肽与可以识别HLA-DRB1*04:01的TCR相互作用能力明显减弱。

所述瓜氨酸化抗原修饰肽在体内与HLA-DRB1*04:01结合，但是却不能引起相应的自身反应性T细胞的活化，从而减轻类风湿关节炎的病症甚至达到治愈的效果。

在本发明中，所述瓜氨酸化抗原修饰肽由中肽生化有限公司和北京赛百盛基因技术有限公司以固相合成法合成、高效液相层析法纯化得到。

本发明优选在所述瓜氨酸化抗原修饰肽的氮端连接豆蔻酸，具体序列如下所示：

SEQ ID No.3：Myr-SAVAL-Cit-SSVPGVR；

SEQ ID No.4：Myr-SAVRL-Cit-RSVPGVR。

本发明在所述瓜氨酸化抗原修饰肽的氮端连接豆蔻酸，所述豆蔻酸不仅增加了多肽的水溶性和稳定性，还能促进多肽向细胞内的转运和提呈。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备防治类风湿关节炎药物中的应用。

在本发明中，所述药物还优选包括瓜氨酸化抗原修饰肽在药学上可接受的药用载体或佐剂。本发明对所述药用载体和佐剂的种类没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、粉剂或溶液剂。本发明对上述药物的剂型的制备方法没有特殊限定，采用剂型的常规制备方法即可。本发明对所述瓜氨酸化抗原修饰肽在剂型中的含量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的含量即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制HLA-DRB1分子的表达的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制T细胞对抗原识别的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制T细胞对抗原识别引起的自身免疫反应的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备阻断T细胞和抗原肽结合的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的瓜氨酸化抗原修饰肽在制备抑制HLA-DRB1分子的功能的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

瓜氨酸化抗原修饰肽的筛选，共设计12条瓜氨酸化抗原修饰肽，分别为：

aVP1(SEQ ID No.6：SAVEL-Cit-SSVPGVR)；

aVP2(SEQ ID No.7：SAVDL-Cit-SSVPGVR)；

aVP3(SEQ ID No.3)；

aVP4(SEQ ID No.8：SAVGL-Cit-SSVPGVR)；

aVP5(SEQ ID No.4)；

aVP6(SEQ ID No.9：SAVRL-Cit-FSVPGVR)；

aVP7(SEQ ID No.10：SAVRL-Cit-SSVEGVR)；

aVP8(SEQ ID No.11：SAVRL-Cit-SSVKGVR)；

aVP9(SEQ ID No.12：SAVRL-Cit-SSVWGVR)；

aVP10(SEQ ID No.13：SAVEL-Cit-WSVPGVR)；

aVP11(SEQ ID No.14：SAVDL-Cit-SSVRGVR)；

aVP12(SEQ ID No.15：SAVAL-Cit-KSVFGVR)；

原型肽(SEQ ID No.16：SAVRL-Cit-SSVPGVR)。

根据图1可知，在原型肽的刺激下，类风湿关节炎患者外周血PBMC产生IL-6水平升高。而在aVP2，aVP3，aVP4，aVP5和aVP6变构肽刺激下，IL-6水平明显下降，尤以aVP3和aVP5肽更为明显。

瓜氨酸化抗原修饰肽aVP3(SEQ ID No.3)和aVP5(SEQ ID No.4)，同时合成波形蛋白66-78原型肽(在SEQ ID No.16序列的氮端连接豆蔻酸)(wildvimentinpeptide，wVP)。上述多肽由中肽生化有限公司和北京赛百盛基因技术有限公司以固相合成法合成、高效液相层析法纯化。为利于肽向细胞内转运，在瓜氨酸化抗原修饰肽和原型肽的N端均连接豆蔻酸，如表1所示。质谱分析结果显示多肽的序列正确，纯度在95％以上。

表1合成多肽及其序列

其中，Myr为豆蔻酸，S为丝氨酸，A为丙氨酸，V为缬氨酸，R为精氨酸，L为亮氨酸，Cit为瓜氨酸，P为脯氨酸，G为甘氨酸。

实施例2

瓜氨酸化抗原修饰肽在类风湿关节炎患者外周血T细胞中的低反应性。

在本发明的实施方案中，研究了类风湿关节炎患者外周血T细胞对aVP3和aVP5两条瓜氨酸化抗原修饰肽的反应性，检测了变构肽刺激下炎性细胞因子IL-6的产生水平的变化。

从4mL的每位患者的血液开始，将血液加入至15mL的离心管中的4mL Ficoll-Paque PLUS中，所述离心管以1200rpm离心30分钟。提取相应的单个核细胞(PBMC)层。随后，细胞用15mL 1×PBS洗涤两次，并在每次洗涤后将它们在1200rpm下离心。最后，将细胞沉淀重悬浮于含有10％胎牛血清及青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mM L-谷氨酰胺(全部从Gibco BRL获得)的RPMI1640中。

将获得的PBMC以2×10⁵个细胞/孔的数目接种在96孔圆板(Costar)中。随后，加入浓度为30μg/mL的瓜氨酸化抗原修饰肽。10μg/ml植物凝集素(PHA)用作细胞刺激的阳性对照，而单独的RPMI1640用作基底细胞生长的对照。每个孔的培养体系为200μL。

将细胞培养120小时，随后取出每孔的上清液，通过使用特异性ELISA试剂盒(达科为)来测定细胞因子IL-6的浓度。

同时取200μl患者全血，通过使用血液DNA提取试剂盒(天根)，提取DNA，送至北京思尔成生物技术有限公司检测其HLA-DRB1分型。

RA患者的PBMC中由各个肽段调控的IL-6水平显示于图2中。如在图2中观察到的，特别是在含有共享表位的类风湿关节炎患者中，与wVP肽相比，aVP3和aVP5肽均能显著地降低IL-6的水平。IL-6为类风湿关节炎炎症过程中至关重要的细胞因子之一，因而该肽是治疗该疾病的潜在治疗候选物。

实施例3

在牛II型胶原(CII)诱导的关节炎动物模型中，评价aVP3和aVP5变构肽的治疗效果。

在本实施例中，除wVP、aVP3和aVP5外，还增加了无关肽(iP)。无关肽的肽段为wVP的逆序列Myr-RVGPVSS-Cit-LRVAS(SEQ ID No.5)。

本发明中的实验性关节炎模型采用了国际公认的胶原性关节炎(CIA)模型。实验动物为近交系DBA/1小鼠。本实验用小鼠来自北京华阜康生物科技股份有限公司。小鼠均在北京大学人民医院动物实验中心(SPF级)饲养。所有实验用小鼠均为6～8周龄雄性小鼠。实验中涉及动物的全部程序均按我国实验动物管理条例进行。

从Sigma公司购得牛II型胶原，用无水冰醋酸溶解配成3mg/ml的溶液，再用等体积的弗氏完全佐剂(Sigma)乳化，在每只小鼠的尾根部皮内注射100μl乳化物，CII的注射剂量为150μg/只。21天后，同样的方法将无水冰醋酸溶解配成的3mg/ml牛II型胶原与等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma)乳化，在每只小鼠的尾根部皮内注射50μl乳化物，CII的注射剂量为75μg/只。本实验成功建立了DBA/1小鼠的关节炎模型。

在第二次免疫后每天观察小鼠踝关节和趾间关节的肿胀情况。用0～16分的记分等级评估关节炎。对四只足爪的每只按0～4分记分，其中1～2个足趾肿胀记1分，3个或3个以上足趾肿胀记2分，足掌及踝关节肿胀各记1分。发病关节的关节评分相加，最高分为16分。

第二次免疫后每天观察小鼠是否发病。将发病的小鼠随机分为5组，每组8～10只。于发病当天开始分别给予变构肽、原型肽、无关肽和水鼻滴入治疗。变构肽、原型肽和无关肽的剂量为10μl/次(多肽溶于水中，浓度为2.5mg/ml)，每天1次，连续给药15天。对照组每次给予鼻滴入水10μl。每天观察小鼠，并用前述的关节炎评估方法对发生关节炎的关节数目作关节炎评分。

发病28天后处死小鼠，取引流淋巴结，轻柔研磨成细胞悬液，过滤后取1×10⁶(100μl)加入流式管中，加入流式抗体FVD-eFluor5060.1μl，室温避光孵育20分钟。加入PBS 1ml，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清后每管加入下列流式抗体：CD4-eFluor4501μl、CD8-APC-EF7801μl、CD25-PE-Cy71μl，4度孵育30分钟。加入PBS 1ml，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清后每管加入1ml破膜液(浓缩液:稀释液＝1:3)，室温，避光处理30分钟。加入2倍体积以上的1×破膜液洗液，1500rpm离心5分钟。弃上清后加入Foxp3-PE-eFluor6102μl，室温避光孵育1个小时。加入PBS1ml，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清后加入200ul PBS重悬。

另取1×10⁶(100μl)加入流式管中，加入纯化的大鼠抗小鼠CXCR5纯化抗体3ul，4度孵育1个小时。每管加入PBS 1ml，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清后加入biotin连接的抗大鼠IgG 2μl，4度孵育30分钟。加入PBS1ml，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清后加入下列抗小鼠流式抗体：SA-APC 1μl、CD3-PEcy72μl、CD4-Percp Cy5.52μl、CD8-FITC 2μl、CD44-APC Cy72μl和PD-1-PE 2μl，4度避光孵育30分钟。加入PBS 1ml，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清后每管加入200μl PBS重悬。

实验所用流式抗体及破膜液均来自eBioscience。

上机检测CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD44+PD-1+CXCR5+Tfh细胞。

用牛CII对52只雄性DBA/1小鼠进行关节炎的诱导，结果45只小鼠于第二次免疫后的1～3周内出现不同程度的关节肿胀。在出现关节炎的当天，将小鼠随机地分为5组，分别给予修饰肽、原型肽、无关肽和水鼻滴入治疗，并用前述的关节炎评估方法对发生关节炎的关节数目评分。

结果显示，各组小鼠的发病时间和治疗前关节炎评分无显著差异。aVP5肽治疗组于治疗1周后关节评分趋于平稳，而其他组小鼠，特别是无关肽组，关节肿胀逐渐加重(图3)。实验后淋巴结细胞流式检测分析可见与水组相比，修饰肽组的Tfh降低(图4)。而Tfh与B细胞产生抗体有关。这些结果表明，瓜氨酸化抗原修饰肽鼻黏膜给药治疗可减轻CIA小鼠的自身免疫性炎症，降低辅助B细胞产生抗体的Tfh细胞，抑制关节炎的程度。该多肽鼻黏膜给药对类风湿关节炎有治疗作用。

由以上实施例可以得知，瓜氨酸化抗原修饰肽与类风湿关节炎相关的HLA-DRB1特异性结合，抑制抗原肽与HLA-DRB1的结合，从而使T细胞的激活受到抑制，达到治疗类风湿关节炎的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学人民医院（北京大学第二临床医学院）

北京大学

<120> 瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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